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Immunology and Infection

आदेशित, अनावश्यक लायब्रेरी की प्रतिकृति Pseudomonas aeruginosa तनाव PA14 Transposon लन म्यूटेंट

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57298
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 2,3, 1,4, 1,4
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Pseudomonas aeruginosa संक्रमण कमजोर मेजबान में महत्वपूर्ण रुग्णता का कारण बनता है । पी aeruginosa तनाव PA14 के निरर्थक transposon प्रविष्टि उत्परिवर्ती पुस्तकालय, PA14NR सेट के रूप में नामित, कई प्रक्रियाओं में जीन की कार्यक्षमता के विश्लेषण की सुविधा । यहां प्रस्तुत एक PA14NR सेट उत्परिवर्ती पुस्तकालय के उच्च गुणवत्ता प्रतियां उत्पंन प्रोटोकॉल है ।

Abstract

Pseudomonas aeruginosa मानव वातावरण में एक phenotypically और genotypically विविध तथा रूपांतरित ग्राम-ऋणात्मक जीवाणु सर्वव्यापक है. पी. aeruginosa , एंटीबायोटिक प्रतिरोध विकसित करने, डाह कारकों का उत्पादन और तेजी से एक पुरानी संक्रमण के पाठ्यक्रम में विकसित करने के लिए कर सकते हैं । इस प्रकार P. aeruginosa दोनों तीव्र और जीर्ण, संक्रमण का इलाज करने के लिए मुश्किल है, कुछ रोगी आबादी में महत्वपूर्ण रुग्णता में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है । पी aeruginosa तनाव PA14 एक मानव नैदानिक एक संरक्षित जीनोम संरचना है कि स्तनधारी और nonvertebrate इस रोगज़नक़ अध्ययन के लिए एक आकर्षक तनाव PA14 बनाने के मेजबान की एक किस्म को संक्रमित के साथ अलग है । २००६ में, एक निरर्थक transposon प्रविष्टि उत्परिवर्ती पुस्तकालय ५,४५९ म्यूटेंट इसी ४,५९६ की भविष्यवाणी की PA14 जीन उत्पंन किया गया था । तब से, PA14 पुस्तकालय के वितरण के अनुसंधान समुदाय को बेहतर व्यक्तिगत जीन और पी aeruginosaके जटिल रास्ते के समारोह को समझने की अनुमति दी गई है । प्रतिकृति प्रक्रिया के माध्यम से पुस्तकालय अखंडता के रखरखाव उचित हैंडलिंग और सटीक तकनीक की आवश्यकता है । कि अंत करने के लिए, इस पांडुलिपि प्रोटोकॉल है कि विस्तार से पुस्तकालय प्रतिकृति, पुस्तकालय गुणवत्ता नियंत्रण और व्यक्तिगत म्यूटेंट के उचित भंडारण में शामिल कदम का वर्णन प्रस्तुत करता है ।

Introduction

Pseudomonas aeruginosa मिट्टी, पानी, और सबसे अधिक मानव वातावरण में एक phenotypically और genotypically विविध और अनुकूलनीय ग्राम नकारात्मक जीवाणु मौजूद है, साथ ही त्वचा माइक्रोफ्लोरा । कई बैक्टीरियल प्रजातियों की तुलना में, पी aeruginosa उच्च जी + सी सामग्री (65-67%) के साथ 5.5-7 Mbp के एक अपेक्षाकृत बड़े जीनोम है । इसके अलावा, अपने जीन का एक महत्वपूर्ण अनुपात चयापचय अनुकूलन क्षमता में शामिल है और विनियामक नेटवर्क का हिस्सा हैं, पर्यावरण तनाव के जवाब में महान लचीलेपन के लिए अनुमति1। पी aeruginosa डाह कारकों में से एक बहुतायत व्यक्त करता है, प्रदर्शन proclivity के लिए फार्म का, कई कोरम संवेदन रास्ते के माध्यम से प्रतिक्रियाओं का समंवय करने की क्षमता के पास, और एंटीबायोटिक प्रतिरोध विकसित करने के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता प्रदर्शित और सहिष्णुता2,3,4,5,6,7,8। ये विशेषताएं मौजूद P. aeruginosaकी वजह से संक्रमण के उपचार के लिए महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं ।

जीर्ण पी aeruginosa संक्रमण कई रोग राज्यों में हो सकता है । सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF), एक आनुवंशिक सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane कंडक्टर नियामक (CFTR) जीन के उत्परिवर्तन की वजह से बीमारी, उपयोग inspissated में परिणाम, airway के भीतर संक्रमित स्राव, प्रगतिशील bronchiectasis और, अंत में, मौत सांस की विफलता से9। वयस्कता से, CF के साथ रोगियों के बहुमत लंबे aeruginosaहै, जो इस बीमारी के साथ जुड़े रुग्णता और मृत्यु दर में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है से संक्रमित हैं10. इसके अतिरिक्त, गंभीर चोटों के साथ रोगियों को11, tracheostomies12, संयुक्त प्रतिस्थापन13, या निवास कैथेटर्स14 के रूप में बैक्टीरिया की क्षमता से संबंधित पी aeruginosa संक्रमण के लिए जोखिम में हैं फिल्म और भागने की मेजबानी भड़काऊ प्रतिक्रियाएं15। इसके अलावा, औपनिवेशीकरण एक बहु के बाद प्रतियोगिता के बिना होता है-एंटीबायोटिक प्रतिरोधी या सहिष्णु जनसंख्या व्यापक स्पेक्ट्रम के माध्यम से चुना जाता है, अनुक्रमिक रोगाणुरोधी उपचार12,16,17 , 18. बेहतर समझ पी aeruginosa के रोगजनन कई रोग राज्यों के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ होगा ।

उपभेदों PAO1, PA103, PA14 और पाक सहित कई aeruginosa नैदानिक अलग-अलग, पी aeruginosa रोगजनन के विभिन्न सुविधाओं की जांच करने के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है. तनाव PA14 एक नैदानिक अलग है कि दुनिया भर में सबसे आम क्लोनर समूहों में से एक के लिए है,20 और बड़े पैमाने पर प्रयोगशाला में पारित नहीं किया गया है । PA14is संक्रमण के हड्डीवाला मॉडलों में अत्यधिक विषमय, एक उल्लेखनीय endotoxin प्रोफ़ाइल के साथ21, पिली संरचना22, pathogenicity आइलैंड्स23, टाइप III स्राव प्रणाली (TTSS), cytotoxicity की ओर स्तनधारी कोशिकाओं24 और एंटीबायोटिक प्रतिरोध और हठ25में प्रोफाइल । इसके अलावा, PA14 भी कई मेजबान में अत्यधिक विषमय है-रोगज़नक़ मॉडल प्रणालियों, संयंत्र पत्ती घुसपैठ मॉडल सहित26,27,Caenorhabditis एलिगेंस संक्रमण मॉडल28, 29, कीट मॉडल30,31, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से माउस निमोनिया मॉडल३२,३३ और त्वचा जला मॉडल३४।

जीनोम-वाइड उत्परिवर्ती पुस्तकालयों isogenic म्यूटेंट के अनावश्यक जीन है कि बहुत शक्तिशाली उपकरण का गठन एक जीनोमिक पैमाने पर जीन समारोह के विश्लेषण की अनुमति से एक जीव के जीव विज्ञान को समझने में संग्रह कर रहे हैं । दो के पास-संतृप्ति transposon लन उत्परिवर्ती पुस्तकालयों का निर्माण P. aeruginosa में वर्तमान में वितरण के लिए उपलब्ध हैं । दोनों पुस्तकालयों के लिए transposons के सम्मिलन स्थलों का निर्धारण किया गया है. इन तथाकथित निरर्थक पुस्तकालयों काफी समय और लागत uncharactered यादृच्छिक transposon म्यूटेंट स्क्रीनिंग में शामिल कम से बैक्टीरियल उपभेदों के जीनोम चौड़ा अध्ययन की सुविधा । पी aeruginosa PAO1 transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय, तनाव PAO1 के MPAO1 अलग में निर्माण transposons का उपयोग करphoA/hah है औरlacZ/hah३५, Manoil लैब, वाशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा उपचारात्मक है । पुस्तकालय ९,४३७ transposon म्यूटेंट की एक अनुक्रम सत्यापित संग्रह है कि व्यापक जीनोम कवरेज प्रदान करता है और सबसे जीन३६के लिए दो म्यूटेंट शामिल हैं । पी. aeruginosa PAO1 transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय के बारे में जानकारी सार्वजनिक, इंटरनेट-सुलभ Manoil लैब वेबसाइट पर http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm पर उपलब्ध है । पी aeruginosa तनाव PA14 बेमानी transposon प्रविष्टि उत्परिवर्ती पुस्तकालय (PA14NR सेट) का निर्माण में तनाव PA14 का उपयोग transposons MAR2xT7 और तमिलनाडुphoA३७ वर्तमान में बाल रोग विभाग द्वारा वितरित किया जाता है मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में । PA14NR सेट में एकल transposon सम्मिलन के साथ ५,८०० से अधिक म्यूटेंट का संग्रह शामिल है जो कि अनावश्यक जीन३७में है. PA14NR सेट के निर्माण पर विवरण सार्वजनिक, इंटरनेट-सुलभ साइट http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, जो भी ऑनलाइन खोज उपकरण की एक किस्म शामिल है में वर्णित है PA14NR के उपयोग की सुविधा सेट.

मूल PA14NR सेट ५,४५९ म्यूटेंट, लगभग ३४,००० यादृच्छिक transposon प्रविष्टि म्यूटेंट, कि ४,५९६ की भविष्यवाणी की PA14 जीन सभी के ७७% का प्रतिनिधित्व करने के लिए अनुरूप की एक व्यापक पुस्तकालय से चुना शामिल सभी की भविष्यवाणी की PA14 जीन३७। २००६ नए म्यूटेंट में पुस्तकालय के निर्माण के बाद से जोड़ा गया है, और वर्तमान में PA14NR सेट से अधिक ५,८०० म्यूटेंट३८ है कि लगभग ४,६०० PA14 जीन का प्रतिनिधित्व शामिल हैं । PA14 transposon म्यूटेंट के बहुमत जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि३७में उत्पंन किया गया । आनुवंशिक पृष्ठभूमि सहित उत्परिवर्ती पुस्तकालय के प्रत्येक सदस्य के विषय में विवरण, ऑनलाइन डेटाबेस खोज के माध्यम से या तो उपलब्ध हैं, या अनावश्यक पुस्तकालय स्प्रेडशीट डाउनलोड करके, दोनों PA14 वेबसाइट पर उपलब्ध सुविधाओं (http:// pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi) । म्यूटेंट के बहुमत MAR2xT7 (MrT7) transposon, एक छोटे से TnPhoA (phoA) transposon३७का उपयोग कर बनाया सेट के साथ का उपयोग कर बनाया गया. प्रत्येक transposon एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट है, जो उत्परिवर्ती चयन gentamicin (MrT7) या कनमीसिन (phoA) का उपयोग करने के लिए अनुमति देता है । म्यूटेंट के PA14NR सेट ६३ ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में संग्रहित है और दो अतिरिक्त ९६-अच्छी तरह से नियंत्रण प्लेटें, जो जंगली प्रकार PA14 inoculated और uninoculated वेल्स intercalated से मिलकर एक पूर्व निर्धारित पैटर्न में शामिल है । ९६-अच्छी तरह से प्लेट ऑनलाइन खोज उपकरण के साथ युग्मित प्रारूप बहुत स्क्रीनिंग परख कि प्रयोक्ताओं को आसानी से उत्परिवर्ती phenotypes के साथ जुड़े जीन की पहचान करने की अनुमति के कस्टम विकास की सुविधा । ऑनलाइन खोज उपकरण भी खोज और अतिरिक्त प्रासंगिक म्यूटेंट आगे की पढ़ाई के लिए आवश्यक के चयन की सुविधा ।

PA14 और PAO1 transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालयों वैज्ञानिक समुदाय के लिए बहुत महत्वपूर्ण वैश्विक संसाधन हैं, और वे अज्ञात जीन और इस जीवाणु रोगज़नक़ के रास्ते के समारोह को मांय करने में एक दूसरे के पूरक हैं । संयोग से, PAO1 और PA14 transposon उत्परिवर्तन पुस्तकालयों के निर्माण के बाद से, पूर्ण जीनोम कई पी. aeruginosa के डीएनए अनुक्रमण विश्लेषण से पता चला है कि PAO1 और PA14 के विभिंन प्रमुख पी aeruginosa से संबंधित है फाइलोजेनी7,३९,४०,४१. क्योंकि नैदानिक पी aeruginosa अलग फाइलोजेनी भर में वितरित पाए जाते हैं, तथ्य यह है कि PAO1 और PA14 विभिंन पी aeruginosa उपसमूह के है तुलनात्मक के लिए दो transposon उत्परिवर्तन पुस्तकालयों के मूल्य को बढ़ाता है अध्ययन.

प्रकाशन P. aeruginosa पुस्तकालयों३५,३७,४२सहित बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों, के निर्माण और स्क्रीनिंग का वर्णन साहित्य में आसानी से उपलब्ध हैं । हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, कोई प्रकाशित विस्तृत प्रक्रियाओं और तकनीक प्रतिकृति, रखरखाव, और बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया उपलब्ध है प्रोटोकॉल का वर्णन ।

पद्धति इस प्रकाशन में उल्लिखित तीन प्रोटोकॉल का उपयोग करें और PA14NR सेट के रखरखाव की सुविधा का एक सेट का वर्णन करता है । पहले प्रोटोकॉल PA14NR सेट के प्राप्तकर्ताओं के लिए अनुशंसित के रूप में लायब्रेरी की प्रतिकृति का वर्णन करता है । दूसरा प्रोटोकॉल लकीर के लिए दिशानिर्देश, बढ़ रही है, और PA14NR सेट का उपयोग कर पहचान व्यक्तिगत म्यूटेंट भंडारण शामिल है । तीसरे प्रोटोकॉल का वर्णन गुणवत्ता नियंत्रण तकनीक, transposon म्यूटेंट और बाद अनुक्रमण से टुकड़े की पीसीआर प्रवर्धन सहित उत्परिवर्ती पहचान की पुष्टि करने के लिए । प्रोटोकॉल का यह सेट भी प्रतिकृति और अंय बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों या संग्रह के रखरखाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों या संग्रह की प्रतिकृति उच्च "मास्टर कॉपी" (मूल प्रतिलिपि प्राप्त) की अखंडता को बनाए रखने के लिए सलाह दी जाती है । नियमित प्रयोगशाला उपयोग के लिए PA14NR सेट की कई प्रतियां की प्रतिकृति मास्टर प्रति के साथ-साथ संदूषण की प्रायिकता को कम करता है ।

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Protocol

चेतावनी: पी aeruginosa, एक मानव रोगज़नक़ हैंडलिंग जब मानक बीएसएल-2 सुरक्षा उपायों का उपयोग । यदि आप एक प्रतिरक्षा व्यक्ति है या किसी भी चिकित्सा शर्त है कि जीवाणु संक्रमण के लिए अपने संवेदनशीलता बढ़ जाती है, विशेष सावधानी रखना जब पी के साथ काम कर रहे . aeruginosa. अपने संस्थान में सुरक्षा कार्यालय से परामर्श करें और PA14 NR सेट या जीवाणु रोगजनकों के उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के साथ काम करने से पहले अपने चिकित्सक से अनुमोदन प्राप्त करें ।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल I का ओवरव्यू: PA14NR सेट की प्रतिकृति । 1 दिन: PA14NR के "मास्टर कॉपी" पौंड आगर मीडिया में सेट और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर म्यूटेंट बढ़ने से जमे हुए उत्परिवर्ती संस्कृतियों की नकल । दिन 2: पौंड आगर मीडिया से स्थानांतरण उत्परिवर्ती विकास गहरी अच्छी तरह से पौंड तरल शोरबा युक्त ब्लॉकों के लिए ९५० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात हो जाना । 3 दिन: मिश्रण ग्लिसरॉल के साथ रातोंरात पौंड संस्कृतियों, तो ९६ के लिए स्थानांतरण अच्छी तरह से लंबी अवधि के भंडारण के लिए गंतव्य प्लेटें । प्लेस ९६-अच्छी तरह से फ्लैट में प्लेटें-८० ° c फ्रीजर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: सेटअप अनुशंसित. बांझपन और चिकनी कार्यप्रवाह उचित सावधानियों के उपयोग के माध्यम से बनाए रखा जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

1. प्रोटोकॉल I: PA14NR सेट की प्रतिकृति

नोट: पुस्तकालय की प्रतिकृति PA14NR सेट सोलह प्लेटों प्रत्येक कि लगातार चार सप्ताह में संसाधित किया जा सकता है के चार सबसेट में विभाजित करके प्राप्त किया जा सकता है । 1 से 6 प्रतियों की जनरेशन, तालिका 1 में उल्लिखित साप्ताहिक कार्यप्रवाह का पालन करती है, जबकि 6 से अधिक प्रतियों की जनरेशन, तालिका 2 में उल्लिखित साप्ताहिक कार्यप्रवाह का अनुसरण करती है । PA14NR सेट की 12 प्रतियां उत्पंन करने के लिए, 2 दिन पर तरल पौंड मीडिया में एक ही PA14NR सबसेट inoculate और फिर 3 दिन पर (आगार प्लेटों के एक ही सेट से 1 दिन पर दोहराया), और 3 दिन और 4 दिन पर रात उत्परिवर्ती संस्कृतियों को कॉपी प्लेट में स्थानांतरण क्रमशः ।

दिन 0 Day 1 Day 2 Day 3
प्रस्तुत करने का दिन पौंड आगर मीडिया पर PA14NR सेट म्यूटेंट की वृद्धि लिक्विड पौंड मीडिया में PA14NR सेट म्यूटेंट की वृद्धि PA14NR सेट उत्परिवर्ती संस्कृतियों के गंतव्य प्लेटों के हस्तांतरण

तालिका 1: PA14NR सेट की 1-6 प्रतिलिपियों की प्रतिकृति केलिए शेड्यूल । प्रतिलिपियों की एक छोटी संख्या की प्रतिकृति एक साप्ताहिक वर्कफ़्लो का पालन कर सकते हैं ।

दिन 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4
प्रस्तुत करने का दिन पौंड आगर पर PA14NR सेट म्यूटेंट की वृद्धि तरल पौंड मीडिया में PA14NR सेट म्यूटेंट के बढे PA14NR सेट की 6 प्रतियां के 1 सेट उत्पंन करने के लिए 3 उत्परिवर्ती संस्कृतियों के दिन के हस्तांतरण दिन के हस्तांतरण 4 उत्परिवर्ती संस्कृतियों PA14NR सेट की 6 प्रतियां के 2 सेट उत्पंन करने के लिए
लिक्विड पौंड मीडिया में PA14NR सेट म्यूटेंट की वृद्धि

तालिका 2: PA14NR सेट की 12 प्रतियों तक की प्रतिकृति के लिए शेड्यूल। प्रतिलिपियों की एक बड़ी संख्या की प्रतिकृति एक साप्ताहिक कार्यप्रवाह के भीतर लेयरिंग की आवश्यकता होगी ।

  1. 1 दिन: पौंड आगर प्लेट्स पर PA14NR सेट मास्टर कॉपी की वृद्धि
    1. PA14NR सेट को संभालने के लिए दस्ताने, लैब कोट और मास्क पहनें ।
    2. स्पष्ट पीठ और ७०% इथेनॉल के साथ सतह पोंछ ।
    3. पौंड आगर मीडिया४३ तैयार करें और 25 मिनट के लिए आटोक्लेव में निष्फल । ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए शांत मीडिया जल स्नान में और या तो जोड़ने के लिए 15 µ जी/एमएल gentamicin, म्यूटेंट के लिए MAR2xT7 transposon संमिलन, या २०० µ जी/एमएल कनमीसिन युक्त, के लिए म्यूटेंट युक्त तमिलनाडुphoA सम्मिलन ।
    4. प्लेट प्रति मीडिया के लगभग ६० मिलीलीटर का उपयोग आयताकार प्लेटों में पिघला हुआ पौंड आगर डालो । उपयोग करने से पहले लगभग 1 ज के लिए एक बाँझ डाकू में सूखी प्लेटें । सुनिश्चित करें कि आगर की सतह पर पानी का कोई संघनित्र नहीं है । 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की दुकान, यदि आवश्यक हो ।
    5. इथेनॉल पोंछे पीठ शीर्ष पर एक Bunsen बर्नर के साथ एक बाँझ क्षेत्र बनाएँ और रेप्लिकेटर पिन नसबंदी के लिए उपयुक्त समाधान के साथ कंटेनरों की स्थापना की (चरण 1.1.9 देखें). रेप्लिकेटर पिन नसबंदी के लिए खुला प्लास्टिक कंटेनर (5.25 "एल x 4.25" डब्ल्यू एक्स 1.75 "एच अनुमानित आकार) का उपयोग करें । उपयोग करने से पहले आटोक्लेव प्लास्टिक कंटेनर ।
      नोट: Bunsen बर्नर लौ की गर्मी एक संवहन वर्तमान बनाता है, जो लौ के ऊपर अंतरिक्ष तपता है और हवा में किसी भी कण लिफ्टों और नीचे कूलर हवा से दूर, काम क्षेत्र बाँझ रखते हुए ।
    6. -८० ° c फ्रीजर से चार PA14NR सेट मास्टर प्लेटों की एक अधिकतम निकालें (अनावश्यक गल से बचने के लिए), और 4 एल आइस पैन में सूखी बर्फ पर उन्हें जगह.
    7. लो ९६-अच्छी तरह से मास्टर प्लेट सूखी बर्फ से दोहराया जा करने के लिए और यह बेंच पर जगह संक्षिप्त गल रही है, जो केवल रेप्लिकेटर पिन (लगभग 3-4 मिनट) (1.1.8 कदम देखें) की नसबंदी के लिए आवश्यक समय लगेगा अनुमति देने के लिए । A1 की स्थिति चिह्नित आगर प्लेट पर मुद्रांकन से पहले समंवय । ऊपरी बाएँ कोने में दोनों प्लेटों की A1 समंवय के साथ मास्टर प्लेट और आगर प्लेट संरेखित करें ।
    8. रेप्लिकेटर नीचे वर्णित चरणों का पालन करके "पिंस" निष्फल । अतिरिक्त तरल हटाने के लिए प्रत्येक चरण के बाद थोड़ा रेप्लिकेटर टैप करें ।
      1. 30 सेकंड के लिए 0.3-0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट (10% घरेलू ब्लीच) की २५० मिलीलीटर में पिन विसर्जित कर दिया । सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के साथ संपर्क को कम करें, क्योंकि यह पिन के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । २५० मिलीलीटर बाँझ ddH में विसर्जित कर दिया 10 सेकंड के लिए2हे या बाँझ ultrapure पानी, तो २५० मिलीलीटर ७०% में 30 सेकंड के लिए इथेनॉल, फिर २५० मिलीलीटर में ९५% इथेनॉल के लिए 2 मिनट.
      2. लौ Bunsen बर्नर लौ को सीधा रेप्लिकेटर धारण द्वारा रेप्लिकेटर पिंस निष्फल, धीरे इथेनॉल प्रज्वलित तक लौ आ रहा है, तो तुरंत लौ से इसे वापस लेने । लौ एक बार सभी इथेनॉल बंद जलता बुझा देंगे । एक ढक्कन या इसी तरह कंटेनर जलने इथेनॉल, यदि आवश्यक हो द्वारा बंद रखो ।
        नोट: एक लौ के पास इथेनॉल के साथ काम करते समय चरम सावधानी का प्रयोग करें । लौ पर सीधे रेप्लिकेटर धारण न करें ।
      3. 30 सेकंड के लिए आगर पौंड मीडिया युक्त एक अप्रयुक्त बाँझ आयताकार प्लेट पर लगाए द्वारा शांत पिन ।
    9. यह छीलने से पहले अपने हाथ से PA14NR सेट मास्टर प्लेट से संक्षेप में गर्म एल्यूमीनियम सील । रेप्लिकेटर पिन ठंडा करते समय ऐसा करें । एल्यूमीनियम सील हटाने के लिए ध्यान से प्लेट परिष्करण से सील को रोकने के लिए । एल्यूमीनियम सील के किसी भी अवशेष छील करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें ।
    10. मास्टर प्लेट में रेप्लिकेटर पिन डालें, धीरे धक्का और सभी चार दिशाओं में रेप्लिकेटर झूल सुनिश्चित करें कि पिन ९६-कुओं में से प्रत्येक में जमे हुए बैक्टीरियल संस्कृतियों के साथ संपर्क बनाने के लिए । प्लेट के किनारे स्थित कुओं में जमे हुए संस्कृतियों के खिलाफ रेप्लिकेटर पिन धकेलने से प्लेट के बाहरी किनारे में स्थित कुओं पर अतिरिक्त ध्यान देना.
    11. धीरे आगर प्लेट की सतह पर रेप्लिकेटर पिन जगह है । एक मामूली परिपत्र गति में रेप्लिकेटर चाल के लिए मिनी फार्म प्रत्येक उत्परिवर्ती तनाव के लिए लगभग 4-5 mm के लॉन । संभावना है कि मिनी लॉन ओवरलैप कर सकते हैं, पार संदूषण से बचने के लिए बचें ।
    12. सील PA14NR एक नया बाँझ एल्यूमीनियम सील के साथ मास्टर प्लेट सेट । किसी भी बिंदु पर एल्यूमीनियम सील के चिपकने वाला पक्ष को संक्रमण से बचने के लिए मत छूना । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से और प्लेट के किनारों को पूरी तरह से एक प्लेट रोलर का उपयोग करके बंद कर रहे हैं । वापसी ९६-अच्छी तरह से बर्फ सूखी थाली ।
    13. दोहराएं प्रक्रिया प्रत्येक मास्टर प्लेट के लिए ।
    14. PA14NR सेट को संभालने के बाद ७०% इथेनॉल के साथ सभी काम सतहों नीचे पोंछ ।
    15. स्थानांतरण प्रतिकृति ३७ ° c मशीन के लिए प्लेटें और रात भर मशीन ।
  2. 2 दिन: PA14NR सेट की वृद्धि में पौंड तरल शोरबा मास्टर कॉपी
    1. तैयार पौंड तरल शोरबा४३ या तो 15 µ जी/एमएल gentamicin युक्त, म्यूटेंट के लिए MAR2xT7 transposon सम्मिलन, या २०० µ जी/एमएल कनमीसिन युक्त म्यूटेंट के लिए, तमिलनाडुphoA निवेशन शामिल हैं ।
    2. स्पष्ट अनावश्यक उपकरणों के लामिना प्रवाह हूड और बारी हूड ब्लोअर पर 10 मिनट की एक ंयूनतम के लिए शुरू करने से पहले काम करते हैं । हुड सतहों नीचे पोंछ और किसी भी आइटम ७०% इथेनॉल का उपयोग कर हुड में रखा ।
    3. एक 50-1200 µ l 12-चैनल इलेक्ट्रॉनिक पिपेट का उपयोग कर लामिना फ्लो हूड में उचित एंटीबायोटिक युक्त पौंड तरल शोरबा के ५२५ µ एल के साथ 2 मिलीलीटर दीप अच्छी तरह से ब्लॉकों भरें । फिर, स्थानांतरण मीडिया से भरा गहरा-अच्छी तरह से इथेनॉल पोंछे बेंच शीर्ष करने के लिए ब्लॉकों । जब तक बाँझ शर्तों बनाए रखा है पुनः प्रयोग युक्तियाँ ।
    4. दस्ताने, लैब कोट पहनते हैं, और PA14NR सेट को संभालने के लिए मुखौटा ।
    5. स्पष्ट पीठ और ७०% इथेनॉल के साथ सतह पोंछ ।
    6. एक बेंच शीर्ष करने के लिए रात भर में उगाया उत्परिवर्ती उपभेदों के साथ आगर प्लेट लाओ ।
    7. इथेनॉल पोंछे पीठ शीर्ष पर एक Bunsen बर्नर के साथ एक बाँझ क्षेत्र बनाएँ और रेप्लिकेटर पिन नसबंदी के लिए उपयुक्त समाधान के साथ कंटेनरों की स्थापना की (अगला कदम देखें).
    8. नीचे बताए गए चरणों का पालन करते हुए रेप्लिकेटर "पिंस" को निष्फल करें । अतिरिक्त तरल हटाने के लिए प्रत्येक विसर्जन के बाद थोड़ा रेप्लिकेटर टैप करें ।
      1. 30 सेकंड के लिए 0.3-0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट की २५० मिलीलीटर में पिन विसर्जित कर दिया । सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के साथ रेप्लिकेटर पिन संपर्क को कम करें, क्योंकि यह पिन के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. फिर, 10 सेकंड के लिए २५० मिलीलीटर बाँझ ddH2O या ultrapure पानी में पिन विसर्जित कर दिया, फिर में २५० मिलीलीटर में 30 सेकंड के लिए ७०% इथेनॉल, तो के २५० मिलीलीटर में ९५% इथेनॉल के लिए 2 मिनट.
      2. लौ 30 सेकंड के लिए पौंड मीडिया से युक्त अप्रयुक्त आयताकार प्लेट में लगाए द्वारा तो शांत पिन, रेप्लिकेटर पिन निष्फल ।
        नोट: एक लौ के पास इथेनॉल के साथ काम करते समय चरम सावधानी का प्रयोग करें (1.1.8 देखें) ।
    9. धीरे रेप्लिकेटर पिन पर जगह है उत्परिवर्ती विकास युक्त प्लेट और जांच करें कि पिन आगर प्लेट पर सभी ९६ म्यूटेंट के साथ संपर्क में हैं, तो पौंड तरल शोरबा युक्त गहरे कुओं में पिन जलमग्न । पिन के साथ कुओं के पक्षों को छूने से बचें ।
    10. एक बाँझ सांस सील झिल्ली के साथ गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक सील । एक प्लेट रोलर का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रत्येक व्यक्ति को अच्छी तरह से सील है ।
    11. दोहराएं प्रक्रिया प्रत्येक आगर प्लेट के लिए ।
    12. PA14NR सेट को संभालने के बाद ७०% इथेनॉल के साथ सभी काम सतहों नीचे पोंछ ।
    13. 15-16 के लिए inoculated तरल संस्कृतियों हो जाना 37 ° c में ९५० rpm पर एक उच्च गति के बरतन का उपयोग कर, यदि उपलब्ध है ।
      नोट: यदि एक उच्च गति शेखर उपलब्ध नहीं है, 250-300 rpm पर शेखर में गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक की मशीन संभव है । हालांकि, छोटे कॉलोनी वेरिएंट (SCVs) की एक बड़ी संभावना है कि कम ऑक्सीजन की स्थिति के तहत25 उभर रहे हैं । इसलिए, यह अत्यधिक सलाह दी जाती है 15-16 घंटे के तहत मशीन समय रखने के लिए जब गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक में बढ़ती संस्कृतियों कम शेखर गति पर । उत्परिवर्ती कुओं में SCVs के अवांछित प्रसार उत्परिवर्ती phenotypes बदल जब पुस्तकालय का उपयोग करने के लिए आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन कर सकते हैं ।
      PA14NR सेट में कुछ कुओं धीमी गति से बढ़ रही/गैर बढ़ती म्यूटेंट, लापता क्लोन, या uninoculated मीडिया शामिल हैं । इन कुओं का स्थान दर्ज किया गया है और इस प्रकाशन के साथ शामिल पूरक PA14NR सेट वेल्स जानकारी फ़ाइल में पाया जा सकता है ।
  3. 3 दिन: PA14NR का स्थानांतरण गंतव्य प्लेटों में रातोंरात संस्कृतियों सेट
    1. स्पष्ट लामिना फ्लो हूड और बारी पर हूड ब्लोअर 10 मिनट की एक ंयूनतम के लिए शुरुआत काम से पहले । हुड सतहों नीचे पोंछ और किसी भी आइटम ७०% इथेनॉल का उपयोग कर हुड में रखा ।
    2. प्रिंट चिपकने वाला पनरोक लेबल (देखें पूरक PA14NR सेट लेबल फ़ाइल टेंपलेट के लिए) । निकालें ९६-अच्छी तरह से एक लामिना प्रवाह हुड के अंदर प्लास्टिक की चादर से प्लेटें । छील बंद प्लेट लेबल और यह थाली की बढ़त के साथ स्थान के निकटतम करने के लिए गंतव्य प्लेट के H1 कुओं को A1 । थोड़ा गंतव्य प्लेट के ढक्कन उठा और निचले किनारे पर लेबल जगह जब थाली ढक्कन के साथ कवर किया जाता है लेबल प्रदर्शित करने के लिए ।
    3. ६०% ग्लिसरॉल (v/v) के ३.५ L तैयार करें और आटोक्लेव में 20 मिनट का बंध्याकरण ।
    4. दस्ताने, लैब कोट पहनते हैं, और PA14NR सेट को संभालने के लिए मुखौटा । उच्च गति के बरतन या नियमित रूप से शेखर से गहरी अच्छी तरह से ब्लॉकों निकालें ।
    5. स्थानांतरण गहरी अच्छी तरह से बाँझ लामिना प्रवाह हुड के लिए ब्लॉकों और ध्यान से सांस सील झिल्ली को हटा दें । एल्यूमीनियम सील के साथ बदलें । स्पिन-बहुत कम गति से गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक नीचे (50-150 एक्स जी पर 30 सेकंड, तो धीमा त्वरित पर ब्रेक केंद्रापसारक होने से) संघनित्र इकट्ठा करने के लिए ।
    6. स्थानांतरण गहरी अच्छी तरह से बाँझ डाकू को वापस ब्लॉकों और एक 50-1200 µ एल 12 चैनल इलेक्ट्रॉनिक पिपेट और बाँझ फ़िल्टर युक्तियों का उपयोग कर जोड़ें ५२५ µ एल के ग्लिसरॉल/पौंड तरल शोरबा मिश्रण (बराबर भागों £ तरल शोरबा और ६०% ग्लिसरॉल समाधान) के लिए एक अच्छी तरह से । मिश्रण धीरे से pipetting ३०० µ l ऊपर और नीचे इलेक्ट्रॉनिक पिपेट के साथ 3 बार । टपकता रोकने के लिए युक्तियाँ निकालने से पहले अच्छी तरह से युक्तियों को स्पर्श करें. युक्तियां निकालें और पूरी गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक के साथ किया जब तक अगली पंक्ति के साथ जारी रखें ।
    7. 12-चैनल इलेक्ट्रॉनिक दोहराव पिपेट और फ़िल्टर किए गए सुझावों का उपयोग करना, aliquoting के दौरान अच्छी तरह से संक्रमण को रोकने के लिए, उत्परिवर्ती संस्कृति के ९०० µ एल को खींचने और प्रत्येक ९६ अच्छी तरह से गंतव्य प्लेटों में १५० µ एल वितरण पुस्तकालय प्लेट की 6 प्रतियां उत्पन्न करने के लिए । गंतव्य प्लेटों में संस्कृति के हस्तांतरण शुरू करने से पहले सुझावों के साथ कुओं की दीवार को छूने से ड्रिप रोकें । यदि कोई दोहराने पिपेट उपलब्ध है, एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए ६ ९६ के प्रत्येक में १५० µ एल वितरण-अच्छी तरह से प्लेटें, टपकाव को रोकने के ऊपर वर्णित तकनीक का उपयोग कर ।
    8. प्लेटों को कवर और पूरी तरह से प्लेट किनारों और सभी कुओं को सील करने के लिए एक प्लेट रोलर का उपयोग करने के लिए बाँझ एल्यूमीनियम जवानों का प्रयोग करें । सुनिश्चित करें कि एल्यूमीनियम सील के साथ लेबल पहचानकर्ता को कवर नहीं है । प्लेटें हिला मत करो, के रूप में संस्कृति कुओं के किनारों पर या एल्यूमीनियम सील पर छप सकता है ।
    9. एक फ्लैट पर हूड और जगह प्लेटों से सील प्लेटें निकालें, यहां तक कि सतह-८० ° c फ्रीजर में ।
    10. ७०% इथेनॉल के साथ सभी काम सतहों नीचे पोंछ पुस्तकालय से निपटने के बाद ।
    11. लायब्रेरी प्रतिकृति करने के बाद और आनुवंशिक स्क्रीन (देखें प्रोटोकॉल III) करने के लिए लायब्रेरी का उपयोग करने के बाद गुणवत्ता नियंत्रण जाँच निष्पादित करें ।

2. प्रोटोकॉल द्वितीय: हैंडलिंग और PA14NR सेट से व्यक्तिगत म्यूटेंट के भंडारण

  1. 1 दिन: ब्याज की लकीर उत्परिवर्ती
    1. PA14NR सेट लिंक http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS या अनावश्यक पुस्तकालय का उपयोग कर के माध्यम से ब्याज की उत्परिवर्ती के स्थान की पहचान करें. xls फ़ाइल लिंक से डाउनलोड किया http:// pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi) । हर विशेष उत्परिवर्ती (gentamicin या कनमीसिन) का चयन करने के लिए आवश्यक एंटीबायोटिक का एक नोट बनाओ ।
    2. पौंड आगर मीडिया तैयार, 20-25 मिनट के लिए आटोक्लेव में बंध्याकरण, और जल स्नान में ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए शांत । म्यूटेंट के लिए 15 µ g/ml gentamicin को जोड़ें जिसमें MAR2xT7 transposon सम्मिलन, और २०० µ g/एमएल कनमीसिन के लिए म्यूटेंट युक्त तमिलनाडुphoA transposon सम्मिलन शामिल हैं. प्लेटों पर पौंड आगर मीडिया डालो (गोल या आयताकार प्लेट पर्याप्त हैं) । उपयोग करने से पहले लगभग 30 मिनट के लिए 1 एच के लिए बाँझ हूड में सूखी प्लेटें ।
    3. आटोक्लेव सभी plasticware और गैर बाँझ आपूर्ति का उपयोग करने से पहले ।
    4. दस्ताने, लैब कोट पहनते हैं, और PA14NR सेट को संभालने के लिए मुखौटा । स्पष्ट पीठ और PA14NR सेट के साथ काम करने से पहले ७०% इथेनॉल के साथ सतह पोंछ ।
    5. एक Bunsen बर्नर के साथ एक बाँझ क्षेत्र बनाएँ ।
    6. निकालें PA14NR सेट ९६-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ब्याज के उत्परिवर्ती के साथ अच्छी तरह से थाली और सूखी बर्फ पर जगह है, बेंच करने के लिए सूखी बर्फ कंटेनर ले, और संक्षेप में बेंच के शीर्ष पर ९६ अच्छी तरह से थाली जगह थोड़ी सी गल (लगभग 1-2 मिनट) की अनुमति ।
      नोट: सभी PA14NR सेट का एक रिकॉर्ड रखें ९६-अच्छी तरह से प्लेट व्यक्तिगत म्यूटेंट तक पहुँचा, पुस्तकालय प्लेटों के लिए अधिक उपयोग के रूप में अच्छी तरह से संदूषण के लिए एक बड़ा जोखिम के साथ संबंधित है.
    7. इसे छीलने से पहले हाथ से गर्म एल्यूमीनियम सील, थाली परिष्करण से सील को रोकने के लिए सावधान किया जा रहा है । एल्यूमीनियम सील के किसी भी अवशेष छील करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें ।
    8. ९६-अच्छी तरह से थाली पर ब्याज की उत्परिवर्ती खोजें । या तो बाँझ लकड़ी के छड़ी या बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए अच्छी तरह से ब्याज की उत्परिवर्ती युक्त व्यक्ति से जमे हुए संस्कृति की एक छोटी राशि लेने के लिए ।
    9. एकल उत्परिवर्ती कालोनियों के लिए आगर प्लेट पर लकीर जमी संस्कृति के रूप में इस प्रकार है: धीरे प्लेट के एक वर्ग पर बैक्टीरिया फैला करने के लिए 1 लकीर बनाने के लिए, एक ताजा, बाँझ लकड़ी के छड़ी या पिपेट टिप का उपयोग कर, 1 लकीर के माध्यम से खींचें और के एक दूसरे खंड पर बैक्टीरिया फैल थाली, 2 लकीर बनाने के लिए । एक तिहाई बाँझ लकड़ी छड़ी या पिपेट टिप का उपयोग करना, 2 लकीर के माध्यम से खींचें और प्लेट के अंतिम खंड पर बैक्टीरिया फैला, लकीर 3 बनाने के लिए.
    10. सील स्रोत प्लेट एक नया बाँझ एल्यूमीनियम सील के साथ. किसी भी बिंदु पर एल्यूमीनियम सील के चिपकने वाला पक्ष को संक्रमण से बचने के लिए मत छूना । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से और प्लेट के किनारों को पूरी तरह से एक प्लेट रोलर का उपयोग करके बंद कर रहे हैं । वापसी ९६-अच्छी तरह से बर्फ सूखी और फिर-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर प्लेट ।
    11. ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन रातोंरात में मशीन आगर प्लेट ।
    12. ७०% इथेनॉल के साथ सभी काम सतहों नीचे पोंछ पुस्तकालय से निपटने के बाद ।
  2. दिन 2: पौंड तरल शोरबा में ब्याज की उत्परिवर्ती की वृद्धि
    1. transposon प्रविष्टि के अनुसार 15 µ g/ml gentamicin या २०० µ g/ml कनमीसिन युक्त लिक्विड पौंड शोरबा तैयार करें ।
    2. दस्ताने, लैब कोट, और मास्क पहनें पी. aeruginosaसंभाल करने के लिए ।
    3. स्पष्ट पीठ और ७०% इथेनॉल के साथ सतह पोंछ । एक Bunsen बर्नर के साथ एक बाँझ क्षेत्र बनाएँ ।
    4. कैप के साथ बाँझ संस्कृति ट्यूब में उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ पौंड शोरबा के 3-5 मिलीलीटर स्थानांतरण ।
    5. एक बाँझ applicator या एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करना, उत्परिवर्ती तनाव की एक एकल कॉलोनी लेने और पौंड मीडिया में यह inoculate.
    6. एक शेखर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर २२५-२५० rpm को रातोंरात गर्मी पौंड तरल संस्कृतियों ।
    7. पी aeruginosaहैंडलिंग के बाद ७०% इथेनॉल के साथ सभी काम सतहों पोंछ ।
  3. 3 दिन: में ब्याज की दुकान उत्परिवर्ती-८० ° c फ्रीजर
    1. उत्परिवर्ती नाम के साथ लेबल cryovial, एंटीबायोटिक पौंड शोरबा और भंडारण की तारीख को जोड़ा ।
    2. ५०% ग्लिसरॉल (v/v) के ५०० मिलीलीटर तैयार करें और आटोक्लेव में निष्फल ।
    3. दस्ताने, लैब कोट, और मास्क पहनें पी. aeruginosaसंभाल करने के लिए ।
    4. स्पष्ट पीठ और/या लामिना बाढ़ हूड और ७०% इथेनॉल के साथ सतह पोंछ ।
    5. दूर शेखर से उत्परिवर्ती संस्कृति युक्त ट्यूब निकालें ।
    6. सूखी बर्फ के साथ एक छोटा सा कंटेनर तैयार करें ।
    7. एक लामिना प्रवाह हुड का प्रयोग करें या Bunsen बर्नर के साथ इथेनॉल पोंछे बेंच शीर्ष पर एक बाँझ क्षेत्र बनाने के ।
    8. बैक्टीरियल संस्कृति और ५०% ग्लिसरॉल की मात्रा के बराबर बाँझ स्थितियों का उपयोग cryovial लेबल जोड़ें, और धीरे पिपेट के साथ मिश्रण (अंतिम मात्रा 1-2 मिलीलीटर/शीशी इस्तेमाल किया cryovials के आकार पर निर्भर करता है) । सूखी बर्फ पर cryovial प्लेस जल्दी से फ्रीज ।
    9. cryovial में लेबल बॉक्स में प्लेस-८० ° c फ्रीजर ।
    10. पी aeruginosa हैंडलिंग के बाद ७०% इथेनॉल के साथ सभी कार्य सतहों को मिटा दें ।

3. प्रोटोकॉल III: PA14NR सेट की गुणवत्ता नियंत्रण

  1. का चयन करें यादृच्छिक सेट से म्यूटेंट की नई प्रतिकृति संभव अच्छी तरह से संक्रमण का पता लगाने के लिए प्लेटों (परीक्षण के 30-40 म्यूटेंट की सिफारिश की है).
    नोट: मामलों में जहां यह एक उत्परिवर्ती एक विशिष्ट जीन के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है की पहचान की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है, यह है कि जीन के ज्ञात अनुक्रम के लिए डिज़ाइन किया गया का उपयोग कर पीसीआर प्रवर्धन करने की सिफारिश की है जीन transposon लन. हालांकि अधिक चुनौतीपूर्ण, मनमाने ढंग से पीसीआर प्राइमरों के बजाय जीन विशिष्ट पीसीआर प्राइमरों का उपयोग कर के लाभ जब transposon म्यूटेंट से amplyfing डीएनए टुकड़े बड़े पैमाने उत्परिवर्ती पुष्टि और क्षमता की उपस्थिति का पता लगाने की क्षमता में आसानी शामिल Contaminants. गुणवत्ता नियंत्रण प्रयोजनों के लिए, यह सभी बेतरतीब ढंग से slected म्यूटेंट के लिए उच्च गुणवत्ता पीसीआर अनुक्रमण डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है, म्यूटेंट की एक पर्याप्त संख्या त्रुटि दर का आकलन करने के लिए जांच कर रहे हैं के रूप में लंबे समय के रूप में.
  2. "प्रोटोकॉल द्वितीय" लकीर और उत्परिवर्ती उपभेदों बढ़ने के लिए का पालन करें ।
  3. आटोक्लेव सभी plasticware और गैर बाँझ आपूर्ति का उपयोग करने से पहले ।
  4. पसंदीदा विधि द्वारा जीनोमिक डीएनए को अलग । इस काम में वर्णित विश्लेषण के लिए, एक जीनोमिक डीएनए आइसोलेशन किट के बाद निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था । एकाधिक उत्परिवर्ती उपभेदों एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है ।
  5. उपाय जीनोमिक डीएनए एकाग्रता एक microvolume spectrophotometer का उपयोग कर । समायोजित जीनोमिक डीएनए एकाग्रता के लिए लगभग १०० एनजी/µ एल
  6. जीनोमिक डीएनए का प्रयोग करें टेंपलेट के रूप में "PCR1 प्रतिक्रिया" चलाने के लिए 3 तालिका के चरण 1 में वर्णित के रूप में, Arb1 पीसीआर टुकड़े पैदा (चित्र 3) । इस चरण के लिए प्राइमरों तालिका 4 में सूचीबद्ध हैं ।
  7. PCR1 प्रतिक्रिया के 5 µ एल करने के लिए 10x लदान बफर के ०.५ µ एल जोड़ें, एक 1.5-2% agarose जेल में लोड और 80-150 V पर जेल चलाते हैं ।
    नोट: एक विशिष्ट टुकड़ा लंबाई या एक विशेष अंश श्रेणी अपेक्षित नहीं है, और एक से अधिक बैंड के रूप में मौजूद हो सकता है मनमाना प्राइमरी एकाधिक स्थानों के लिए बाध्य कर सकते हैं ।
  8. PCR1 प्रतिक्रिया से डीएनए का उपयोग करें के रूप में "PCR2 प्रतिक्रिया" चलाने के लिए तालिका 3 के चरण 2 में वर्णित के रूप में, Arb2 पीसीआर अंशों (चित्र 3) जनरेट कर रहा है । इस चरण के लिए प्राइमरों तालिका 4 में सूचीबद्ध हैं ।
  9. PCR2 प्रतिक्रिया के 5 µ एल करने के लिए 10x लदान बफर के ०.५ µ एल जोड़ें, एक 1.5-2% agarose जेल में लोड, और जेल में चला 80-150 V.
    नोट: एक विशिष्ट टुकड़ा लंबाई या एक विशेष अंश श्रेणी अपेक्षित नहीं है, और एक से अधिक बैंड के रूप में मौजूद हो सकता है मनमाना प्राइमरी एकाधिक स्थानों के लिए बाध्य कर सकते हैं ।
  10. अनुक्रमण के लिए उपयुक्त transposon-विशिष्ट प्राइमर के साथ साथ PCR2 प्रतिक्रिया भेजें ।
  11. Analize अनुक्रमण परिणाम PA14NR लाइब्रेरी वेबसाइट (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) पर प्रदान की ब्लास्ट लिंक का उपयोग कर या सीधे उन्हें विशिष्ट जीन अनुक्रम के खिलाफ नष्ट द्वारा पूरा PA14 जीनोम के खिलाफ उन्हें byBLASTing ब्याज की उत्परिवर्ती ।
    नोट: चयनित म्यूटेंट के बारे में जानकारी PA14NR सेट वेबसाइट (खोज http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS या अनावश्यक लाइब्रेरी. xls फ़ाइल लिंक से डाउनलोड करें http:/खोज द्वारा पाया जा सकता है /pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi) ।

Figure 3
चित्र 3: transposon लन म्यूटेंट के पीसीआर प्रवर्धन और अनुक्रमण । उत्परिवर्ती पहचान के सत्यापन के लिए पीसीआर प्रवर्धन और अनुक्रमण में शामिल कदम का योजनाबद्ध दृश्य । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पीसीआर रिएक्शन सेट अप
चरण 1 चरण 2
PCR1 प्रतिक्रिया: PCR2 प्रतिक्रिया:
२३.२५ µ l जल (आणविक जीवविज्ञान ग्रेड) १९.१५ µ l जल (आणविक जीवविज्ञान ग्रेड)
3 µ l 10x Taq पोलीमरेज़ बफर 5 µ l 10x Taq पोलीमरेज़ बफर
०.५ µ l Taq पोलीमरेज़ ०.६ µ l Taq पोलीमरेज़
०.६२५ µ l 20 µ m प्राइमरी Arb1D (तालिका 4) ०.६२५ µ l 20 µ m प्राइमरी Arb2A (तालिका 4)
०.६२५ µ l 20 µ m Transposon-िविश प्राइमरी (PMFLGM. GB 3 ए या Tn5Ext) (तालिका 4) ०.६२५ एमएल 20 µ एम Transposon-विशिष्ट प्राइमरी (PMFLGM. GB 2a या Tn5Int2) (तालिका 4)
1 µ l 10 mM dNTPs 1 µ l 10 mM dNTPs
1 µ l जीनोमिक डीएनए, १०० एनजी 5 µ l PCR1 प्रतिक्रिया
30 µ एल अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 30 µ एल अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा
पीसीआर रिएक्शन सेटिंग्स
PCR1 Thermocycler शर्तें: PCR2 Thermocycler की स्थिति:
९५ ° c – 2 min ९५ ° c – 2 min
दोहराएँ 5 चक्र: 30 चक्र दोहराएँ:
९५ ° c – 30 s ९५ ° c – 30 s
30 ° c – 1 min ५४ ° c – 30 s
७२ ° c – 1 min ७२ ° c – १.५ min
30 चक्र दोहराएँ: ७२ ° c – 10 min
९५ ° c – 30 s 4 ° c – होल्ड करें
४५ ° c – 30 s
७२ ° c – 1 min
७२ ° c – 10 min
4 ° c – होल्ड करें

तालिका 3: पीसीआर प्रतिक्रिया सेट अप और thermocycler शर्तों मनमाने ढंग से पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया। मनमाने ढंग से पीसीआर प्रतिक्रियाओं क्रमिक रूप से किया जाता है, और PCR1 प्रतिक्रिया के दौरान उत्पन्न टुकड़े PCR2 प्रतिक्रिया में टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है. विशिष्ट thermocycler सेटिंग्स प्रतिक्रियाओं के प्रत्येक सेट के लिए उपयोग किया जाता है ।

प्राइमरी का नाम प्राइमरी सीक्वेंस
MAR2xT7 Transposon-विशिष्ट प्राइमर
PMFLGM । जीबी-3 ए TACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM । GB-2a TGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 Transposon sequencing प्राइमर
PMFLGM । जीबी-4a GACCGAGATAGGGTTGAGTG
तमिलनाडुphoA Transposon-विशिष्ट प्राइमर
Tn5Ext GAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2 GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
तमिलनाडुphoA Transposon sequencing प्राइमर
Tn5Int CGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
मनमानी प्राइमरों
ARB1D GGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2A GGCCAGGCCTGCAGATGATG

तालिका 4: गुणवत्ता नियंत्रण में प्रयुक्त प्राइमरों की सूची गडबड है । पीसीआर प्रवर्धन और transposon प्रविष्टि म्यूटेंट के अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल के लिए उत्परिवर्ती पहचान की पुष्टि करें ।

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Representative Results

PA14NR सेट की बारह नई प्रतियां प्रोटोकॉल I का उपयोग करते हुए दोहराया गया था, और एक गुणवत्ता नियंत्रण मूल्यांकन नई प्रतियां उत्पंन की प्रोटोकॉल III का उपयोग कर आयोजित किया गया था ।

PA14NR सेट उत्परिवर्ती प्लेटें नियंत्रण प्लेटों के साथ, जो जंगली प्रकार PA14 inoculated और uninoculated वेल्स intercalated से मिलकर एक पूर्व निर्धारित पैटर्न में (चित्र 4a), प्रोटोकॉल मैं में वर्णित methology निंनलिखित प्रतिकृति थे । नियंत्रण प्लेट शामिल हैं प्लेट प्रतिकृति प्रदर्शन करते समय संभव well दूषण का मूल्यांकन करने के लिए सेट PA14NR में । साथ ही, नियंत्रण प्लेट्स transposon सम्मिलन म्यूटेंट युक्त प्लेट तक पहुँचने से पहले प्रतिकृति तकनीकों का अभ्यास करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । नियंत्रण प्लेटों के विकास नेत्रहीन की उंमीद की वृद्धि पैटर्न (चित्रा 4B) की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए पौंड आगर प्लेटें और रात के लिए मशीन पर प्रतिकृति के बाद निरीक्षण किया गया था । उपस्थिति या गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक inoculated नियंत्रण प्लेट 1 के साथ में बैक्टीरियल विकास के अभाव spectrophotometer में६०० आयुध डिपो पढ़ने के द्वारा रातोंरात मशीन के बाद मूल्यांकन किया गया था । परिणामों ने वाइल्ड टाइप PA14 inoculated वेल्स में पर्याप्त वृद्धि दिखाई और uninoculated वेल्स में विकास का पूर्ण अभाव (चित्र 4c) । हालांकि जंगली प्रकार PA14 संस्कृतियों के विकास में कुछ परिवर्तनशीलता था, वहां uninoculated वेल्स (चित्रा 4d) में वृद्धि का पूरा अभाव था ।

३८ उत्परिवर्ती उपभेदों बेतरतीब ढंग से PA14NR सेट की नई उत्पंन प्रतियां में से एक से चुना अनुक्रमण डीएनए मनमाने ढंग से पीसीआर द्वारा उत्पंन अंशों द्वारा विश्लेषण किया गया । मनमाने ढंग से पीसीआर प्रतिक्रियाओं को बाहर किया गया ३८ म्यूटेंट चयनित की transposon सम्मिलन के आसपास के क्षेत्रों से डीएनए टुकड़े बढ़ाना, और पीसीआर टुकड़े प्राप्त बाद में अनुक्रम थे । नौ अलग transposon लन म्यूटेंट के पीसीआर प्रवर्धन के बाद प्राप्त पीसीआर अंशों का एक उदाहरण चित्रा 5में दिखाया गया है । मनमाना प्राइमरों के एनीलिंग के रूप में यादृच्छिक पर होता है, टुकड़ा लंबाई की भविष्यवाणी नहीं की जा सकती । जब कोई बैंड नहीं दिखाई दे रहे थे, पीसीआर प्रतिक्रियाओं दोहराया गया । ३८ म्यूटेंट में निहित transposon सम्मिलन की पहचान PA14 transposon प्रविष्टि उत्परिवर्ती पुस्तकालय लिंक (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi) का उपयोग करने के लिए मनमाने ढंग से पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक प्राइमरों का प्रयोग पाया गया प्रतिक्रियाओं.

sequencing परिणाम ३८ उत्परिवर्ती उपभेदों से प्राप्त तनाव PA14 PA14NR पुस्तकालय वेबसाइट (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) पर प्रदान की ब्लास्ट लिंक का उपयोग कर के पूर्ण जीनोम के खिलाफ विस्फोट किया गया । बेतरतीब ढंग से चयनित म्यूटेंट से अनुक्रमण परिणाम भी जीन अनुक्रम है कि प्रत्येक व्यक्ति उत्परिवर्ती से संबंधित के खिलाफ गठबंधन किया गया (PA14NR सेट प्लेट स्थिति खोज उपकरण का उपयोग कर प्राप्त PA14NR पुस्तकालय वेबसाइट पर पाया http:// pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS) । अनुक्रम संरेखण NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi द्वारा प्रदान की गई संरेखित अनुक्रम न्यूक्लियोटाइड विस्फोट उपकरण का उपयोग करते हुए किया गया? पृष्ठ = MegaBlast एवं कार्यक्रम = blastn एवं BLAST_PROGRAMS = MegaBlast एवं PAGE_TYPE = BlastSearch एवं BLAST_SPEC = blast2seq एवं डाटाबेस = n/a & क्वेरी = & विषय =) ।

३८ म्यूटेंट के दो चयनित कम गुणवत्ता अनुक्रम परिणाम उत्पंन, शायद transposon प्रविष्टि युक्त क्षेत्र में उच्च जीसी सामग्री के कारण, और आगे का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है । अनुक्रम का परिणाम ३५ से ३६ दिखायेंगे अनुक्रम म्यूटेंट PA14NR सेट म्यूटेंट चयनित करने के लिए इसी जीन की अनुक्रम मिलान । ३६ दृश्यों से बाहर केवल एक जीन है कि उत्परिवर्ती चयनित करने के लिए संगत के अनुक्रम मैच में विफल रहा है । हालांकि, यह PA14NR सेट की नई प्रतिलिपियों की प्रतिकृति के दौरान उत्पंन हुई या २.८% त्रुटि को PA14NR सेट३७के लिए पहले अनुमान लगाया जा सका करने के लिए जिंमेदार ठहराया जा सका के दौरान हुई समस्या से परिणामस्वरूप यह विसंगति स्थापित नहीं किया गया था ।

Figure 4
चित्र 4: PA14NR नियंत्रण प्लेट सेट करें. एक) PA14NR सेट नियंत्रण प्लेटें 1 और 2 के लेआउट । ख) PA14 की तस्वीर NR सेट नियंत्रण प्लेटें 1 और 2 पौंड आगर पर दोहराया (आगर प्लेट के ऊपर से देखें). ग) औसत बैक्टीरियल विकास (+/-SD) गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक में रात भर की मशीन के बाद नियंत्रण प्लेट 1 के inoculated और uninoculated कुओं में मापा । रीडिंग ओडी६००पर प्रदर्शन किया गया । घ) बैक्टीरियल विकास inoculated और नियंत्रण प्लेट 1 के uninoculated कुओं में गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक में रातोंरात मशीन के बाद मापा । रीडिंग ओडी६०० में व्यक्तिगत कुओं में प्रदर्शन किया गया । यहां तक कि कॉलम uninoculated कुओं में प्रदर्शन माप के अनुरूप; विषम कॉलम PA14-inoculated कुओं में प्रदर्शन माप के अनुरूप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं से प्राप्त PCR1 और PCR2 टुकड़े. मनमाने ढंग से पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर प्राप्त टुकड़े का उदाहरण । गलियों में टुकड़े 1-9 PA14NR सेट की गुणवत्ता नियंत्रण करने के लिए यादृच्छिक पर चयनित अलग म्यूटेंट के अनुरूप प्लेटें प्रतिरूपित । MWM: डीएनए आणविक वजन मार्कर । डीएनए MWM आकार आधार जोड़े में हैं ।
PA14NR सेट उत्परिवर्ती उपभेदों का परीक्षण किया: लेन 1:07_4 A10, लेन 2:07_4 B4, लेन 3:08_1 C3, लेन 4:08_1 H6, लेन 5:08_3 G10, लेन 6:08_4 B8, लेन 7:08_4 H3, लेन 8:09_2 D12, लेन 9 : 09_2 G5 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

पी. aeruginosa PA14NR सेट वैज्ञानिक समुदाय के लिए एक मूल्यवान संसाधन है । मार्च २०१७ के अनुसार Clarivate ' विश्लेषिकी आवश्यक विज्ञान संकेतक डाटाबेस से डेटासेट, Liberati एट अल । (२००६) ३७, जो PA14NR सेट के निर्माण का वर्णन करता है, माइक्रोबायोलॉजी प्रकाशनों के शीर्ष 1% में स्थान है । Google विद्वान Liberati एट अल के ६०० प्रशस्ति पत्र पर रिपोर्ट । (२००६) अगस्त २०१७ के रूप में मूल पांडुलिपि । पुस्तकालय ने aeruginosa रोगजनन अंतर्निहित तंत्र को elucidating में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । महत्वपूर्ण बात, PA14NR सेट के ९६ अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप उच्च प्रवाह आनुवंशिक के लिए Pकी एक किस्म का अध्ययन डिजाइन स्क्रीन की सुविधा । aeruginosa उत्परिवर्ती phenotypes४४,४५,४६. के रूप में PA14NR सेट वितरण के लिए उपलब्ध है, विशेष सावधानियों का उपयोग इस संसाधन की अखंडता को बनाए रखने के लिए किया जाना चाहिए ।

प्रकाशनों की एक संख्या आनुवंशिक स्क्रीन३७,३८,४७,४८में सेट PA14NR का उपयोग करने की उपयोगिता प्रदर्शित करता है । उदाहरण के लिए, पुस्तकालय की उपयोगिता के एक प्रारंभिक परीक्षण के रूप में, Liberati एट अल एक परमवीर चक्र (polyvinyl क्लोराइड) लगाव स्क्रीन, जो बैक्टीरिया की क्षमता के साथ संबद्ध करने के लिए ३७,३८फिल्म फार्म का प्रदर्शन किया ४७ , ४८. पुस्तकालय का स्वरूप भी जटिल आनुवंशिक लक्षण के अध्ययन जैसे बजबजा गतिशीलता, एक साधारण स्क्रीन४८में ब्याज की जीन के सैकड़ों की पहचान के द्वारा सबूत के रूप में अनुमति देता है । PA14NR सेट भी एक बड़े पैमाने पर मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित स्क्रीन के अधिग्रहण और बरकरार सेल proteome प्रोफ़ाइल स्पेक्ट्रा का विश्लेषण और मालदी की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था-तोफ एक टाइपिंग४७ इस तकनीक को लागू करने, शोधकर्ताओं कि transposon निवेशन से परिणाम है कि उन के रूप में मामूली जीनोमिक मतभेद, निर्धारित करने में सक्षम थे, जो नैदानिक और चिकित्सीय वातावरण में उपयोग किया जाता है टाइपिंग के लिए विघटनकारी प्रयास कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, PA14NR सेट के लिए एक जीनोम-वाइड स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था PA14 डाह की क्षीणन के लिए एक C. एलिगेंस संक्रमण मॉडल में, पहले से विलक्षण पी aeruginosa डाह की पहचान की अनुमति संबंधित जीन ३८, और जिससे होस्ट रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए PA14 लायब्रेरी के उपयोग का एक उदाहरण प्रदान कर रहा है ।

PA14NR सेट भी व्यक्तिगत म्यूटेंट के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन के रूप में कार्य करता है । पुस्तकालय के संक्रमण से बचने के लिए, ब्याज की म्यूटेंट तक पहुंचने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं की सिफारिश की जाती है । क्योंकि पुस्तकालय की हैंडलिंग संदूषण की संभावना बढ़ जाती है, यह व्यक्तिगत शीशियों में ब्याज की म्यूटेंट स्टोर करने के लिए PA14NR सेट काम करने और मास्टर प्रतियां के लिए उपयोग की सीमा की सिफारिश की है । इससे संदूषण रोकता है, पुस्तकालय की दीर्घायु में सुधार होता है, और निवेश की रक्षा करता है ।

महत्वपूर्ण PA14NR सेट संसाधन की अखंडता को बनाए रखने के लिए, यह सलाह दी जाती है कि PA14NR सेट के सभी प्राप्तकर्ता लाइब्रेरी की प्रतियां रसीद पर बनाएं । श्रेष्ठ प्रयासों के बावजूद, प्रतिकृति प्रक्रियाओं के दौरान अनजाने दूषण के लिए संभावित शामिल नहीं किया जा सकता । इसलिए, यह पुरजोर अनुशंसित है कि उपयोगकर्ताओं को पूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण लायब्रेरी प्रतिकृति के बाद और आनुवंशिक स्क्रीन करने के लिए लायब्रेरी का उपयोग करने के बाद की जांच करता है । यह भी दृढ़ता से सिफारिश की है कि उपयोगकर्ताओं को PA14NR के अतिरिक्त प्रतियां बनाने के लिए आनुवंशिक स्क्रीन के रूप में अच्छी तरह से प्रदूषित वृद्धि की संभावना प्रदर्शन सेट । इसके अलावा, 2-3 से अधिक आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया पुस्तकालय प्रतियां संपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण आकलन के अधीन किया जाना चाहिए । दुर्भाग्य से, पुस्तकालयों कि क्लोन या अच्छी तरह से संदूषण के नुकसान का अनुभव ठीक करने के लिए कोई उचित तरीका नहीं है । समझौता या दूषित प्रतियां छोड़ दी जानी चाहिए । एक परिणाम के रूप में, यह अनुशंसित है कि उपयोगकर्ताओं को नियमित प्रयोगशाला उपयोग के लिए पुस्तकालय की कई प्रतियां नकल, विचार है कि एक प्रति उपयोगी जीवन सीमित है । इसके अलावा यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता PA14NR सेट की अखंडता को बनाए रखने के लिए "मास्टर कॉपी" तक पहुंच सीमित करें ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रतिकृति तकनीकों का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं, जिसमें सेट-अप, प्रोटोकॉल और श्रेष्ठ अभ्यास शामिल हैं । प्रतिकृति प्रोटोकॉल PA14NR सेट के लिए वर्णित करने के लिए पुस्तकालय की 12 प्रतियां उत्पंन अनुकूलित किया जा सकता है और भी आसानी से अंय बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों को दोहराने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, कोई प्रकाशित की प्रक्रिया और तकनीक की प्रतिकृति, रखरखाव और बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के सत्यापन के लिए इस्तेमाल की विस्तृत विवरण के साथ तारीख को उपलब्ध प्रोटोकॉल हैं । हमें उंमीद है कि इन प्रोटोकॉल PA14NR सेट और अंय बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के उपयोगकर्ताओं को इन महत्वपूर्ण कार्यों को करने के लिए आवश्यक जानकारी के साथ प्रदान करेगा ।

पुस्तकालय उच्च प्रवाह स्क्रीन के लिए या व्यक्तिगत म्यूटेंट के लिए एक स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है या नहीं, यह समय पर उपयोग में प्रतिलिपि की अखंडता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसा करने के लिए, कर्मियों और पुन: प्रतिकृति या उत्परिवर्ती चयन तकनीक का आकलन करने के लिए पर्याप्त प्रशिक्षण आवधिक समय पर किया जाना चाहिए । PA14NR का उपयोग सेट नियंत्रण प्लेटों और नियमित पीसीआर प्रवर्धन और यादृच्छिक म्यूटेंट के अनुक्रमण के प्रदर्शन के लिए उनकी पहचान की पुष्टि अत्यधिक की सिफारिश की है । Liberati एल अल. (२००६) ३७ अनुमान लगाया गया है कि PA14NR सेट में म्यूटेंट की कुल संख्या का २.८% लेबल किया गया था, जो विशिष्ट transposon म्यूटेंट अनुक्रम की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया और किसी भी व्यापक अध्ययन को शुरू करने से पहले फ्रेम विलोपन म्यूटेंट उत्पंन करने के लिए और/ विशिष्ट जीन को शामिल अनुसंधान का प्रकाशन । आगे के अध्ययन के लिए पुस्तकालय प्रतिकृति और व्यक्तिगत म्यूटेंट के चयन के लिए उचित प्रोटोकॉल और तरीकों को देखते हुए, PA14NR सेट पी aeruginosa pathogenicity की समझ और संक्रमित के लिए नैदानिक परिणामों के सुधार के लिए योगदान देगा रोगियों.

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई वित्तीय संघर्ष की रिपोर्ट । Eliana Drenkard और फ्रेडरिक Ausubel ने रचना में भाग लिया PA14 निरर्थक transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय । ब्रायन हर्ले और Lael Yonker वर्तमान में घर और वितरण मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में बाल रोग विभाग के भाग के रूप में उत्परिवर्ती पुस्तकालय ।

Acknowledgments

हम उसे डेटाबेस खोज में मार्गदर्शन के लिए MGH Treadwell आभासी पुस्तकालय की लिसा Philpotts शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस काम को सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (YONKER16G0 and HURLEY16G0) और NIH NIAID (BPH and ADE: R01 A1095338) ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich

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References

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