Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Replikering af bestilt, Nonredundant bibliotek af Pseudomonas aeruginosa stamme PA14 Transposon indsættelse mutanter

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57298
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 2,3, 1,4, 1,4
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Pseudomonas aeruginosa infektion forårsager betydelig sygelighed i sårbare værter. Nonredundant transposon indsættelse mutant bibliotek af P. aeruginosa stamme PA14, udpeget som PA14NR sæt, letter analyse af genet funktionalitet i mange processer. Præsenteres her er en protokol til at skabe høj kvalitet kopier af PA14NR indstillet mutant biblioteket.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa er en fænotype og genotypisk forskelligartede og tilpasningsdygtige Gram-negative bakterie allestedsnærværende i menneskeskabte miljøer. P. aeruginosa er i stand til at danne biofilm, udvikle resistens over for antibiotika, producere virulens faktorer og hurtigt udvikler sig i løbet af en kronisk infektion. Dermed kan P. aeruginosa medføre både akutte og kroniske, vanskelige at behandle infektioner, resulterer i betydelig sygelighed i bestemte patientgrupper. P. aeruginosa stamme PA14 er en menneskelig klinisk isolere med et bevaret genom struktur, der inficerer en bred vifte af pattedyr og nonvertebrate værter at gøre PA14 en attraktiv stamme til at studere dette patogen. I 2006, blev en nonredundant transposon indsættelse mutant bibliotek indeholdende 5,459 mutanter svarende til 4,596 forudsagte PA14 gener genereret. Siden da har distribution i biblioteket PA14 tilladt forskersamfundet til bedre at forstå funktionen af enkelte gener og komplekse veje af P. aeruginosa. Vedligeholdelse af bibliotek integritet gennem replikering processen kræver korrekt håndtering og præcise teknikker. Med henblik herpå præsenterer dette manuskript protokoller, der beskriver i detaljer trin involveret i biblioteket replikering, bibliotek kvalitetskontrol og korrekt opbevaring af individuelle mutanter.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa er en fænotype og genotypisk forskelligartede og tilpasningsdygtige Gram-negative bakterien findes i jord, vand, og de fleste menneskelige miljøer samt hud mikroflora. Sammenlignet med mange bakteriearter, har P. aeruginosa et relativt stort genom af 5,5-7 Mbp med høj G + C indhold (65-67%). Desuden en betydelig del af dets gener er involveret i metaboliske tilpasningsevne og er en del af regulerende net, giver mulighed for stor fleksibilitet i respons til miljøstress1. P. aeruginosa udtrykker en overflod af virulens faktorer, udstiller hang til form biofilm, besidder evnen til at koordinere svar gennem flere quorum sensing veje og viser en bemærkelsesværdig evne til at udvikle resistens over for antibiotika og tolerance2,3,4,5,6,7,8. Disse attributter præsentere betydelige udfordringer til behandling af infektioner forårsaget af P. aeruginosa.

Kronisk P. aeruginosa infektioner kan opstå i mange sygdomstilstande. Cystisk fibrose (CF), en genetisk sygdom forårsaget af mutation af genet Cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator (CFTR) resulterer i inspissated, inficerede sekret i luftvejene, progressive bronchiectasis og i sidste ende, død fra respirationssvigt9. Af voksenalderen, er størstedelen af patienter med CF kronisk inficeret med P. aeruginosa, som spiller en central rolle i sygelighed og dødelighed forbundet med denne sygdom10. Derudover, er patienter med svær brænde skader11, tracheostomies12, ledalloplastik13eller iboende katetre14 i risiko for P. aeruginosa infektion relateret til bakteriernes evne til at danne biofilm og undslippe vært inflammatoriske respons15. Yderligere, kolonisering opstår uden konkurrence efter en multi antibiotika-resistente eller tolerant befolkning er valgt gennem bredspektret, sekventiel antimikrobiel behandling12,16,17 , 18. bedre forståelse af P. aeruginosa's patogenese vil få betydelige følger for adskillige sygdomstilstande.

Flere P. aeruginosa kliniske isolater, herunder stammer PAO1, PA103, PA14 og PAK, er blevet grundigt undersøgt for at undersøge forskellige funktioner af P. aeruginosa patogenese. Stamme PA14 er en klinisk isolat, der hører til en af de mest almindelige klonede grupper verden over19,20 og ikke har været omfattende passaged i laboratoriet. PA14is stærkt virulente i hvirveldyr modeller af infektion med en bemærkelsesværdig endotoxin profil21, pili strukturere22, patogenicitet øer23, Skriv III sekretion system (TTSS), cytotoksicitet mod pattedyr celler24 og profiler i antibiotisk resistens og persistens25. Derudover PA14 er også stærkt virulente i talrige vært-patogen modelsystemer, herunder plante blad infiltration modeller26,27,Caenorhabditis elegans infektion modeller28, 29, insekt modeller30,31, samt mus lungebetændelse modeller32,33 og hud brænde modeller34.

Genome-wide mutant biblioteker er samlinger af isogene mutanter i uvæsentlige gener, der udgør meget kraftfulde værktøjer til at forstå i en organisme biologi ved at tillade analyse af genfunktioner på en genomisk skala. To nær-mætning transposon indsættelse mutant biblioteker bygget i P. aeruginosa er i øjeblikket tilgængelig for distribution. Indsættelse lokaliteter af transposoner er blevet fastsat for begge biblioteker. Disse såkaldte nonredundant biblioteker lette genome-wide undersøgelser af bakteriestammer af væsentligt reducere tid og omkostninger, der er involveret i screening uncharacterized tilfældige transposon mutanter. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket, bygget i MPAO1 isolere stamme PAO1 ved hjælp af transposoner erphoA/ hah og erlacZ/ hah35, er kurateret af Manoil lab, University of Washington. Biblioteket består af en sekvens-verificerede samling af 9,437 transposon mutanter, der giver bred genom dækning og omfatter to mutanter for de fleste gener36. Oplysninger om P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket er tilgængelig på den offentlige, internet-adgang Manoil lab hjemmeside på http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. P. aeruginosa stamme PA14 nonredundant transposon indsættelse mutant bibliotek (PA14NR indstille) fremstillet i stammen PA14 ved hjælp af transposoner MAR2xT7 og TnphoA37 er i øjeblikket distribueres af Department of Pediatrics på Massachusetts General Hospital. PA14NR sæt består af en samling af mere end 5.800 mutanter med enkelt transposon indsættelser i uvæsentlige gener37. Detaljer om opførelsen af PA14NR sæt er beskrevet i den offentlige, internet-adgang site http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, som også indeholder en bred vifte af online værktøjer til at lette anvendelsen af PA14NR Sæt.

Den oprindelige PA14NR Set består 5,459 mutanter, udvalgt fra et omfattende bibliotek af cirka 34.000 tilfældige transposon indsættelse mutanter, der svarer til 4,596 forudsagte PA14 gener der repræsenterer 77% af alle forudsagte PA14 gener37. Siden opførelsen af biblioteket i 2006 blev der tilføjet nye mutanter, og i øjeblikket PA14NR sættet indeholder mere end 5.800 mutanter38 , der repræsenterer ca. 4.600 PA14 gener. Fleste af PA14 transposon mutanter blev genereret i vildtype baggrund37. Oplysninger om hvert medlem af biblioteket mutant, herunder genetiske baggrund, er tilgængelig enten via søgning online database eller ved at downloade Nonredundant bibliotek regnearket, begge funktioner på webstedet PA14 (http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.cgi). Fleste af mutanter var skabt benytter MAR2xT7 (MrT7) transposon, med et lille sæt oprettet ved hjælp af TnPhoA (phoA) transposon37. Hver transposon har en antibiotisk resistens kassette, som giver mulighed for mutant markeringen ved hjælp af gentamicin (MrT7) eller kanamycin (phoA). PA14NR sæt af mutanter er gemt i 63 96-brønd plader og omfatter to yderligere 96-brønd kontrol plader, der består af vildtype PA14 podes og utilsåede wells imidlerid i en forudindstillet mønster. 96-brønd plade format parret med online søgeredskaber høj grad letter den brugerdefinerede udvikling af screening assays, der giver brugerne til nemt at identificere gener forbundet med mutant fænotyper. Online-søgning værktøjer også lette søgning og udvælgelse af yderligere relevante mutanter kræves for yderligere undersøgelser.

De PA14 og PAO1 transposon mutant biblioteker er meget vigtige globale ressourcer for forskerverdenen, og de supplerer hinanden i validering af funktionen af ukendt gener og veje på dette bakteriel patogen. Tilfældigvis, siden opførelsen af PAO1 og PA14 transposon mutation bibliotekerne, har fuld-genom DNA-sekventering analyse af mange P. aeruginosa -isolater vist at PAO1 og PA14 tilhører forskellige større subclades af P. aeruginosa fylogeni7,39,40,41. Fordi kliniske P. aeruginosa -isolater findes fordelt i hele fylogeni, det faktum, at PAO1 og PA14 tilhører forskellige P. aeruginosa undergrupper øger værdien af de to transposon mutation biblioteker for sammenlignende undersøgelser.

Publikationer, der beskriver opbygningen og screening af bakteriel mutant biblioteker, herunder P. aeruginosa biblioteker35,er37,42, let tilgængelige i litteraturen. Dog til bedst af vores viden, ingen publicerede protokoller der beskriver detaljerede procedurer og teknikker, der anvendes til replikering, er vedligeholdelse og validering af bakteriel mutant biblioteker tilgængelige.

Den metode, der er skitseret i denne publikation beskriver et sæt af tre protokoller, der letter brug og vedligeholdelse af PA14NR sæt. Den første protokol beskriver replikering af biblioteket som anbefalet til modtagere af PA14NR sæt. Den anden protokol omfatter retningslinjer for striber, voksende, og opbevaring individuelle mutanter identificeret ved hjælp af PA14NR sæt. Den tredje protokol beskriver kvalitetskontrol teknikker, herunder PCR-amplifikation af fragmenter fra transposon mutanter og efterfølgende sekventering at bekræfte mutant identitet. Dette sæt af protokoller kan også tilpasses til replikering og vedligeholdelse af andre bakterielle mutant biblioteker eller samlinger. Replikering af bakteriel mutant biblioteker eller samlinger er stærkt tilrådes at bevare integriteten af "masterkopien" (original kopi modtaget). Replikering af flere kopier af PA14NR angive til rutinemæssige laboratoriebrug minimerer sandsynligheden for interwell kontaminering af masterkopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsigtig: Udnytte standard BSL-2 sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering af P. aeruginosa, en menneskelig patogen. Hvis du er privatperson immunkompromitterede eller har en sygdomstilstand, der øger din modtagelighed over for bakteriel infektion, tage særlig forsigtighed, når du arbejder med s. aeruginosa. Kontakt kontoret for Biosikkerhed i din institution og indhente godkendelse fra din læge før du arbejder med den PA14 NR indstillet eller mutant biblioteker af bakterielle patogener.

Figure 1
Figur 1: oversigt over protokollen I: replikering af PA14NR indstille. Dag 1: Replikere frosne mutant kulturer fra "masterkopien" af PA14NR sat i LB Agar medier og vokse mutanter natten over ved 37 ° C. Dag 2: Overføre mutant vækst fra LB Agar medier til dyb godt blokke indeholdende LB flydende bouillon, vokse natten over ved 37 ° C under omrystning på 950 rpm. Dag 3: Bland overnight LB kulturer med glycerol og derefter overføre til 96-brønd destination plader til langtidsopbevaring. Sted 96-brønd plader flad i-80 ° C fryser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: anbefalede opsætning. Sterilitet og smidig arbejdsgang bør opretholdes ved hjælp af passende forholdsregler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

1. protokol I: replikering af PA14NR sæt

Bemærk: Replikering af biblioteket kan opnås ved at dividere PA14NR sat i fire delmængder af seksten plader hver som kan behandles i fire på hinanden følgende uger. Generation af 1 til 6 eksemplarer overholder ugentlige arbejdsprocessen er skitseret i tabel 1, mens generation af mere end 6 eksemplarer følger ugentlige arbejdsprocessen skitseret i tabel 2. For at generere 12 eksemplarer af PA14NR Set, podes det samme PA14NR undersæt til flydende LB medier på dag 2 og igen på dag 3 (fra det samme sæt af agar plader replikeret på dag 1) og overførsel overnatning mutant kulturer i kopi plader på dag 3 og dag 4 henholdsvis.

Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3
Prep dag Vækst af PA14NR indstillet mutanter på LB-agar medier Vækst af PA14NR indstillet mutanter i flydende LB medier Overførsel af PA14NR indstillet mutant kulturer til destination plader

Tabel 1: tidsplan for replikering af 1-6 eksemplarer af PA14NR Set. Replikering af et lille antal kopier kan overholde en ugentlig arbejdsproces.

Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4
Prep dag Vækst af PA14NR indstillet mutanter på LB-agar Vokse af PA14NR indstillet mutanter i flydende LB medier Overførsel af dag 3 mutant kulturer til at generere 1. sæt af 6 eksemplarer af PA14NR sæt Overførsel af dag 4 mutant kulturer til at generere 2 sæt af 6 eksemplarer af PA14NR sæt
Vækst af PA14NR indstillet mutanter i flydende LB medier

Tabel 2: tidsplan for replikering af op til 12 eksemplarer af PA14NR Set. Replikering af et større antal eksemplarer vil kræve lagdeling i en ugentlig arbejdsproces.

  1. Dag 1: Vækst af PA14NR sæt Master kopi på LB agar plader
    1. Bære handsker, laboratoriekittel og maske til at håndtere PA14NR sæt.
    2. Klart bænk og tørre overfladen med 70% ethanol.
    3. Forberede LB agar media43 og steriliseres i autoklave, 25 min. Cool medier til 55 ° C i vand bad og tilføje enten 15 µg/mL gentamicin, for mutanter indeholdende MAR2xT7 transposon indrykninger eller 200 µg/mL kanamycin, for mutanter indeholdende TnphoA indsættelser.
    4. Hæld smeltet LB-agar i rektangulære plader ved hjælp af ca. 60 mL media pr. plade. Tørre plader i en steril hætte i ca 1 time før brug. Sørg for der er ingen kondensvand på overfladen af agaren. Gemme plader ved 4 ° C, hvis det er nødvendigt.
    5. Oprette et sterilt felt med en bunsenbrænder på ethanol-udslettet bænk toppen og konfigurere containere med passende løsninger for replicator pin sterilisation (Se trin 1.1.9). Brug åbne plastbeholdere (5,25" L x 4,25" W x 1,75 "H omtrentlige størrelse) for replicator pin sterilisation. Autoklave plastbeholdere før brug.
      Bemærk: Varmen i bunsenbrænder flamme skaber en konvektion nuværende, som varmer rummet over flammen og løfter enhver partikler i luften op og væk fra den køligere luft nedenunder, at holde arbejdsområdet sterile.
    6. Fjerne et maksimum på fire PA14NR sæt master plader fra-80 ° C fryser (for at undgå unødvendige optøning), og placere dem på tøris i 4 L is pan.
    7. Tage den 96-brønd master plade at blive replikeret fra tøris og placere den på bænken at korte optøning, som tager kun tid nødvendige for Sterilisation af replicator pins (ca 3-4 min) (Se trin 1.1.8). Mark positionen af A1-koordinaten på agar plade før stempling. Juster master og agar plader med A1-koordinaten for begge plader i øverste venstre hjørne.
    8. Sterilisere replicator "pins" ved at følge trin beskrives nedenfor. Tryk på replicator lidt efter hvert trin for at fjerne overskydende væske.
      1. Fordyb pins i 250 mL 0,3-0,5% natriumhypochlorit (10% husstand blegemiddel) i 30 sekunder. Minimere kontakt med natriumhypochlorit løsning, da det kan føre til skader på benene. Fordyb pins i 250 mL sterilt ddH2O eller sterilt ultrarent vand i 10 sekunder, og derefter i 250 mL 70% ethanol i 30 sekunder, derefter i 250 mL 95% ethanol i 2 min.
      2. Flammen sterilisere replicator stifter af holding replicator vinkelret til bunsenbrænder flamme, langsomt nærmer sig flamme, indtil ethanol antænder, derefter straks trække det fra flammen. Flammen vil slukke når alle ethanol burns off. Holde et låg eller lignende beholderen tæt ved at kvæle brændende ethanol, hvis nødvendigt.
        Bemærk: Vær meget forsigtig, når du arbejder med ethanol nær en flamme. Hold ikke replicator direkte over flammen.
      3. Cool stifter af fastgørelse på en ubrugt sterile rektangulær plade der indeholder agar LB medier i 30 sekunder.
    9. Kort varm aluminium forsegle fra PA14NR sæt master plade med din hånd før skrælning det off. Gøre dette samtidig køling replicator pins. Fjerne aluminium seal omhyggeligt for at forhindre, at seglet retouchering pladen. Bruge pincet til at skrælle eventuelle rester af aluminium segl.
    10. Indsæt replicator pins i master plade, forsigtigt skubbe og swingende replicator i alle fire retninger til at sikre, at stifter kontakt med frosne bakteriel kulturer i hver af 96-brøndene. Være ekstra opmærksom på brønde placeret i yderkanten af pladen ved at skubbe replicator pins mod frosne kulturer i brøndene beliggende på kanten af pladen.
    11. Anbring forsigtigt replicator pins på overfladen af agar plade. Flytte replicator i en let cirkulær bevægelse til form mini-græsplæner af ca 4-5 mm for hver mutant stamme. Undgå muligheden for, at mini-græsplæner kan overlappe hinanden, for at undgå krydskontaminering.
    12. Forsegle PA14NR sæt master plade med en ny steril aluminium segl. Rør ikke ved den selvklæbende side af aluminium segl på ethvert tidspunkt at undgå kontaminering. Sørg for, at hver brønd og kanten af pladen er helt forseglet ved hjælp af en plade roller. Tilbagevenden 96-brønd plade til tøris.
    13. Gentag proceduren for hver master plade.
    14. Tør ned alle arbejdsflader med 70% ethanol efter håndtering af PA14NR sæt.
    15. Overføre replikerede agar plader til 37 ° C inkubator og der inkuberes natten over.
  2. Dag 2: Vækst af PA14NR sæt Master kopi i LB flydende bouillon
    1. Forberede LB flydende bouillon43 som indeholder enten 15 µg/mL gentamicin, for mutanter indeholdende MAR2xT7 transposon indrykninger eller 200 µg/mL kanamycin, for mutanter indeholdende TnphoA indsættelser.
    2. Ryd laminar flow hood af unødvendige udstyr og aktivere hood blæser i mindst 10 min før du begynder arbejdet. Tør ned hætte overflader og elementer placeret i hætten med 70% ethanol.
    3. Fyld 2 mL deep-godt blokke med 525 µL af LB flydende bouillon med passende antibiotika i laminar flow hood ved hjælp af en 50-1200 µL 12-kanals elektroniske pipette. Derefter, overføre medier-fyldte deep-godt blokke til ethanol-udslettet bænk toppen. Genbruge tips, så længe sterile forhold bevares.
    4. Bære handsker, laboratoriekittel og maske til at håndtere PA14NR sæt.
    5. Klart bænk og tørre overfladen med 70% ethanol.
    6. Bringe agar plader med overnight dyrket mutantstammen til bænk toppen.
    7. Oprette et sterilt felt med en bunsenbrænder på ethanol-udslettet bænk toppen og konfigurere containere med passende løsninger for replicator pin sterilisation (se næste trin).
    8. Sterilisere replicator "pins" følge trinene beskrevet nedenfor. Tryk på replicator lidt efter hver nedsænkning til at fjerne overskydende væske.
      1. Fordyb pins i 250 mL 0,3-0,5% natriumhypochlorit i 30 sekunder. Minimere replicator pin kontakt med natriumhypochlorit løsning, da det kan føre til skader på benene. Derefter, fordybe pins i 250 mL sterilt ddH2O eller ultrarent vand i 10 sekunder, derefter i i 250 mL af 70% ethanol i 30 sekunder, derefter i 250 mL 95% ethanol i 2 min.
      2. Flammen sterilisere replicator pins, så cool pins ved fastgørelse til ubrugte rektangulær plade der indeholder agar LB medier i 30 sekunder.
        Bemærk: Vær meget forsigtig, når du arbejder med ethanol nær en flamme (Se 1.1.8).
    9. Forsigtigt placere replicator pins på agar plade der indeholder mutant vækst og kontrollere, at ben er i kontakt med alle 96 mutanter på agar plade og derefter dykke pins ind i dybe brønde indeholdende LB flydende bouillon. Undgå at røre siderne af brønde med benene.
    10. Seal dyb brønd blok med en steril åndbar forsegling membran. Brug en plade roller til at sikre, at hver enkelt godt er forseglet korrekt.
    11. Gentag proceduren for hver agar plade.
    12. Tør ned alle arbejdsflader med 70% ethanol efter håndtering af PA14NR sæt.
    13. Vokse podede flydende kulturer i 15-16 timer ved 37° C på 950 rpm ved hjælp af en høj hastighed shaker, hvis den er tilgængelig.
      Bemærk: Hvis der ikke findes en høj hastighed shaker, inkubation af dyb brønd blokke i shaker på 250-300 rpm er muligt. Dog er der en større chance for lille koloni varianter (SCVs)25 nye lav iltning betingelser. Derfor er det yderst tilrådeligt at holde inkubation times under 15-16 h, når de vokser kulturer i dyb brønd blokke ved lavere hastigheder, shaker. Uønsket spredning af SCVs i mutant brønde kan ændre mutant fænotyper, når du bruger biblioteket til at udføre genetiske skærme.
      Visse brønde i PA14NR Set indeholder langsomt voksende/ikke-voksende mutanter, mangler kloner, eller utilsåede medier. Placeringen af disse boringer er blevet registreret og findes i den supplerende PA14NR sæt brønde oplysninger fil inkluderet med denne publikation.
  3. Dag 3: Overførsel af PA14NR indstillet overnight kulturer i destination plader
    1. Ryd laminar flow hood og aktivere hood blæser i mindst 10 min før du begynder arbejdet. Tør ned hætte overflader og elementer placeret i hætten med 70% ethanol.
    2. Udskrive vandtæt klaebeetiketter (Se supplerende PA14NR sæt etiketter fil for skabelon). Fjern 96-brønd plader fra plast wrap inde i en laminar flow hætte. Peel-off plade etiket og placere det langs pladens kant tættest på A1 til H1 pladens huller destination. Lidt løft låget af destination plade og Placer etiketten på den nederste kant til at vise etiketten når plade dækkes med låg.
    3. Forberede 3,5 L 60% glycerol (v/v) og sterilisere 20 minutter i autoklave.
    4. Bære handsker, laboratoriekittel og maske til at håndtere PA14NR sæt. Fjerne dyb brønd blokke fra høj hastighed shaker eller regelmæssig shaker.
    5. Overføre deep-godt blokke til sterile laminar flow hood og fjern forsigtigt åndbar forsegling membran. Erstat med aluminium segl. Spin-ned dyb-godt blokke ved meget lav hastighed til at indsamle kondens (30 sekunder på 50-150 x g, derefter aftage quicky ved at have centrifuge bremse på).
    6. Overføre deep-godt blokke tilbage til sterile hood og ved hjælp af en 50-1200 µL 12-kanals elektroniske pipette og sterile filtrerede tips tilføje 525 µL af glycerol/LB flydende bouillon mix (lige dele LB flydende bouillon og 60% glycerol løsning) til hver brønd. Mix af forsigtigt pipettering 300 µL op og ned 3 gange med elektroniske pipette. Touch tips til side af godt før du skubber tips til at undgå dryp. Skubbe tips og fortsætte med den næste række indtil færdig med hele dyb brønd blok.
    7. Ved hjælp af 12-kanals elektroniske gentagne pipette og filtrerede tips, til at forhindre, at interwell kontamineres under aliquoting, træk op 900 µL af mutant kultur og dispensere 150 µL til hver 96-brønd destination plader til at generere 6 eksemplarer af bibliotek pladen. Forhindre drypper ved at røre ved væggen i brønde med tips før du starter overførslen af kulturen til destination plader. Hvis ikke gentage pipette er tilgængelige, brug en multikanalpipette for at dispensere 150 µL i hver af de seks 96-brønd plader, ved hjælp af den teknik beskrevet ovenfor for at undgå dryp.
    8. Brug steril aluminium sæler at dække pladerne og bruge en plade roller helt seal plade kanter og alle brønde. Sørg for ikke at dække etiketten id med aluminium segl. Ryst ikke pladerne, som kultur kan plaske på siderne af brøndene eller aluminium segl.
    9. Fjerne forseglet plader fra hood og sted plader på en flad, selv overfladen i-80 ° C fryser.
    10. Tør ned alle arbejdsflader med 70% ethanol efter håndtering af biblioteket.
    11. Udføre kvalitetskontrol kontrol efter bibliotek replikering og ved hjælp af biblioteket til at udføre genetiske skærme (Se protokol III).

2. protokol II: Håndtering og opbevaring af individuelle mutanter fra PA14NR sæt

  1. Dag 1: Streak mutant af interesse
    1. Identificere placeringen af mutant af interesse gennem PA14NR sæt link http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS eller ved hjælp af filen Nonredundant Library.xls hentet fra linket http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi). Noter af antibiotika for at vælge hver især mutant (gentamicin eller kanamycin).
    2. Forberede LB agar medier, steriliseres i autoklave i 20-25 min. og afkøles til 55 ° C i vandbad. Tilføj 15 µg/mL gentamicin for mutanter indeholdende MAR2xT7 transposon indsætninger og 200 µg/mL kanamycin for mutanter indeholdende TnphoA transposon indsættelser. Hæld LB agar medier på plader (runde eller firkantede plader er tilstrækkelig). Tørre plader i sterile hood for ca. 30 min. til 1 time før brug.
    3. Autoklave alle plasticware og ikke-sterile forsyninger inden brug.
    4. Bære handsker, laboratoriekittel og maske til at håndtere PA14NR sæt. Fjern bænk og tørre overfladen med 70% ethanol før arbejdet med PA14NR indstillet.
    5. Oprette et sterilt felt med en bunsenbrænder.
    6. Fjerne PA14NR indstille 96-brønd plade med mutant af interesse fra-80 ° C fryser og anbringes på tøris, tag tøris beholder til bænken og kortvarigt Anbring 96-brønds plade på toppen af bænk at tillade let optøning (ca 1-2 min).
      Bemærk: Registrere alle PA14NR indstillet 96-brønd plader adgang til streak individuelle mutanter, som mere adgang til biblioteket plader er korreleret med en øget risiko for interwell kontaminering.
    7. Varm aluminium segl med hånd før skrælning det ned, være omhyggelig med at forhindre, at seglet retouchering pladen. Bruge pincet til at skrælle eventuelle rester af aluminium segl.
    8. Find mutant af interesse på 96-brønd plade. Brug enten sterile træpind eller steril pipette tip til at vælge en lille mængde af frosne kultur fra den enkelte godt indeholdende mutant af interesse.
    9. Streak frosne kultur på agar plade for enkelt mutant kolonier som følger: forsigtigt sprede bakterier over en del af pladen til at oprette streak 1, ved hjælp af en ny, sterile træ stick eller pipette tip, træk gennem stribe 1 og sprede bakterier over en anden del af plade, til at oprette stribe 2. Ved hjælp af en tredje sterile træ stick eller pipette tip, træk gennem streak 2 og sprede bakterier over den sidste del af pladen, oprette streak 3.
    10. Forsegle kilde plade med en ny steril aluminium segl. Rør ikke klæbende side af aluminium segl på ethvert tidspunkt at undgå kontaminering. Sørg for, at hver brønd og kanter af pladen er helt forseglet ved hjælp af en plade roller. Tilbagevenden 96-brønd plade til tøris og derefter-80 ° C fryser.
    11. Inkuber agar plade i 37 ° C inkubator natten over.
    12. Tør ned alle arbejdsflader med 70% ethanol efter håndtering af biblioteket.
  2. Dag 2: Vækst af mutant af interesse i LB flydende bouillon
    1. Forberede flydende LB bouillon indeholdende 15 µg/mL gentamicin eller 200 µg/mL kanamycin, som pr transposon indsættelse.
    2. Bære handsker, laboratoriekittel og maske til at håndtere P. aeruginosa.
    3. Klart bænk og tørre overfladen med 70% ethanol. Oprette et sterilt felt med en bunsenbrænder.
    4. 3-5 mL af LB bouillon med passende antibiotika overføres til sterile kultur tube med hætte.
    5. Ved hjælp af en steril applikator eller en steril pipette tip, vælge en enkelt koloni af mutant stamme og podes det i LB medier.
    6. Inkuber LB flydende kulturer ved 37 ° C i en shaker ved 225-250 rpm natten over.
    7. Tør ned alle arbejdsflader med 70% ethanol efter håndtering af P. aeruginosa.
  3. Dag 3: Gemme mutant af interesse i-80 ° C fryser
    1. Etiketten cryovial med mutant navn, antibiotika føjet til LB bouillon og datoen for opbevaring.
    2. Forberede 500 mL 50% Glycerol (v/v) og steriliseres i autoklave.
    3. Bære handsker, laboratoriekittel og maske til at håndtere P. aeruginosa.
    4. Fjern bænk og/eller laminar oversvømmelse hood og tørre overfladen med 70% ethanol.
    5. Fjerne rør indeholdende mutant kultur fra shaker.
    6. Forberede en lille beholder med tøris.
    7. Bruge en laminar flow hætte eller oprette et sterilt felt på ethanol-udslettet bænk toppen med bunsenbrænder.
    8. Tilsæt lige store mængder af bakteriekulturen og 50% glycerol til mærket cryovial bruger sterile forhold, og forsigtigt blandes med pipette (endelige rumfang 1-2 mL/vial afhængigt af størrelsen af cryovials anvendes). Placer cryovial på tøris til quick-freeze.
    9. Placer cryovial i mærket boksen i-80 ° C fryser.
    10. Tør ned alle arbejdsflader med 70% ethanol efter håndtering P. aeruginosa.

3. protokol III: kvalitetskontrol af PA14NR sæt

  1. Vælg tilfældig række mutanter fra nyligt replikerede plader til at spore interwell kontaminering (test af 30-40 mutanter anbefales).
    Bemærk: I tilfælde, hvor det er nødvendigt at bekræfte identiteten af en mutant, der anvendes til karakterisering af et bestemt gen, det anbefales at udføre PCR klarlægger ved hjælp af gen-specifikke primere designet til kendte sekvensen af det gen, der indeholder de transposon indsættelse. Selv om mere udfordrende, fordelene ved at bruge vilkårlige omfatter PCR primere i stedet for gen-specifikke PCR-primere når amplyfing DNA fragmenter fra transposon mutanter brugervenlighed storstilet mutant bekræftelse og evnen til at påvise tilstedeværelsen af potentiale forurenende stoffer. For kvalitetskontrollen er det ikke nødvendigt at opnå høj kvalitet PCR sequencing data for alle tilfældigt tilfaeldigt mutanter, så længe et tilstrækkeligt antal mutanter er screenet for at vurdere fejlprocent.
  2. Følg "Protokol II" for at streak og vokse mutantstammen.
  3. Autoklave alle plasticware og ikke-sterile forsyninger inden brug.
  4. Isolere genomisk DNA af foretrukne metode. Den analyse, der er beskrevet i dette arbejde, var en genomisk DNA isolering kit anvendelse efter fabrikantens protokoller. Flere mutantstammen kan analyseres samtidigt.
  5. Foranstaltning genomisk DNA koncentration ved hjælp af et microvolume Spektrofotometer. Justere genomisk DNA koncentration til ca. 100 ng/µL.
  6. Bruge genomisk DNA som skabelon til at køre "PCR1 reaktion", som beskrevet i trin 1 i tabel 3, generere Arb1 PCR fragmenter (figur 3). Primere for dette trin er anført i tabel 4.
  7. Tilsæt 0,5 µL af 10 x loading bufferen til 5 µL af PCR1 reaktion, indlæse i en 1.5-2%-agarosegel og Kør gelen på 80-150 V.
    Bemærk: Et bestemt fragment længde eller en bestemt fragment vifte forventes ikke, og mere end ét band kan være til stede som den vilkårlige primer kan binde sig til flere steder.
  8. Bruge DNA fra PCR1 reaktion som skabelon til at køre "PCR2 reaktion", som beskrevet i trin 2 i tabel 3, generere Arb2 PCR fragmenter (figur 3). Primere for dette trin er anført i tabel 4.
  9. Tilsæt 0,5 µL af 10 x loading bufferen til 5 µL af PCR2 reaktion, indlæse i en 1.5-2%-agarosegel, og Kør gelen på 80-150 V.
    Bemærk: Et bestemt fragment længde eller en bestemt fragment vifte forventes ikke, og mere end ét band kan være til stede som den vilkårlige primer kan binde sig til flere steder.
  10. Send PCR2 reaktion med passende transposon-specifikke primer til sekvensering.
  11. Analize sekventering resultater byBLASTing dem mod den komplette PA14 genom ved hjælp af BLAST link leveres på webstedet PA14NR bibliotek (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) eller ved direkte sprængning dem mod de specifikke gensekvens af mutant af interesse.
    Bemærk: Oplysninger om udvalgte mutanter kan findes ved at søge på webstedet PA14NR sæt (Søg http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS eller download den Nonredundant Library.xls fil fra link http:/ / pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi).

Figure 3
Figur 3: PCR forstærkning og sekventering af transposon indsættelse mutanter. Skematisk oversigt over trin involveret i PCR-amplifikation og sekventering for kontrol af mutant identitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

PCR reaktion Set-up
Trin 1 Trin 2
PCR1 reaktion: PCR2 reaktion:
23.25 µL vand (molekylær biologi klasse) 19.15 µL vand (molekylær biologi klasse)
3µL 10 x Taq-polymerase Buffer 5 µL 10 x Taq-Polymerase Buffer
0.5µL Taq-polymerase 0,6 µL Taq-Polymerase
0,625 µL 20 µM primer Arb1D (tabel 4) 0,625 µL 20 µM primer Arb2A (tabel 4)
0,625 µL 20 µM transposon-specifikke Primer (PMFLGM. GB 3a eller Tn5Ext) (tabel 4) 0,625 mL 20 µM Transposon-specifikke Primer (PMFLGM. GB 2a eller Tn5Int2) (tabel 4)
1 µL 10 mM dNTP'er 1 µL 10 mM dNTP'er
1 µL genomisk DNA, 100 ng 5 µL PCR1 reaktion
30 µL endelige reaktion volumen 30 µL endelige reaktion volumen
PCR reaktion indstillinger
PCR1 Thermocycler betingelser: PCR2 Thermocycler betingelser:
95 ° C-2 min 95 ° C-2 min
Gentag 5 cyklusser: Gentag 30 cykler:
95 ° C-30 s 95 ° C-30 s
30 ° C – 1 min 54 ° C-30 s
72 ° C – 1 min 72 ° C – 1,5 min
Gentag 30 cykler: 72 ° C-10 min
95 ° C-30 s 4 ° C – Hold
45 ° C-30 s
72 ° C – 1 min
72 ° C-10 min
4° C – Hold

Tabel 3: PCR reaktionsbetingelser set-up og thermocycler anvendes til vilkårlige PCR. Vilkårlig PCR reaktioner udføres sekventielt, og fragmenter skabt under PCR1 reaktion bruges som skabelon i PCR2 reaktion. Specifikke thermocycler indstillinger bruges for hvert sæt af reaktioner.

Primer navn Primer sekvens
MAR2xT7 Transposon-specifikke primere
PMFLGM. GB-3a TACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM. GB-2a TGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 Transposon sekventering Primer
PMFLGM. GB-4a GACCGAGATAGGGTTGAGTG
TNphoA Transposon-specifikke primere
Tn5Ext GAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2 GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
TNphoA Transposon sekventering Primer
Tn5Int CGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
Vilkårlig primere
ARB1D GGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2A GGCCAGGCCTGCAGATGATG

Tabel 4: liste over primere bruges i kvalitetskontrol Eksperimenter. Primere, der anvendes til PCR-amplifikation og sekventering af transposon indsættelse mutanter at bekræfte mutant identitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tolv nye kopier af PA14NR Set blev kopieret ved hjælp af protokollen jeg, og en kvalitetskontrol vurdering af de nye kopier genereret blev gennemført ved hjælp af protokollen III.

PA14NR sæt mutant plader sammen med kontrol plader, der består af vildtype PA14 podes og utilsåede wells imidlerid i en forudindstillet mønster (figur 4A), blev kopieret efter methology beskrevet i protokollen I. kontrol plader er inkluderet i PA14NR sat til at evaluere interwell kontaminering, når du udfører plade replikering. Kontrol plader kan geometriprogrammet desuden bruges til praksis replikering teknikker før adgang til plader der indeholder transposon indsættelse mutanter. Vækst af kontrol plader blev visuelt inspiceret efter replikering på LB agar plader og natten inkubation at sikre tilstedeværelsen af forventede vækstmønstre (figur 4B). Tilstedeværelse eller fravær af bakterievækst i dyb brønd blokke podet med kontrol plade 1 blev vurderet efter natten inkubation af læsning OD600 i spektrofotometret. Resultaterne viste betydelig vækst i vildtype PA14 podes brønde og fuldstændig mangel på vækst i de utilsåede wells (figur 4 c). Selv om der var nogle variation i væksten af vildtype PA14 kulturer, var der fuldstændig mangel på vækst i de utilsåede wells (figur 4D).

Tredive-otte mutantstammen tilfældigt udvalgt fra en af de nyligt genererede kopier af PA14NR Set blev analyseret af sekventering DNA fragmenter genereret af vilkårlige PCR. Vilkårlig PCR reaktioner blev foretaget til at forstærke DNA fragmenter fra regionerne omkring transposon indsætninger af de 38 mutanter valgt, og PCR fragmenter opnået blev efterfølgende sekventeret. Et eksempel på PCR fragmenter opnået efter PCR-amplifikation af ni forskellige transposon indsættelse mutanter er vist i figur 5. Som Udglødning af vilkårlige primere opstår tilfældigt, kan ikke fragment længde forudsiges. Når ingen bands var synlige, blev PCR reaktioner gentaget. Identiteten af transposon indrykninger indeholdt i 38 mutanter analyseret blev fundet ved hjælp af linket PA14 Transposon indsættelse Mutant bibliotek (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi) til at vælge de nødvendige for at udføre vilkårlige PCR primere reaktioner.

Sekventering resultater opnået fra de 38 mutant stammer blev sprængt mod komplet genomet af stamme PA14 ved hjælp af blast linket på webstedet PA14NR bibliotek (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi). Sekventering resultater fra tilfældigt udvalgte mutanter blev også justeret mod gensekvenser, der svarede til hver enkelt mutant (opnået ved hjælp af den PA14NR sæt pladen holdning søgeværktøj, der er fundet på PA14NR bibliotek hjemmeside http:// pa14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS). Sekvens alignments blev udført ved hjælp af værktøjet Juster sekvenser nukleotid BLAST leveres af NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PAGE = MegaBlast & PROGRAM = blastn & BLAST_PROGRAMS = megaBlast & PAGE_TYPE = BlastSearch & BLAST_SPEC = blast2seq & DATABASE = Nielsen & QUERY = & fag =).

To af de 38 mutanter valgt genererede lav kvalitet sekvens resultater, sandsynligvis på grund af højt indhold af GC i den region, der indeholder transposon indsættelse, og kunne ikke analyseres yderligere. Sekvens resultater fra 35 af de 36 held sekventeret mutanter matchede sekvenser af gener svarende til de PA14NR indstille valgt mutanter. Kun én ud af de 36 sekvenser undladt at matche sekvensen af det gen, der svarer til det muterede valgt. Det var dog ikke fastslået, hvis denne uoverensstemmelse førte fra et problem, der opstod en fejl under replikering af de nye kopier af PA14NR Set eller kunne tilskrives 2,8% fejlmærkning fejl anslået tidligere for PA14NR indstille37.

Figure 4
Figur 4: PA14NR indstille kontrol plader. A) layout af PA14NR indstillet kontrol plader 1 og 2. B) billede af PA14 NR indstillet kontrol plader 1 og 2 replikeret på LB Agar (udsigt fra toppen af agar plade). C) gennemsnit bakterievækst (+/-SD) målt i podede og utilsåede wells af kontrol plade 1 efter natten inkubation i dyb godt blok. Målinger blev udført på OD600. D) bakteriel vækst målt i podede og utilsåede wells af kontrol plade 1 efter natten inkubation i dyb godt blok. Målinger blev udført på OD600 i individuelle brønde. Selv kolonner svarer til målinger foretaget i utilsåede brønde; ulige kolonner svarer til målinger foretaget i PA14-podes brønde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: PCR1 og PCR2 fragmenter opnået fra forstærkning reaktioner. Eksempel på fragmenter opnået ved hjælp af vilkårlige PCR forstærkning reaktioner. Fragmenter i baner 1-9 svarer til forskellige mutanter udvalgt tilfældigt til at udføre kvalitetskontrol af PA14NR indstillet replikeret plader. MWM: DNA molekylvægt markør. DNA MWM størrelser er i basepar.
PA14NR sæt mutantstammen testet: Lane 1: 07_4 A10, lane 2: 07_4 B4, lane 3: 08_1 C3, lane 4: 08_1 H6, lane 5: 08_3 G10, lane 6: 08_4 B8, lane 7: 08_4 H3, lane 8: 09_2 D12, lane 9 : 09_2 G5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

P. aeruginosa PA14NR er en værdifuld ressource for det videnskabelige samfund. Ifølge marts 2017 datasæt fra Clarivate Analytics' væsentlige videnskab Indicators database, Liberati et al. (2006) 37, der beskriver opbygningen af PA14NR sat, er placeret i den øverste 1% af Mikrobiologi publikationer. Google Scholar rapporter over 600 citater af Liberati et al. (2006) originale manuskript fra August 2017. Biblioteket har spillet en vigtig rolle i belyse de underliggende P. aeruginosa patogenese mekanismer. Vigtigere, letter 96-brønd plade format PA14NR indstille høj overførselshastighed genetiske skærme designet til at studere en bred vifte af P. aeruginosa mutant fænotyper44,45,46. Som PA14NR sæt er tilgængelige for distribution, må særlige forholdsregler anvendes til at bevare integriteten af denne ressource.

En række publikationer demonstrere nytten af benytter den PA14NR Set i genetiske skærme37,38,47,48. For eksempel som en indledende test af nytten af biblioteket udførte Liberati et al. et PVC (polyvinylchlorid) vedhæftet fil skærm, som korrelerer med bakteriernes evne til form biofilm37,38, 47 , 48. bibliotekets format giver også mulighed for undersøgelse af komplekse genetiske egenskaber såsom sværmer motilitet, fremgår af identifikation af hundredvis af gener af interesse i en simpel skærm48. PA14NR sæt blev brugt også i en storstilet MALDI-TOF-massespektrometri-baseret skærm til at erhverve og analysere intakt-celle proteomet profil spectra og vurdere effektiviteten af MALDI-TOF Biotyping47. Anvende denne teknik, var forskere i stand til at afgøre, om mindre genomisk forskelle, som dem, der skyldes transposon indsættelser, er forstyrrende for biotyping indsats, der er anvendt i klinisk og terapeutisk miljøer. Derudover blev PA14NR sæt brugt til at udføre en genome-wide screen for dæmpning af PA14 virulens i en C. elegans infektion model, så kan identificeringen af tidligere uncharacterized P. aeruginosa virulens-relaterede gener 38, og dermed give et eksempel på brugen af biblioteket PA14 at studere vært-patogen interaktioner.

PA14NR sæt fungerer også som en vigtig ressource for studiet af enkelte mutanter. For at undgå kontaminering af biblioteket, anbefalede bedste fremgangsmåder for at få adgang til mutanter af interesse. Fordi håndteringen af biblioteket øger muligheden for kontaminering, anbefales det at lagre mutanter af interesse i individuelle hætteglas for at begrænse adgangen til PA14NR indstille arbejds- og originaleksemplarer. Dette forhindrer forurening, forbedrer levetiden af biblioteket og beskytter investeringer.

For at bevare integriteten af den vigtige ressource, PA14NR sæt, anbefales det, at alle modtagere af PA14NR Set lave kopier af bibliotek ved modtagelsen. Trods for bedste indsats, kan ikke potentialet for utilsigtet forurening under replikering procedurer udelukkes. Derfor anbefales det kraftigt at brugerne komplet kvalitetskontrol kontrol efter bibliotek replikering og ved hjælp af biblioteket til at udføre genetiske skærme. Det anbefales også kraftigt, at brugere foretager yderligere kopier af PA14NR sat til at udføre genetiske skærme som sandsynligheden for interwell kontaminering stigninger. Derudover underkastes bibliotek kopier bruges til at udføre mere end 2-3 genetiske skærme omfattende kvalitetskontrol vurderinger. Desværre, der er ingen rigtige måde at inddrive biblioteker, der oplever tab af kloner eller interwell forurening. Kompromitteret eller forurenet kopier skal kasseres. Som en konsekvens, anbefales det, at brugerne kopiere flere kopier af biblioteket for rutinemæssig laboratoriebrug, i betragtning af at en kopi levetid er begrænset. Det anbefales også at brugere begrænse adgangen til "masterkopien" at bevare integriteten af PA14NR sæt.

Protokollerne præsenteres her give en detaljeret redegørelse for replikering teknikker, herunder set-up, protokoller og bedste praksis. De replikering protokoller er beskrevet for PA14NR sat kan tilpasses for at generere op til 12 eksemplarer af biblioteket og kan også let tilpasses for at kopiere andre bakterielle mutant biblioteker. Til bedste af vores viden findes der ingen publicerede protokoller til dato med detaljerede beskrivelser af procedurer og teknikker, der anvendes til replikation, vedligeholdelse og validering af bakteriel mutant biblioteker. Vi håber, at disse protokoller vil give brugerne af PA14NR indstillet og andre bakterielle mutant biblioteker med de oplysninger, der er nødvendige for at udføre disse vigtige opgaver.

Biblioteket er anvendt til høj overførselshastighed skærme eller som en kilde til individuelle mutanter, er det vigtigt med jævne mellemrum vurdere integriteten af kopi i brug. For at gøre dette, skal tilstrækkelig uddannelse af personale og revurdere replikering eller mutant udvælgelse teknikker gøres med jævne mellemrum. Anvendelse af PA14NR sæt kontrol plader og udførelse af rutinemæssige PCR-amplifikation og sekventering af tilfældige mutanter at bekræfte deres identitet er stærkt anbefales. Liberati el al. (2006) 37 anslået at 2,8% af det samlede antal mutanter i PA14NR Set blev fejlmærkede, som fremhæver nødvendigheden af at sekvens specifikke transposon mutanter og generere i-frame sletning mutanter før du starter en omfattende undersøgelse og/eller offentliggørelse af forskning, der indebærer særlige gener. Da ordentlig protokoller og metoder for biblioteket replikation og udvælgelse af individuelle mutanter for yderligere undersøgelse, vil PA14NR sæt bidrage til forståelsen af P. aeruginosa patogenicitet og forbedring af kliniske resultater for inficeret patienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapport ingen finansielle interessekonflikter. Eliana Drenkard og Frederick Ausubel deltaget i skabelsen PA14 nonredundant transposon mutant bibliotek. Bryan Hurley og Lael Yonker i øjeblikket hus og distribuere mutant biblioteket som del af Department of Pediatrics på Massachusetts General Hospital.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Lisa Philpotts MGH Treadwell virtuelle bibliotek for hendes vejledning i til databasesøgning. Dette arbejde blev støttet af cystisk fibrose Foundation (YONKER16G0 og HURLEY16G0) og NIH NIAID (BPH og ADE: R01 A1095338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
  10. Foundation, C. F. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report. , Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016).
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 135 Pseudomonas aeruginosa mariner transposon mutant bibliotek mutagenese mikrobiologi opportunistiske infektioner immunologi
Replikering af bestilt, Nonredundant bibliotek af <em>Pseudomonas aeruginosa</em> stamme PA14 Transposon indsættelse mutanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu,… More

Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter