Vi utvecklade ett enkelt och effektivt protokoll för beredning av stora mängder sojabönor protoplasts att studera komplexa regelverk och signalering mekanismer i levande celler.
Sojabönor (Glycine max (L.) Merr.) är en viktig gröda art och har blivit en baljväxt modell för studier av genetiska och biokemiska vägar. Det är därför viktigt att etablera en effektiv övergående gen uttryck system i sojabönor. Här rapporterar vi ett enkelt protokoll för beredning av sojabönor protoplasts och dess tillämpning för övergående funktionella analyser. Vi hittade att unga unifoliate blad från sojabönor plantor resulterade i stora mängder av hög kvalitet protoplasts. Genom att optimera en PEG-kalcium-medierad omvandling metod, uppnått vi hög förvandling effektivitet använder sojabönor unifoliate protoplasts. Detta system ger en effektiv och mångsidig modell för granskning av komplexa regelverk och signalering mekanismer i levande sojabönor celler och får hjälp att bättre förstå olika cellulär-, utvecklings- och fysiologiska processer av baljväxter.
Protoplasts är växtceller som har cellväggar bort. De behålla de flesta av funktioner och aktiviteter av växtceller, protoplasts är en bra modell för att observera och utvärdera olika cellulära händelser och är värdefulla verktyg att studera somatisk hybridisering1 och växt regenerering2. Protoplasts har utnyttjats också allmänt för växt förvandling3,4,5, eftersom cellväggarna annars skulle blockera passagen av DNA i cellen. Protoplasts besitter några av fysiologiska svaren och cellulära processer av intakt växter, därför erbjuder grundläggande värde i grundforskning att studera subcellulär protein lokalisering6,7,8, protein-protein interaktioner9,10, och arrangören aktivitet11,12,13 i levande celler.
Isolering av växten protoplasts rapporterades först i 196014 och protokollen för både isolering och omvandling av protoplasts har utvecklats och optimerats. Ett standardförfarande av protoplast isolering innebär att skära av bladen och enzymatisk nedbrytning av cellväggar, följt av separation av släppt protoplasts från icke-smält vävnad skräp. Omvandling strategier inkluderar elektroporation15,16, Mikroskop17,18och polyetylenglykol (PEG)4,5,19 metoder. Ett stort antal arter har rapporterats framgångsrik för protoplast isolering, inklusive Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 och andra prydnadsväxter familjer23,24. Medan olika vävnadstyper används i olika arter, har ett system av övergående uttryck i Arabidopsis mesophyll protoplast (TEAMP) isolerade från bladen på modell växten Arabidopsis thaliana varit väl etablerade25 och allmänt antagna till applikationsmöjligheter.
Sojabönor (Glycine max (L.) Merr.) är en av de viktigaste proteinet och olja grödor26. Till skillnad från Arabidopsis och ris, är att erhålla genmodifierade sojabönor växter kända för att vara ganska svårt och låga effektivitet. Agrobacterium tumefaciens-medierad infiltration har varit populärt används för övergående gen uttryck studier i de epidermala cellerna i tobak27 och plantor i Arabidopsis28,29, medan Agrobacterium rhizogenes har använts för omvandling av håriga rötter i sojabönor30. Virus-inducerade genen ljuddämpningssystemet metoder använts för nedreglering av mål gener31,32 och övergående uttryck33 i en systemisk sätt. Protoplasts ger en värdefull och mångsidigt alternativ till dessa synsätt. Protoplasts kan erhållas från sojabönors aboveground material och tillåter snabb och synkroniserade transgenens uttryck. Sedan första framgångsrika isolering av sojabönor protoplasts i den 198334, har det dock begränsat rapporter om tillämpningen av protoplasts i sojabönor35,36,37, 38, främst på grund av relativt låg avkastning av sojabönor protoplasts.
Här beskriver vi ett enkelt och effektivt protokoll för isolering av sojabönor protoplasts och dess tillämpning för övergående gen uttryck studier. Använder unga unifoliate blad från sojabönor plantor, kunde vi få stora mängder viktig protoplasts inom några timmar. Dessutom har vi optimerat en PEG-kalcium-medierad omvandling metod som är enkel och låg kostnad att leverera DNA in sojabönor protoplasts med hög verkningsgrad.
Detta protokoll för isolering av sojabönor protoplasts och ansökan till övergående uttryck studier har testats grundligt och fungerar mycket bra i vårt laboratorium. Förfaranden som är enkla och lätta och kräver vanlig utrustning och minsta möjliga kostnad. Våra protokoll ger stora mängder enhetlig, hög kvalitet protoplasts jämfört med tidigare rapporterade metoder34,35,36,37<su…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av programmet växt Genome Research från National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
BSA | NEB | R3535S | |
DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
KCl | Fisher | P217-500g | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
PEG4000 | Fluka | 81240 | |
nylon mesh | carolina | 652222N | |
Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
Soil | Ingram's Nursery | ||
perlite | Vigoro | 100521091 | |
Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |