Summary
Hemos desarrollado un protocolo sencillo y eficaz para la preparación de grandes cantidades de protoplastos de soja para el estudio de complejos mecanismos de regulación y señalización en células vivas.
Abstract
Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una especie de cultivo importante y se ha convertido en un modelo de leguminosas para los estudios de vías genéticas y bioquímicas. Por lo tanto, es importante establecer un sistema de expresión eficaz de genes transitorios en soja. Aquí, Divulgamos un protocolo simple para la preparación de protoplastos de soja y su aplicación para el análisis funcionales transitorios. Hemos encontrado que jóvenes unifolioladas hojas de plántulas de soja resultaron en grandes cantidades de protoplastos de alta calidad. Mediante la optimización de un método de transformación mediada por PEG-calcio, logramos eficiencia alta transformación mediante protoplastos unifolioladas soja. Este sistema proporciona un modelo eficiente y versátil para el examen de mecanismos complejos de regulación y señalización en células de soya vivo y puede ayudar a mejor entender diversos procesos celulares, fisiológicos y de desarrollo de las leguminosas.
Introduction
Protoplastos son células vegetales que han quitado las paredes celulares. Como sostienen la mayoría de características y actividades de las células vegetales, protoplastos son un buen modelo de sistema para observar y evaluar diversos eventos celulares y son herramientas valiosas para el estudio de hibridación somática1 y2de la regeneración de la planta. Protoplastos han sido también ampliamente utilizados para planta transformación3,4,5, ya que las paredes celulares lo contrario bloquearía el paso de DNA en la célula. Protoplastos poseen algunas de las respuestas fisiológicas y los procesos celulares de las plantas intactas, ofreciendo por lo tanto, valor fundamental en la investigación básica para el estudio de proteína subcelular localización6,7,8, de9,de las interacciones proteína-proteína10y promotor actividad11,12,13 en viven las células.
El aislamiento de protoplastos de plantas primero fue divulgado en 196014 y los protocolos de aislamiento y transformación de protoplastos se han desarrollado y optimizado. Un procedimiento estándar de aislamiento protoplasto implica el corte de hojas y digestión enzimática de las paredes celulares, seguido por separación de protoplastos liberados de restos de tejido no-digerido. Estrategias de transformación incluye electroporación15,16, microinyección17,18y polietilenglicol (PEG)4,5,19 métodos basados. Una amplia gama de especies se han divulgado éxito para el aislamiento del protoplasto, incluyendo cítricos20, Brassica21, Solanaceae22 y otras plantas ornamentales familias23,24. Tipos de tejidos diversos se utilizan en varias especies, un sistema de expresión transitoria en el protoplasto de mesófilo de Arabidopsis (TEAMP) aislado de hojas de la planta modelo Arabidopsis thaliana ha sido bien establecida25 y ampliamente adoptado para diversas aplicaciones.
Soja (Glycine max (L.) Merr.) es una de las más importantes proteínas y aceite de cultivos de26. A diferencia de Arabidopsis y arroz, obtención de plantas transgénicas de soja se sabe para ser algo difícil y baja eficiencia. Tumefaciens de la agrobacteria-mediada por la infiltración ha sido popularmente utilizada para estudios de expresión transitoria del gen en las células epidérmicas en tabaco27 y plántulas de Arabidopsis28,29, mientras que Agrobacterium rhizogenes ha sido utilizado para la transformación de las raíces pilosas en soja30. Enfoques de silenciamiento génico inducido por virus han sido utilizados para la desregulación de los genes del blanco31,expresión32 y transitorio33 de manera sistémica. Protoplastos proporcionan una alternativa versátil y valiosa a estos enfoques. Protoplastos pueden obtenerse materiales sobre tierra de soja y permiten la expresión del transgen rápida y sincronizada. Sin embargo, desde el éxito inicial aislamiento de protoplastos de soja en el 198334, ha habido informes limitados en el uso de protoplastos en soja35,36,37, 38, principalmente debido a la relativamente baja producción de protoplastos de soja.
Aquí, describimos un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento de protoplastos de soja y su aplicación para estudios de expresión génica transitoria. Utilizando hojas unifolioladas jóvenes de plántulas de soja, hemos sido capaces de obtener grandes cantidades de protoplastos vitales dentro de unas horas. Además, hemos optimizado un método de transformación mediada por PEG-calcio que es simple y de bajo costo para entregar ADN en protoplastos de soja con alta eficiencia.
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Protocol
1. crecimiento de las plantas
- Sembrar semillas de soja de 5-10 (Williams 82) en una maceta de 13 cm en el invernadero bajo condiciones de día largo (16 h de luz en 1.500 μmol m-2 s-1) a 25 ° C en la mezcla de suelo personalizados para soja (el 1: relación 1:1 de arena de tierra, perlita y torpedo).
2. preparación de plásmido ADN
- Utilizando una pipeta estéril o palillo de dientes, elige una sola Colonia o stock de glicerol congelados de e.coli con el plásmido que contiene el gen de interés e inocular en medio líquido de 20 mL Luria-Bertani (LB) con los antibióticos apropiados en un matraz de 50 mL.
- Incube el frasco a 37 ° C durante la noche en un agitador. Recoger las bacterias por centrifugación de la suspensión a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos y descartar el sobrenadante. Extraer y purificar el plásmido siguiendo el procedimiento del fabricante de un kit de preparación de plásmido.
3. aislamiento protoplasto
- Cortar hojas unifolioladas recientemente ampliadas de plántulas de soja 10 - viejo (figura 1).
Nota: Selección de hojas en una etapa de desarrollo apropiada es la clave del éxito para la preparación del protoplasto de soja. Utilice únicamente hojas sólo ampliados en las primeras etapas del desarrollo. Las hojas maduras, paredes celulares convertido en más difícil de digerir. - Con una cuchilla de afeitar nueva, retire la nervadura central de las hojas unifolioladas y luego corte los restos en 0.5-1 mm tiras.
Nota: Dos hojas unifolioladas digeridos en 10 mL de solución de enzima dará suficientes protoplastos para transformaciones más de 10. - Con un par de pinzas, transferencia de la hoja las tiras inmediatamente y con cuidado en 10 mL de solución recién preparada de la enzima (tabla 1) en un tubo de 15 mL. Vacío infiltra la hoja tiras durante 15 min a temperatura ambiente.
- Incube las tiras de la hoja en la solución de enzima con agitación suave (40 rpm) bajo condiciones de poca luz para 4-6 h a temperatura ambiente. Asegúrese de que la solución de enzima convierte amarillo-verde protoplastos son liberados. Comprobar la solución de enzima/protoplastos bajo el microscopio (X10).
Nota: El lanzado protoplastos son esféricos formado, mientras que las células sin digerir tienen forma oval o irregular. - Transferir 10 mL de solución en un tubo de 50 mL de enzima/protoplasto vertiendo suavemente y añadir 10 mL de solución de W5 (tabla 1) a temperatura ambiente para detener la digestión. Invierta suavemente el tubo varias veces. Vierta suavemente la solución de enzima/protoplastos en una malla de nylon limpio 75 μm colocada encima de un tubo de 50 mL para remover los tejidos de la hoja sin digerir.
- Centrifugue la solución a través de flujo de enzima/protoplastos a 100 x g en el tubo de 50 mL durante 1-2 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 mL sin perturbar el pellet de protoplasto.
- Suspender los protoplastos y diluir a una concentración de 2 x 105 mL-1 en la solución de W5 refrigerada a 4 ° C por conteo de protoplasto en un hemacitómetro bajo el microscopio (x10). Mantenga los protoplastos en el hielo durante 30 minutos.
- Centrifugar la suspensión a 100 x g durante 1-2 min a temperatura ambiente y suavemente Retire la solución de W5 con una pipeta de 1 mL sin perturbar el pellet de protoplasto. Resuspender los protoplastos en la solución MMG (tabla 1) en una concentración de 2 x 105 mL-1 a temperatura ambiente.
4. transformación de protoplasto
- Hacer 100 alícuotas de μl de protoplastos (2 x 104 protoplastos en 2 x 105 mL-1) en tubos de microcentrífuga de adherencia baja 1,5 mL utilizando sin cortar puntas de la pipeta de 200 μl. Poner una alícuota a un lado para servir como control negativo. Añadir 10 μl del plásmido (10-20 μg) en cada uno de la alícuota del resto de protoplastos.
- Lentamente agregar 110 μl de solución recién preparada de PEG (tabla 1) en la pared interna del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y luego invierta suavemente y gire el tubo hasta que la solución sea homogénea.
- Incubar la mezcla de transformación a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Para detener la transformación, poco a poco añadir 400 μL de solución de W5 con el tubo de 1,5 mL a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo hasta que la solución sea homogénea. Centrifugar el tubo a 100 g durante 1-2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante con una pipeta.
- Añadir 1 mL de solución de WI (tabla 1) en el tubo y resuspender mediante pipeteo suave 1 - 2 veces. Añadir 1 mL de suero de ternera estéril (vol/vol) de 5% en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos bien 6 a capa de la superficie y evitar que los protoplastos se adhiera a la placa.
- Después de unos segundos, desechar el suero con una pipeta. Transferencia de los protoplastos resuspendidos en un pocillo de la placa de cultivo. Cubra la placa con una tapa.
5. protoplasto incubación y cosecha
- Incubar los protoplastos a temperatura ambiente durante 1-2 días en la oscuridad.
Nota: Hemos encontrado que dos días de incubación produce una señal más fuerte de la proteína fluorescente en general comparada con un día incubación, y que la señal de la proteína fluorescente puede durar hasta 3-4 días. - Transferir la solución del protoplasto a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja de la adherencia. Centrifugar el tubo a 100 x g por 1-2 min a temperatura ambiente para cosechar protoplastos. Quite el sobrenadante con una pipeta y transferir 10 protoplastos μl sobre un portaobjetos de vidrio.
- Observar la señal fluorescente bajo fluorescencia o microscopía confocal. Uso no transforman protoplastos como control negativo (no hay señal debe observarse).
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Representative Results
Diferentes órganos de soja 10 - viejo fueron probados para la preparación del protoplasto (figura 1) y rendimientos fueron observados bajo el microscopio (figura 2). Las paredes celulares de hipocótilo y epicotyl apenas fueron digeridas, y algunas células se quedaron conectadas entre sí (figura 2B, 2C). En el cotiledón (Figura 2D) y raíz (figura 2A), paredes celulares fueron quitadas solamente en una pequeña porción de las células. En cambio, un gran número de protoplastos fueron observado cuando unifolioladas fue utilizado (Figura 2E-G). Hojas unifolioladas en diferentes etapas de desarrollo fueron más examinados (figura 2 H). Mientras que las hojas unifolioladas sin dilatar y ampliadas sólo resultaron en altos rendimientos de protoplastos, el tamaño de protoplastos de sólo ampliado unifoliolado eran más uniforme (figura 2F) que no expandidos unifolioladas (Figura 2E). Para completamente ampliado unifolioladas, las paredes celulares eran todavía intactas en la mayoría de las células (figura 2). Probamos las enzimas de la digestión de la pared celular de tres fabricantes diferentes y obtiene resultados comparables, como se describe anteriormente. Basado en estas observaciones, se concluye que la selección de materiales de planta era un factor crucial y que sólo ampliadas hojas unifolioladas de plantas jóvenes de soja el mejor material para la preparación del protoplasto.
Una gama de diferentes cantidades de ADN (μg 0,1 y 1 μg, 5 μg 20 μg) plásmido fue probada para la eficacia óptima transformación de protoplastos unifolioladas soja (Figura 3A-D). 20 μg plásmido ADN demostrada la mayor eficiencia de transformación con más tasa de transformación de 50% (figura 3D), mientras que 0.1 μg demostró la más baja (menos del 1%) (Figura 3A). Obtuvimos la eficiencia de transformación comparables utilizando kits de purificación de ADN diferentes de tres fabricantes. Este resultado sugiere que grandes cantidades de ADN plásmido serían de gran ayuda para aumentar la eficiencia de transformación.
Figura 4 es imágenes confocales de protoplastos de soja transformados con la construcción p2GWF7-E1, que expresa la GFP fusionada al gen de la leguminosa específica E1 (Glyma.06G207800), conducido por el promotor CaMV 35S en el vector p2GWF7 39. la proteína de la fusión de GFP E1 muestra localización nuclear en protoplastos de soja, que es consistente con un estudio anterior usando la Arabidopsis protoplasto sistema40. Dado que E1 es un gen de la leguminosa específica, nuestro resultado con el sistema del protoplasto de soja proporciona una visión concluyente en la localización subcelular de la proteína E1.
Figura 1. Ilustración que muestra los órganos de una planta de semillero de soja que se prueban para la preparación de protoplasto en este estudio, incluyendo la raíz, hipocótilo, cotiledón, epicotyl y unifolioladas. Después de un par de hojas unifolioladas, plántulas de soja desarrollan hojas trifoliadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Células de protoplasto, preparadas a partir de diferentes órganos y etapas de desarrollo de las plántulas de soja. (A-D) Las células prepararon a partir de diferentes órganos de 10 - viejo plántulas de soja: raíz (A), hipocótilo (B), epicotyl (C), cotiledón (D). (C-E-G) Células de protoplasto preparadas de hojas unifolioladas en diferentes etapas de desarrollo: no expandido (E), sólo ampliado (F) y (G) se expande completamente unifolioladas, correspondientes a las plántulas de soja en (H) a la izquierda, centro y derecha, respectivamente. La barra de escala es de 25 μm (A-G) o 25 mm (H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Confocales imágenes que muestran la eficiencia de transformación de soja unifolioladas protoplastos con diferentes cantidades de ADN plásmido. Imágenes de GFP (representado en verde) y brillantes se combinan el campo (gris). Se transformaron protoplastos con diferentes cantidades del plásmido p2GWF7-E1: 0,1 μg (A), (B) de 1 μg, 5 μg (C) y (D) de 20 μg. Señal de la fluorescencia de GFP era vigilado las 24 horas después de la transformación bajo microscopia. Es la barra negra de escala 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imágenes confocales mostrando la localización subcelular de E1-GFP en el núcleo de soja protoplastos unifolioladas. El plásmido p2GWF7-E1 fue utilizado para la transformación. Imágenes de GFP (representado en verde) y brillantes se combinan el campo (gris). Señal de la fluorescencia de GFP era vigilado las 24 horas después de la transformación. La barra de la escala negra es 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución de enzima (recién preparado) | |
| MES, pH 5.7 | 20mM |
| Celulasa CELF | 2% (w/v) |
| Pectolyase Y-23 | 0.1% (p/v) |
| Manitol | 0.75 M |
| CaCl2 | 0,2 mM |
| BSA | 0.1% (p/v) |
| TDT | 0,5 mM |
| Solución de W5 | |
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5.7 | 2 mM |
| Solución de MMg | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| Manitol | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| Solución de PEG (recién preparado) | |
| PEG4000 | 20% (w/v) |
| Manitol | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| Solución WI | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| Manitol | 0.5 M |
| KCl | 20 mM |
Tabla 1. Soluciones utilizadas para la transformación y soja protoplasto aislamiento.
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Discussion
Este protocolo para el aislamiento de protoplastos de soja y la aplicación a los estudios de expresión transitoria ha sido completamente probado y funciona muy bien en nuestro laboratorio. Los procedimientos son simples y fáciles y requieren equipo ordinario y mínimo coste. Nuestro protocolo produce grandes cantidades de protoplastos de uniforme y de alta calidad en comparación con métodos previamente divulgados34,35,36,37,38. Sin embargo, puesto que hay muchos factores que afectan rendimiento de protoplasto y las tasas de transformación, se recomienda encarecidamente a los investigadores optimizar las condiciones según sus condiciones experimentales, los resultados deseables y los materiales utilizados. Mientras que este sistema es muy útil para el examen de inmediato eventos regulatorios y bioquímicos en las células vegetales, no es conveniente para la observación de los procesos celulares a largo plazo y eventos que se producen a nivel de organismo o tejido.
Encontramos que la selección de vigoroso crecimiento materiales de planta en una etapa ideal del desarrollo era el factor más crucial en la preparación del protoplasto de soja. Determina no sólo los rendimientos de protoplastos, pero la calidad que afecta a la posterior transformación de ADN. Es importante siempre crecen plantas de soja en un ambiente constante de estrés, como sequía, inundaciones, temperaturas extremas o plagas. Se logra la mayor eficiencia de producción y transformación de protoplasto empleando hojas unifolioladas sólo ampliadas de plántulas jóvenes. Para los principiantes, se recomienda utilizar hojas unifolioladas en diferentes etapas de desarrollo y hacer una comparación para obtener los mejores resultados.
Relación ADN protoplasto es un factor importante para la eficacia de la transformación óptima. Es generalmente mejor comenzar con la proporción de 2 x 104 protoplastos/10-20 μg ADN, pero la optimización de la relación para construcciones individuales se recomienda25. Se recomienda encarecidamente el uso de ADN obtenido por un kit de purificación de ADN de alta calidad.
Para la elección de vectores de expresión transitoria en protoplastos, número de copia de alta y vectores de pequeño tamaño son generalmente preferidas. Aunque vectores binarios para la tumefaciens de la agrobacteria-transformación mediada de plantas puede ser utilizado para la transformación de protoplasto, el gran tamaño de estos vectores puede resultar en menos eficacia de la transformación óptima. Para la expresión de la proteína GFP-fusion, generalmente utilizamos vectores que no poseen un marcador de selección para las plantas y son así relativamente pequeños (6-7kb), como p2GWF7 y p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
Múltiples vectores pueden usarse para transformar protoplastos simultáneamente. Hemos tenido éxito en expresar vectores centro para probar las interacciones proteína-proteína, así como múltiples proteínas fluorescentes de organelas y etiquetado subcelular en protoplastos de soja. Además, la sencillez y grandes rendimientos de nuestro método ofrece un sistema ideal para el examen de eventos regulatorios y bioquímicos, gene targeting vector diseño, aislamiento de proteínas expresadas transitoriamente y complejo de la proteína y purificación de específicos Acerca de organelas como el núcleo, lo que permite otras aplicaciones emergentes genómico y proteómico.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación de genoma de planta de la National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
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