Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Replikering av bestilt, Nonredundant bibliotek av Pseudomonas aeruginosa belastning PA14 Transposon innsetting mutanter

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57298
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 2,3, 1,4, 1,4
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Pseudomonas aeruginosa infeksjon forårsaker betydelig sykelighet i sårbare verter. Nonredundant transposon innsetting mutant biblioteket av P. aeruginosa belastning PA14, som PA14NR angir, forenkler analyse av genet funksjonalitet i mange prosesser. Presenteres her er en protokoll for å generere høy kvalitet kopier av PA14NR sette mutant biblioteket.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa er en svært genotypically variert og tilpasningsdyktig Gram-negative bakterie allestedsnærværende i menneskelig miljøer. P. aeruginosa er kjøpedyktig danner biofilm, utvikle antibiotikaresistens, produsere virulens faktorer og raskt utvikle seg i løpet av en kronisk infeksjon. Dermed kan P. aeruginosa føre både akutt og kronisk, vanskelig å behandle infeksjoner, noe som resulterer i betydelig sykelighet i enkelte pasientgrupper. P. aeruginosa belastningen PA14 er en menneskelig kliniske isolere med bevarte genomet struktur som infiserer en rekke pattedyr og nonvertebrate verter gjør PA14 en attraktiv belastning for å studere denne patogen. I 2006 ble et nonredundant transposon innsetting mutant bibliotek med 5,459 mutanter tilsvarer 4,596 spådd PA14 gener generert. Siden da har distribusjon av PA14 biblioteket tillatt i samfunnet å forstå funksjonen av enkelte gener og komplekse stier av P. aeruginosa. Vedlikehold av biblioteket integritet gjennom replikeringsprosessen krever riktig håndtering og presis teknikker. Derfor, presenterer dette manuskriptet protokoller som beskriver i detalj trinnene involvert i biblioteket replikering, bibliotek kvalitetskontroll og riktig lagring av personlige mutanter.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa er en svært genotypically variert og tilpasningsdyktig Gram-negative bakterie stede i jord, vann, og de fleste mennesker miljøer, samt hud mikroflora. Sammenlignet med mange bakteriell arter, har P. aeruginosa en relativt stor genomet av 5.5-7 Mbp med høye G + C innhold (65-67%). Videre en betydelig andel av sine gener består av metabolske tilpasningsevne og er en del av regulatoriske nettverk, gir stor fleksibilitet som svar på miljøstress1. P. aeruginosa uttrykker en mengde virulens faktorer, utstillinger proclivity å skjemaet biofilm, har muligheten til å koordinere reaksjonene gjennom flere quorum sensing veier og viser en bemerkelsesverdig evne til å utvikle antibiotikaresistens og toleranse2,3,4,5,6,7,8. Disse attributtene presenterer betydelige utfordringer for behandling av infeksjoner forårsaket av P. aeruginosa.

Kronisk P. aeruginosa infeksjoner kan oppstå i mange sykdom stater. Cystisk fibrose (CF), en genetisk sykdom forårsaket av mutasjon av Cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator (CFTR) genet, resulterer i inspissated, infiserte sekret i luftveiene, progressiv bronkiektasier og til slutt, død fra respirasjonssvikt9. Av voksen alder, er fleste pasienter med CF kronisk infisert med P. aeruginosa, som spiller en nøkkelrolle i sykelighet og dødelighet forbundet med denne sykdommen10. I tillegg er pasienter med alvorlig brenne skader11, tracheostomies12, felles erstatninger13eller iboende katetre14 utsatt for P. aeruginosa infeksjon gjelder bakterier evne til skjemaet biofilm og flukt vert inflammatorisk svar15. Videre skjer kolonisering uten konkurranse etter flere antibiotika resistente eller tolerant innbyggere er valgt gjennom bredspektret, sekvensielle antimikrobielle behandling12,16,17 , 18. bedre forståelse patogenesen av P. aeruginosa vil ha viktige implikasjoner for mange sykdom stater.

Flere P. aeruginosa kliniske isolater, inkludert stammer PAO1, PA103, PA14 og PAK, har blitt grundig studert for å undersøke ulike funksjoner av P. aeruginosa patogenesen. Belastning PA14 er en kliniske isolere som tilhører en av de vanligste klonal grupper verdensomspennende19,20 og har ikke vært mye passaged i laboratoriet. PA14is svært virulente i virveldyr modeller av infeksjon, med en kjent endotoxin profil21, pili struktur22, virusets øyene23, type III sekresjon system (TTSS), cytotoksisitet mot pattedyr celler24 og profiler i antibiotikumet motstand og utholdenhet25. Videre PA14 er også svært virulente i mange vert-patogen modellsystemer, inkludert anlegg blad infiltrasjon modeller26,27,Caenorhabditis elegans infeksjon modeller28, 29, insekt modeller30,31, samt mus lungebetennelse modeller32,33 og solbrenthet modeller34.

Genomet hele mutant biblioteker er samlinger av isogenic mutanter i unødvendige gener som utgjør svært kraftig verktøy for å forstå en organisme biologi ved analyse av gen funksjon i genomisk skala. To nær metning transposon innsetting mutant biblioteker i s. aeruginosa er tilgjengelige for distribusjon. Innsetting nettstedene til transposons er funnet for begge bibliotekene. Disse såkalte nonredundant bibliotekene lette genomet-omfattende studier av bakteriell stammer betydelig reduserer tiden og kostnadene involvert i screening uncharacterized tilfeldig transposon mutanter. P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket bygget i MPAO1 isolere belastning PAO1 bruker transposons erphoA/ hah og erlacZ/ hah er35, kuratert av Manoil lab, University of Washington. Biblioteket består av en sekvens-verifiserte samling av 9,437 transposon mutanter som gir bred genomet dekning og inkluderer to mutanter for de fleste gener36. Informasjon om P. aeruginosa PAO1 transposon mutant biblioteket er tilgjengelig på offentlige, Internett-tilgjengelige Manoil lab nettsted på http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. P. aeruginosa belastning PA14 nonredundant transposon innsetting mutant bibliotek (PA14NR sett) i belastning PA14 bruker transposons MAR2xT7 og TnphoA37 er distribuert av Department of Pediatrics ved Massachusetts General Hospital. PA14NR Set består av en samling av mer enn 5800 mutanter med enkelt transposon innsettinger i unødvendige gener37. Detaljer om bygging av PA14NR Set er beskrevet i det offentlige, Internett-tilgjengelige området http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, som også inneholder en rekke online søkeverktøy for å forenkle bruken av PA14NR Sett.

Den opprinnelige PA14NR Set består 5,459 mutanter, valgt fra et omfattende bibliotek av ca 34000 tilfeldig transposon innsetting mutanter, som tilsvarer 4,596 spådd PA14 gener som representerer 77% av alle anslåtte PA14 gener37. Siden byggingen av biblioteket i 2006 new mutantene ble lagt, og tiden PA14NR Set inkluderer flere 5800 mutanter38 som representerer ca 4600 PA14 gener. Fleste PA14 transposon mutanter ble generert i vill type bakgrunn37. Detaljer om hvert medlem av mutant biblioteket, inkludert genetisk bakgrunn, er tilgjengelige via søke nettdatabasen, eller ved å laste ned Nonredundant biblioteket regnearket, begge funksjonene som er tilgjengelige på PA14 nettsted (http:// pa14.mgh.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Home.CGI). Fleste av mutanter ble opprettet ved hjelp av MAR2xT7 (MrT7) transposon, med en liten sette laget med TnPhoA (phoA) transposon37. Hver transposon har en antibiotikaresistens kassett, som tillater mutant utvalg gentamicin (MrT7) eller kanamycin (phoA). PA14NR settet av mutanter lagres i sekstitre 96-brønns plater og inneholder to ekstra 96-brønns kontroll platene som består av vill-type PA14 inokulert og uninoculated brønner under Sommer i et forhåndsinnstilt mønster. 96-brønns plate formatet sammen med online søkeverktøyene sterkt forenkler egendefinerte utviklingen av screening analyser det tillate brukernes å lett identifisere tilblivelse tilknyttet mutant fenotyper. Online søkeverktøyene også forenkle søk og valg av flere relevante mutanter kreves for videre studier.

PA14 og PAO1 transposon mutant bibliotekene er svært viktige globale ressurser for det vitenskapelige samfunnet, og de utfyller hverandre i validere funksjonen av ukjent gener og stier av denne bakteriell patogen. Coincidentally, siden byggingen av PAO1 og PA14 transposon mutasjon bibliotekene, har full-genome DNA sekvensering analyse av mange P. aeruginosa isolerer vist at PAO1 og PA14 tilhører forskjellige store subclades av P. aeruginosa phylogeny7,39,40,41. Fordi klinisk P. aeruginosa isolerer finnes distribuert gjennom fylogeni, det faktum at PAO1 og PA14 tilhører forskjellige P. aeruginosa undergrupper øker verdien av to transposon mutasjon bibliotekene for komparative studier.

Publikasjoner som beskriver bygging og screening av bakteriell mutant biblioteker, inkludert P. aeruginosa biblioteker35,er37,42, lett tilgjengelig i litteraturen. Til best av vår kunnskap er ingen publiserte protokoller som beskriver detaljert prosedyrer og teknikker for replikering, vedlikehold og validering av bakteriell mutant biblioteker imidlertid tilgjengelige.

Metodene som er beskrevet i denne publikasjonen beskriver et sett med tre protokoller som forenkler bruk og vedlikehold av PA14NR Set. Første protokollen beskriver replikering av biblioteket som anbefalt til mottakere av PA14NR Set. Andre protokollen inneholder retningslinjer for striper, vokser og lagring av personlige mutanter identifisert ved hjelp av PA14NR Set. Tredje protokollen beskriver kvalitetskontroll teknikker, inkludert PCR forsterkning av fragmenter fra transposon mutanter og påfølgende sekvensering å bekrefte mutant identitet. Dette settet med protokoller kan også tilpasses for replikering og vedlikehold av andre bakterielle mutant biblioteker eller samlinger. Replikering av bakteriell mutant biblioteker eller samlinger er svært anbefales å opprettholde dataintegriteten "master kopi" (originalversjonen mottatt). Replikering av flere kopier av PA14NR Set for rutine laboratoriebruk reduserer sannsynligheten for interwell forurensning av hovedkopien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Advarsel: Bruk standard BSL-2 sikkerhetstiltak ved håndtering av P. aeruginosa, en human patogen. Hvis du er privatperson immunsupprimerte eller har noen medisinsk tilstand som øker din mottakelighet for bakteriell infeksjon, ta spesiell forsiktighet når du arbeider med P. aeruginosa. Konsultere biosikkerhet kontoret i din institusjon og få godkjennelse fra legen din før du arbeider med den PA14 NR satt eller mutant biblioteker av bakteriell patogener.

Figure 1
Figur 1: oversikt over protokollen I: replikering av PA14NR angi. Dag 1: Replikere frosne mutant kulturer fra "master kopi" av PA14NR satt i LB Agar media og vokse mutanter overnatting på 37 ° C. Dag 2: Overføre mutant vekst fra LB Agar media til dyp godt blokker som inneholder LB flytende kjøttkraft, vokse over natten på 37 ° C med skjelvende på 950 rpm. Dag 3: Bland overnatting LB kulturer med glyserol, deretter overføre til 96-brønns destinasjon plater for langtidslagring. Sted 96-brønns plater i-80 ° C fryser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: anbefalt oppsett. Steriliteten og problemfri arbeidsflyt skal vedlikeholdes gjennom bruk av passende forholdsregler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1. protokollen I: replikering av PA14NR satt

Merk: Replikering av biblioteket kan oppnås ved å dele PA14NR satt i fire undergrupper av seksten plater hver som kan behandles i fire sammenhengende uker. Generasjon 1 til 6 eksemplarer overholder ukentlige arbeidsflyten skissert i tabell 1, mens generasjon mer enn 6 eksemplarer følger ukentlige arbeidsflyten i tabell 2. Vil generere 12 kopier av PA14NR Set, vaksinere samme PA14NR delsettet i flytende LB media på dag 2 og igjen på dag 3 (fra samme sett med agar plater kopiert på dag 1), og overføring over natten mutant kulturer i kopi platene på dag 3 og dag 4 henholdsvis.

Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3
Prep dag Veksten av PA14NR angi mutanter på LB agar medier Veksten av PA14NR angi mutanter i flytende LB media Overføring av PA14NR sette mutant kulturer til destinasjon plater

Tabell 1: tidsramme for replikering 1-6 eksemplarer av PA14NR Set. Replikering av et lite antall eksemplarer kan følge en ukentlig arbeidsflyt.

Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4
Prep dag Veksten av PA14NR angi mutanter på LB agar Vokse PA14NR angi mutanter i flytende LB media Overføring av dag 3 mutant kulturer å generere 1 sett med 6 kopier av PA14NR sett Overføring av dag 4 mutant kulturer å generere 2 sett med 6 kopier av PA14NR sett
Veksten av PA14NR angi mutanter i flytende LB media

Tabell 2: tidsplan for replikering av opptil 12 kopier av PA14NR Set. Replikering av et større antall kopier krever lagdeling arbeidsflyt ukentlig.

  1. Dag 1: Veksten i PA14NR sette Master kopi på LB agar plater
    1. Bruk hansker, laboratoriefrakk og maske for å håndtere PA14NR Set.
    2. Fjern benken og tørk overflaten med 70% etanol.
    3. Forberede LB agar media43 og sterilisere i autoklav 25 min. kule media til 55 ° C i vann bad og legge enten 15 µg/mL gentamicin, for mutanter som inneholder MAR2xT7 transposon innsettinger eller 200 µg/mL kanamycin, for mutanter som inneholder TnphoA innsettinger.
    4. Helle smeltet LB agar i rektangulær plater med ca 60 mL av media per plate. Tørr plater i sterilt hette for ca 1 time før bruk. Kontroller at det er ingen vann kondens på overflaten av agar. Lagre plater på 4 ° C, om nødvendig.
    5. Opprette et sterilt felt med en Bunsen brenner på etanol-tørket benk toppen og definere beholdere med hensiktsmessige løsninger for replikator pin sterilisering (se trinn 1.1.9). Bruk åpne plastbeholdere (5,25-tommers L x 4,25 "W x 1,75"H tilnærmet størrelse) for replikator pin sterilisering. Autoclave plastbeholdere før bruk.
      Merk: Varmen av Bunsen brenner flammen oppretter en konveksjon gjeldende, som varmer i rommet over flammen og løfter alle partikler i luften opp og unna den kjøligere luften under, holde arbeidsområdet sterilt.
    6. Fjern maksimalt fire PA14NR satt master plater fra-80 ° C fryseren (for å unngå unødvendige tining), og plassere dem på tørris i 4 L isen panorere.
    7. Ta 96-brønns master platen replikert fra tørris og plassere den på benken for å tillate kort tining, som bare tar tid nødvendig for sterilisering av replikator pinnene (ca 3-4 min) (se trinn 1.1.8). Merke posisjonen av A1-koordinaten på agar platen før stempling. Juster master plate og agar platen med A1 koordinatene begge platene i øvre venstre hjørne.
    8. Sterilisere Replikatoren "pins" ved å følge fremgangsmåten beskrevet nedenfor. Tapp replikator litt etter hvert trinn å fjerne overflødig væske.
      1. Fordype pins i 250 mL 0,3 til 0.5% natriumhypokloritt (10% husholdning bleke) i 30 sekunder. Minimere kontakt med natriumhypokloritt løsning, som kan føre til skade pins. Fordype pins i 250 mL steril ddH2O eller sterilt ultrapure vann i 10 sekunder, deretter i 250 mL 70% etanol i 30 sekunder, deretter i 250 mL av 95% etanol i 2 minutter.
      2. Flammen sterilisere replikator pins ved holde replikator vinkelrett Bunsen brenner flammen, sakte nærmer flamme til etanol tenner, så umiddelbart trekke det fra flammen. Flammen vil utrydde når alle etanol burns av. Holde et lokk eller lignende beholder til kveles brennende etanol, om nødvendig.
        Merk: Vær svært forsiktig når arbeider med etanol nær en flamme. IKKE hold replikator direkte over flamme.
      3. Kul pins låsing på en ubrukt sterilt rektangulære plate inneholder agar LB media i 30 sekunder.
    9. Kort varm aluminium forsegle fra PA14NR angir master plate med hånden før peeling det av. Gjøre mens nedkjøling replikator pinner. Fjerne aluminium segl nøye for å hindre at forseglingen retusjering platen. Bruke pinsett for å skrelle av rester av aluminium segl.
    10. Sette inn replikator pinner i master plate, forsiktig skyve og svingende replikator i alle fire retninger slik at pins kontakt med frosne bakteriekulturer i hver av 96-. Ta ekstra hensyn til brønner ligger i den ytre kanten av platen ved å trykke replikator pinnene mot frosne kulturer i brønnene ligger på kanten av platen.
    11. Forsiktig plassere replikator pinnene på overflaten av agar platen. Flytte replikator i en liten sirkulær bevegelse til skjemaet mini-plener ca 4-5 mm for hver mutert stamme. Unngå muligheten for at mini-plener kan overlappe, for å unngå kryss-kontaminering.
    12. Forsegle PA14NR satt master plate med en ny sterilt aluminium segl. Ikke berør den selvklebende siden av aluminium seal når som helst å unngå forurensning. Kontroller at hver brønn og kantene av platen er helt forseglet av benytter en plate roller. Retur 96-brønns plate tørke is.
    13. Gjenta for hver master plate.
    14. Tørke ned alle arbeidsflater med 70% etanol etter håndtering PA14NR Set.
    15. Replikert agar plater til 37 ° C inkubator og ruge over natten.
  2. Dag 2: Veksten i PA14NR sette Master kopien i LB flytende kjøttkraft
    1. Forberede LB flytende kjøttkraft43 som inneholder enten 15 µg/mL gentamicin, for mutanter som inneholder MAR2xT7 transposon innsettinger eller 200 µg/mL kanamycin, for mutanter som inneholder TnphoA innsettinger.
    2. Fjern laminær strømning hette for unødvendig utstyr og aktivere hette blåser i minst 10 min før du begynner arbeidet. Tørke ned hette overflater og elementer i panseret med 70% etanol.
    3. Fyll 2 mL dyptgående brønn blokker med 525 µL av LB flytende kjøttkraft som inneholder aktuelle antibiotika i laminær strømning hette med en 50-1200 µL 12-kanals elektronisk pipette. Deretter overføre medier-fylt dyptgående brønn blokker til etanol-tørket benk toppen. Gjenbruk tips så lenge sterile forhold opprettholdes.
    4. Bruk hansker, laboratoriefrakk og maske for å håndtere PA14NR angitt.
    5. Fjern benken og tørk overflaten med 70% etanol.
    6. Bringe agar plater med overnatting vokst mutant stammer benk toppen.
    7. Opprette et sterilt felt med en Bunsen brenner på etanol-tørket benk toppen og definere beholdere med hensiktsmessige løsninger for replikator pin sterilisering (se neste trinn).
    8. Sterilisere replikator "pins" følge fremgangsmåten nedenfor. Tapp replikator litt etter hver nedsenking å fjerne overflødig væske.
      1. Fordype pins i 250 mL 0,3 til 0.5% natriumhypokloritt i 30 sekunder. Minimere replikator pin kontakt med natriumhypokloritt løsning, som kan føre til skade pins. Deretter fordype pins i 250 mL steril ddH2O eller ultrapure vann i 10 sekunder, deretter i i 250 mL av 70% etanol i 30 sekunder, deretter i 250 mL av 95% etanol i 2 minutter.
      2. Flammen sterilisere replikator pinner, så kul pins låsing i ubrukte rektangulære plate inneholder agar LB media i 30 sekunder.
        Merk: Vær svært forsiktig når du arbeider med etanol nær en flamme (se 1.1.8).
    9. Forsiktig plassere replikator pinnene på agar plate inneholder mutant vekst og kontroller at pins er i kontakt med alle 96 mutanter på agar plate, så dukke pinner i dype brønner som inneholder LB flytende kjøttkraft. Unngå å berøre sidene av brønnene med pinnene.
    10. Forsegle dypt godt blokken med en bakteriefri pustende tetting membran. Bruke en plate roller for å sikre at hvert individ er også ordentlig lukket.
    11. Gjenta for hver agar plate.
    12. Tørke ned alle arbeidsflater med 70% etanol etter håndtering PA14NR Set.
    13. Vokse inokulerte flytende kulturer for 15-16 h på 37° C på 950 rpm bruker en høyhastighets shaker, hvis tilgjengelig.
      Merk: Hvis en høyhastighets shaker ikke er tilgjengelig, inkubasjonstiden for dypt godt blokker i shaker på 250-300 rpm er mulig. Men er det større sjanse for små kolonien varianter (SCVs)25 nye under lav oksygenering forhold. Derfor er det svært anbefales å holde inkubasjon ganger under 15-16 h som vokser kulturer i dypt godt blokker med lavere shaker hastigheter. Uønsket spredning av SCVs i mutant brønner kan endre mutant fenotyper når biblioteket til å utføre genetiske skjermer.
      Enkelte brønner i PA14NR Set inneholder sakte voksende/ikke-voksende mutanter, mangler kloner, eller inneholder uninoculated medier. Plasseringen av disse brønnene har blitt registrert og kan finnes i filen PA14NR satt brønner tilleggsinformasjon som følger med denne publikasjonen.
  3. Dag 3: Overføring av PA14NR angi overnatting kulturer i destinasjon platene
    1. Fjern laminær strømning hette og aktivere hette blåser i minst 10 min før du begynner arbeidet. Tørke ned hette overflater og elementer i panseret med 70% etanol.
    2. Skrive ut vanntett Klebet (se ekstra PA14NR angi etiketter-filen for malen). Fjern 96-brønns plater av plast brytes i laminær strømning hette. Peel-off plate etiketten og plassere den platens kant nærmest A1 H1 brønner av destinasjon plate. Litt Løft opp lokket på målet platen og plasser etiketten på nedre kant vise etiketten når platen er dekket med lokk.
    3. Forberede 3.5 L 60% glyserol (v/v) og sterilisere 20 min i autoclave.
    4. Bruk hansker, laboratoriefrakk og maske for å håndtere PA14NR Set. Fjern dypt godt blokker fra høyhastighets shaker eller vanlig shaker.
    5. Overføre dyptgående brønn blokker til sterilt laminær strømning hette og fjern forsiktig pustende tetting membran. Erstatt med aluminium segl. Spinn ned dyptgående brønn blokker med svært lav fart å samle kondens (30 sekunder på 50-150 x g, deretter avta quicky ved sentrifuge brems på).
    6. Overføre dyptgående brønn blokker tilbake til sterilt hette og bruke en 50-1200 µL 12-kanals elektronisk pipette og sterile filtrerte tips legge 525 µL av glyserol/LB flytende kjøttkraft (like deler LB flytende kjøttkraft og 60% glyserol løsning) i hver brønn. Bland ved forsiktig pipettering 300 µL opp og ned 3 ganger med elektronisk pipette. Touch tips siden godt før utkasting tips for å forhindre drypping. Løs ut tips og fortsett med neste rad til ferdig med hele dypt godt blokk.
    7. Bruke 12-kanals elektronisk repeterende pipette og filtrerte Tupper, for å hindre interwell forurensning under aliquoting, trekke opp 900 µL av mutant kultur og dispensere 150 µL i hver 96-brønns destinasjon platene generere 6 kopier av biblioteket plate. Forhindre drypper ved å berøre veggen av tips før du starter overføring av kulturen i destinasjon platene. Hvis ingen gjenta pipette er tilgjengelig, kan du bruke en flerkanals pipette til å dispensere 150 µL i hver av de seks 96-brønns platene, ved hjelp av teknikken beskrevet ovenfor for å forhindre drypping.
    8. Bruk sterilt aluminium sel. å dekke platene og bruk en plate roller å fullstendig forsegle plate kantene og alle brønnene. Pass på ikke å dekke etikettidentifikasjon med aluminium segl. Ikke riste platene som kultur kan sprute på sidene av brønnene eller aluminium segl.
    9. Fjern forseglet plater fra panseret og place plater på en flat, selv overflate i-80 ° C fryseren.
    10. Tørke ned alle arbeidsflater med 70% etanol etter håndtering biblioteket.
    11. Utføre kvalitetskontroller etter biblioteket replikering og etter benytter biblioteket for å utføre genetiske skjermer (se protokollen III).

2. protocol II: Håndtering og oppbevaring av personlige mutanter fra PA14NR sett

  1. Dag 1: Strek mutant rundt
    1. Identifisere plasseringen av mutant rundt gjennom PA14NR angi link http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS eller bruke filen Nonredundant Library.xls lastes ned fra linken http:// pa14.mgh.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.CGI). Noter antibiotikaet nødvendig å merke enhver spesiell mutant (gentamicin eller kanamycin).
    2. Forberede LB agar media steriliseres ved autoklav i 20-25 min og avkjøles til 55 ° C i vannbad. Legge til 15 µg/mL gentamicin for mutanter som inneholder MAR2xT7 transposon innsettinger og 200 µg/mL kanamycin for mutanter som inneholder TnphoA transposon innsettinger. Hell LB agar media på plater (runde eller rektangulære plater er tilstrekkelig). Tørr plater i sterilt hette i ca 30 minutter til 1 time før bruk.
    3. Autoclave alle plasticware og ikke-sterilt leverer før bruk.
    4. Bruk hansker, laboratoriefrakk og maske for å håndtere PA14NR Set. Fjern benken og tørk overflaten med 70% etanol før du arbeider med PA14NR Set.
    5. Opprett et sterilt felt med en Bunsen-brenner.
    6. Fjerne PA14NR angi 96-brønns plate med mutant av interesse fra-80 ° C fryser og plassere den på tørris, ta tørris container til benken og kort plassere 96-brønns plate på benken å tillate liten tining (ca 1-2 min).
      Merk: Holde oversikt over alle PA14NR satt 96-brønns platene tilgang til strek personlige mutanter, som mer tilgang til biblioteket plater er korrelert med en større risiko for interwell forurensning.
    7. Varm aluminium tett med hånden før peeling det av, forsiktige for å hindre at forseglingen retusjering platen. Bruke pinsett for å skrelle av rester av aluminium segl.
    8. Finn mutant rundt på 96-brønns tallerkenen. Bruk sterilt trestav eller sterilt pipette tips for å plukke litt frossen kultur fra enkelt vel som inneholder mutant rundt.
    9. Strek frosset kultur på agar platen for enkelt mutant kolonier som følger: forsiktig spre bakterier over en del av platen til å opprette strek 1, med en frisk og sterile tre pinne eller pipette tips, dra gjennom strek 1 og spre bakterier over en andre del av platen, opprette strek 2. Bruker et tredje sterilt tre pinne eller pipette tips, dra gjennom strek 2 og spre bakterier over den siste delen av platen, opprette strek 3.
    10. Forsegle kilde plate med en ny sterilt aluminium segl. Berør ikke selvklebende siden av aluminium seal når som helst å unngå forurensning. Kontroller at hver godt og kantene av platen er helt forseglet av benytter en plate roller. Retur 96-brønns plate tørris og-80 ° C fryseren.
    11. Inkuber agar plate i 37 ° C inkubator over natten.
    12. Tørke ned alle arbeidsflater med 70% etanol etter håndtering biblioteket.
  2. Dag 2: Vekst av mutant av interesse i LB flytende kjøttkraft
    1. Forbered flytende LB kjøttkraft som inneholder 15 µg/mL gentamicin eller 200 µg/mL kanamycin, som transposon innsetting.
    2. Bruk hansker, laboratoriefrakk og maske å håndtere P. aeruginosa.
    3. Fjern benken og tørk overflaten med 70% etanol. Opprett et sterilt felt med en Bunsen-brenner.
    4. Overføre 3-5 mL LB buljong med passende antibiotikumet inn steril kultur røret med cap.
    5. Bruker en sterile applicator eller et sterilt pipette tips, en enkelt koloni av mutert stamme og vaksinere det i LB media.
    6. Inkuber LB flytende kulturer på 37 ° C i en shaker på 225-250 rpm over natten.
    7. Tørke ned alle arbeidsflater med 70% etanol etter håndtering P. aeruginosa.
  3. Dag 3: Lagre mutant interesse-80 ° C fryser
    1. Etiketten cryovial med mutant navn, antibiotika LB buljong og dato for lagring.
    2. Forberede 500 mL 50% glyserol (v/v) og sterilisere i autoclave.
    3. Bruk hansker, laboratoriefrakk og maske å håndtere P. aeruginosa.
    4. Fjern benken og/eller laminær flom hette og tørk overflaten med 70% etanol.
    5. Fjerne rør som inneholder mutant kultur fra shaker.
    6. Forbered en liten beholder med tørris.
    7. Bruk laminær strømning hette eller opprette et sterilt felt på etanol-tørket benk toppen med Bunsen brenner.
    8. Legg til like mye bakteriell kultur og 50% glyserol merket cryovial ved hjelp av sterile forhold, og bland forsiktig med Pipetter (siste volum 1-2 mL/medisinglass avhengig av cryovials brukes). Plass cryovial på tørris til hurtigfrysestasjoner.
    9. Plass cryovial i merket boksen i-80 ° C fryser.
    10. Tørke ned alle arbeidsflater med 70% etanol etter håndtering P. aeruginosa.

3. protocol III: kvalitetskontroll av PA14NR

  1. Velg tilfeldig sett av mutanter fra nylig replikerte plater å oppdage mulige interwell kontaminering (testing av 30-40 mutanter anbefales).
    Merk: I tilfeller der det er nødvendig å bekrefte identiteten til en mutant brukes for karakteristikk av et bestemt gen er det anbefalt å utføre PCR amplifications med Gen-spesifikke primere designet for kjente sekvensen av genet som inneholder den Transposon innsetting. Selv om mer utfordrende, fordelene ved å bruke vilkårlig inkluderer PCR primere i stedet for gen-spesifikke PCR primere når amplyfing DNA fragmenter fra transposon mutanter store mutant bekreftelse og muligheten til å oppdage tilstedeværelsen av potensial forurensninger. For kvalitetskontroll er det ikke nødvendig å få høy kvalitet PCR sekvensering data for alle tilfeldig slected mutanter, som et tilstrekkelig antall mutanter er vist for å vurdere feil.
  2. Følg "Protokollen II" å strek og vokse mutant stammer.
  3. Autoclave alle plasticware og ikke-sterilt leverer før bruk.
  4. Isolere genomisk DNA av foretrukne metoden. For analysen beskrevet i dette arbeidet, ble en genomisk DNA isolering kit brukes etter produsentens protokoller. Flere mutant stammer kan analyseres samtidig.
  5. Måle genomisk DNA konsentrasjon bruker et microvolume spektrofotometer. Justere genomisk DNA konsentrasjonen til ca 100 ng/µL.
  6. Bruke genomisk DNA som mal for å kjøre "PCR1 reaksjon" som beskrevet i trinn 1 i tabell 3, generere Arb1 PCR fragmenter (Figur 3). Primere for dette trinnet er oppført i tabell 4.
  7. Legge til 0,5 µL av 10 x lasting buffer 5 µL PCR1 reaksjon, laste inn en 1,5-2% agarose gel og kjøre gel på 80-150 V.
    Merk: En bestemt fragment eller et bestemt fragment utvalg er ikke forventet, og flere band kan være til stede som vilkårlig primer kan binde til flere steder.
  8. Bruke DNA fra PCR1 reaksjon som mal for å kjøre "PCR2 reaksjon" som beskrevet i trinn 2 av tabell 3, generere Arb2 PCR fragmenter (Figur 3). Primere for dette trinnet er oppført i tabell 4.
  9. Legge til 0,5 µL av 10 x lasting buffer 5 µL PCR2 reaksjon, laste inn en 1,5-2% agarose gel og kjøre gel på 80-150 V.
    Merk: En bestemt fragment eller et bestemt fragment utvalg er ikke forventet, og flere band kan være til stede som vilkårlig primer kan binde til flere steder.
  10. Sende PCR2 reaksjon med riktig transposon-spesifikke grunning for sekvenser.
  11. Analize sekvensering resultatene byBLASTing dem mot fullstendig PA14 genomet bruke BLAST tilbys på PA14NR biblioteket nettsted (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) eller ved direkte sprengning dem mot bestemte genet sekvensen av mutant rundt.
    Merk: Informasjon om valgte mutanter kan finnes ved å søke PA14NR angi nettstedet (Søk http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS eller dataoverføre den Nonredundant Library.xls fil fra linken http:/ / pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi).

Figure 3
Figur 3: PCR forsterkning og sekvensering av transposon innsetting mutanter. Skjematisk visning av trinnene involvert i PCR forsterkning og sekvensering for bekreftelse av mutant identitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

PCR reaksjon oppsett
Trinn 1 Trinn 2
PCR1 reaksjon: PCR2 reaksjon:
23.25 µL vann (molekylærbiologi grad) 19.15 µL vann (molekylærbiologi grad)
3µL 10 x Taq polymerase Buffer 5 µL 10 x Taq Polymerase Buffer
0.5µL Taq utvalg 0,6 µL Taq utvalg
0.625 µL 20 µM primer Arb1D (tabell 4) 0.625 µL 20 µM primer Arb2A (tabell 4)
0.625 µL 20 µM transposon-spesifikke Primer (PMFLGM. GB 3a eller Tn5Ext) (tabell 4) 0.625 mL 20 µM Transposon-spesifikke Primer (PMFLGM. GB 2a eller Tn5Int2) (tabell 4)
1 µL 10 mM dNTPs 1 µL 10 mM dNTPs
1 µL genomisk DNA, 100 ng 5 µL PCR1 reaksjon
30 µL siste reaksjon volum 30 µL siste reaksjon volum
PCR reaksjon innstillinger
PCR1 Thermocycler betingelser: PCR2 Thermocycler forhold:
95 ° C-2 min 95 ° C-2 min
Gjenta 5 sykluser: Gjenta 30 sykluser:
95 ° C – 30 s 95 ° C – 30 s
30 ° C-1 min 54 ° C – 30 s
72 ° C-1 min 72 ° C-1,5 min
Gjenta 30 sykluser: 72 ° C-10 min
95 ° C – 30 s 4 ° C-Hold
45 ° C – 30 s
72 ° C-1 min
72 ° C-10 min
4° C-Hold

Tabell 3: PCR reaksjonen oppsett og thermocycler forhold brukes for vilkårlig PCR. Vilkårlig PCR reaksjoner utføres sekvensielt og fragmenter genereres under PCR1 reaksjon brukes som mal PCR2 reaksjon. Bestemt thermocycler innstillingene brukes for hvert sett av reaksjoner.

Primer navn Primer sekvens
MAR2xT7 Transposon-spesifikke primere
PMFLGM. GB-3a TACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM. GB-2a TGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 Transposon sekvensering Primer
PMFLGM. GB-4a GACCGAGATAGGGTTGAGTG
TNphoA Transposon-spesifikke primere
Tn5Ext GAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2 GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
TNphoA Transposon sekvensering Primer
Tn5Int CGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
Vilkårlig primer
ARB1D GGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2A GGCCAGGCCTGCAGATGATG

Tabell 4: liste over primere brukt i kvalitetskontroll Eksperimenter. Primere brukt for PCR forsterkning og sekvensering av transposon innsetting mutanter å bekrefte mutant identitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tolv nye kopier av PA14NR Set ble replikert bruker protokollen jeg, og en kvalitetskontroll vurdering av de nye kopiene generert ble utført med protokollen III.

PA14NR sette mutant plater med kontroll plater, som består av vill-type PA14 inokulert og uninoculated brønner under Sommer i et forhåndsinnstilt mønster (figur 4A), ble kopiert etter methology beskrevet i protokollen I. kontroll plater er inkludert i PA14NR angi evaluere mulig interwell smitte når platen replikering. I tillegg kan kontroll plater brukes til praksis replikering teknikker før tilgang til plater som inneholder transposon innsetting mutanter. Veksten av kontroll platene var visuelt inspisert etter replikering LB agar plater og overnatting inkubasjon å sikre tilstedeværelsen av forventede veksten mønstre (figur 4B). Tilstedeværelse eller fravær av bakterievekst i dypt godt blokker inokulert med kontroll Plate 1 ble vurdert etter overnatting inkubasjon ved å lese OD600 i spektrofotometeret. Resultatene viste betydelig vekst i wild type PA14 inokulert brønnene og fullstendig fravær av veksten i uninoculated brønnene (figur 4C). Selv om det var noen variasjon i veksten av wild type PA14 kulturer, var det fullstendig fravær av veksten i uninoculated brønnene (Figur 4 d).

Tretti-åtte mutant belastninger tilfeldig valgt fra en nylig opprettede eksemplarene PA14NR Set ble analysert av sekvensering DNA fragmenter generert av vilkårlig PCR. Vilkårlig PCR reaksjoner ble utført for å forsterke DNA fragmenter fra områder rundt transposon innsettinger av 38 mutanter valgt, og PCR fragmenter innhentet ble senere sekvensielt. Et eksempel på PCR fragmenter innhentet etter PCR forsterkning av ni forskjellige transposon innsetting mutanter er vist i figur 5. Så annealing av vilkårlig grunning skjer tilfeldig, kan fragment lengden ikke forutses. Når ingen band var synlig, ble PCR reaksjoner gjentatt. Identiteten til transposon innsettinger i 38 mutanter analysert ble funnet ved hjelp av koblingen PA14 Transposon innsetting Mutant bibliotek (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi) for å velge primerne nødvendig å utføre vilkårlig PCR reaksjoner.

Sekvensering resultatene innhentet fra 38 mutant stammer ble sprengt mot fullstendig genomet av belastningen PA14 bruker eksplosjonen koblingen på webområdet PA14NR biblioteket (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi). Sekvensering resultater fra tilfeldig valgt mutanter ble også justert mot gensekvenser som korresponderte til hver individuelle mutant (innhentet bruker PA14NR sette platen søk plasseringsverktøyet på PA14NR biblioteket nettstedet http:// pa14.mgh.Harvard.edu/cgi-bin/pa14/Search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS). Sekvensen justeringer ble utført ved hjelp av verktøyet justere sekvenser Nucleotide BLAST fra NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? SIDE = MegaBlast & PROGRAM = blastn & BLAST_PROGRAMS = megaBlast & PAGE_TYPE = BlastSearch & BLAST_SPEC = blast2seq & DATABASE = t & QUERY = & emner =).

To av 38 mutanter valgt generert lav kvalitet sekvens resultater, sannsynligvis på grunn av høy GC innhold i regionen transposon innsetting, og kunne ikke analyseres videre. Sekvensen resultater fra 35 av 36 ble sekvensert mutanter matchet sekvenser av gener tilsvarer PA14NR angi valgt mutanter. Bare én av de 36 sekvensene kan ikke matche rekkefølgen av genet som tilsvarer mutant valgt. Imidlertid ble ikke etablert Hvis dette avviket skyldes et problem oppstod under replikering av de nye kopiene av PA14NR Set eller tilskrives 2,8% mislabeling feil anslåtte tidligere PA14NR angi37.

Figure 4
Figur 4: PA14NR angi kontroll plater. A) utformingen av PA14NR angi kontroll plater 1 og 2. B) bilde av PA14 NR satt kontroll plater 1 og 2 kopiert på LB Agar (utsikt fra toppen av agar plate). C) gjennomsnittlig bakterievekst (+/-SD) målt i inokulerte og uninoculated brønner på kontroll Plate 1 etter overnatting inkubasjon i dyp godt blokk. Målinger ble utført på OD600. D) bakterievekst målt i inokulerte og uninoculated brønner på kontroll Plate 1 etter overnatting inkubasjon i dyp godt blokk. Målinger ble utført på OD600 i individuelle brønner. Partallskolonner tilsvarer målinger utført i uninoculated brønner; ulike kolonner tilsvarer målinger utført i PA14-inokulert brønnene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: PCR1 og PCR2 fragmenter innhentet fra forsterkning reaksjoner. Eksempel på fragmenter innhentet med vilkårlig PCR forsterkning reaksjoner. Fragmenter i baner 1-9 tilsvarer ulike mutanter tilfeldig valgt å utføre kvalitetskontroll av PA14NR Set replikert plater. ÅRENE: DNA molekylvekt markør. DNA ÅRENE størrelser er base parene.
PA14NR sette mutant stammer testet: Lane 1: 07_4 A10, lane 2: 07_4 B4, lane 3: 08_1 C3, lane 4: 08_1 H6, lane 5: 08_3 G10, lane 6: 08_4 B8, lane 7: 08_4 H3, lane 8: 09_2 D12, lane 9 : 09_2 G5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

P. aeruginosa PA14NR er en verdifull ressurs for det vitenskapelige samfunnet. Ifølge mars 2017 datasettet fra Clarivate Analytics Essential Science Indicators database, Liberati et al. (2006) 37, som beskriver byggingen av PA14NR Set, er rangert på topp 1% av mikrobiologi publikasjoner. Google Scholar rapporter over 600 siteringer av Liberati et al. (2006) opprinnelige manuskriptet i August 2017. Biblioteket har spilt en viktig rolle i Klargjørende mekanismene bak patogenesen ved P. aeruginosa . Viktigere, muliggjør 96-brønns plate format PA14NR Set høy gjennomstrømning genetisk skjermer designet en rekke P. aeruginosa mutant fenotyper44,45,46. PA14NR Set er tilgjengelig for distribusjon, må forsiktighetsregler brukes å bevare integriteten til denne ressursen.

En rekke publikasjoner viser verktøyet ved å bruke PA14NR Set i genetisk skjermer37,38,47,48. For eksempel som en første test av nytten av biblioteket utført Liberati et al. en PVC (polyvinylklorid) vedlegg skjerm, som korrelerer med bakterier evne til skjemaet biofilm37,38, 47 , 48. bibliotekets format kan også studiet av komplekse genetiske egenskaper som krydde motilitet, dokumentert av identifikasjon av hundrevis av gener av interesse i en enkel skjerm48. PA14NR Set brukte også i store MALDI-TOF masse massespektrometri-baserte skjermen til å hente og analysere intakt-celle proteom profil spectra og vurdere effektiviteten av MALDI-TOF Biotyping47. Bruke denne teknikken, kunne forskerne avgjøre om mindre genomisk forskjeller, som de som følge av transposon innsettinger, forstyrrende biotyping innsats som er brukt i kliniske og terapeutiske miljøer. I tillegg ble PA14NR Set brukt til å utføre en genomet-bred skjerm for demping av PA14 virulens i C. elegans infeksjon modell, slik at identifikasjon av tidligere uncharacterized P. aeruginosa virulens-relaterte gener 38, og dermed gir et eksempel på bruk av PA14 biblioteket å studere vert-patogen interaksjoner.

PA14NR Set fungerer også som en viktig ressurs for studiet av personlige mutanter. For å unngå forurensning av biblioteket, anbefales beste praksis for tilgang til mutanter rundt. Fordi håndtering av biblioteket øker muligheten for forurensning, anbefales det å lagre mutanter interesse for individuelle hetteglass for å begrense tilgang til PA14NR angi arbeider og master kopier. Dette hindrer kontaminering, øker levetiden til biblioteket og beskytter investeringen.

For å opprettholde dataintegriteten viktig PA14NR angi ressursen, anbefales det at alle mottakere av PA14NR Set gjøre kopier av biblioteket ved mottak. Til tross for beste innsats, kan ikke potensialet for utilsiktet forurensning under replikering prosedyrer utelukkes. Derfor er det sterkt anbefalt at brukere komplett kvalitetskontroll sjekker etter biblioteket replikering og etter benytter biblioteket for å utføre genetiske skjermer. Det anbefales også sterkt at brukere lage flere kopier av PA14NR Set å utføre genetiske skjermer som sannsynligheten for interwell forurensning øker. I tillegg bør biblioteket kopier som utfører mer enn 2-3 genetisk skjermer bli utsatt for uttømmende kvalitetskontroll vurderinger. Dessverre, det er ingen riktig måte å gjenopprette biblioteker som opplever tap av kloner eller interwell forurensning. Kompromittert eller forurenset Kopier må forkastes. Som en konsekvens, anbefales det at brukere kopiere flere kopier av bibliotek for rutine laboratoriebruk, vurderer at en kopi levetid er begrenset. Det anbefales også at brukerne begrense tilgangen til "master kopi" å bevare integriteten til PA14NR Set.

Protokollene presenteres her gir en detaljert forklaring av replikering teknikker, inkludert oppsett, protokoller og beste praksis. Replikering protokollene på PA14NR Set kan tilpasses for å generere opptil 12 kopier av biblioteket og også kan lett tilpasses for å replikere andre bakterielle mutant biblioteker. Til best av vår kunnskap er det ingen publiserte protokoller tilgjengelig hittil med detaljerte beskrivelser av prosedyrer og teknikker for replikering, vedlikehold og validering av bakteriell mutant biblioteker. Vi håper disse protokollene gir brukerne PA14NR Set og andre bakterielle mutant biblioteker nødvendig å utføre disse viktige oppgaver.

Enten biblioteket brukes for høy gjennomstrømning skjermer eller som en kilde for individuelle mutanter, er det viktig å regelmessig vurdere integriteten til kopien i bruk. Dette bør tilstrekkelig opplæring av personell og re vurderer replikering eller mutant utvalg teknikker gjøres med jevne mellomrom. Bruk av PA14NR angi kontroll plater og ytelse praksis PCR forsterkning og sekvenser av tilfeldige mutanter å bekrefte sin identitet anbefales sterkt. Liberati el al. (2006) 37 anslått at 2,8% av totalt antall mutanter i PA14NR Set var feilmerket, som fremhever behovet å sekvens bestemte transposon mutanter og generere i-ramme sletting mutanter før du starter noen omfattende studie og/eller publisering av forskning innvolvere bestemte gener. Gitt riktig protokoller og metoder for biblioteket replikering og utvalg av individuelle mutanter for videre studier, vil PA14NR Set bidra til forståelsen av P. aeruginosa virusets og forbedring av kliniske utfall for infisert pasienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen økonomiske interessekonflikter. Eliana Drenkard og Frederick Ausubel deltok i opprettelsen PA14 nonredundant transposon mutant biblioteket. Bryan Hurley og Lael Yonker nå huset og distribuere mutant biblioteket som en del av Department of Pediatrics ved Massachusetts General Hospital.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Lisa Philpotts av MGH Treadwell virtuelle bibliotek for sin veiledning søk i databasen. Dette arbeidet ble støttet av cystisk fibrose Foundation (YONKER16G0 og HURLEY16G0) og NIH NIAID (BPH og ADE: R01 A1095338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
  10. Foundation, C. F. Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report. , Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016).
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. Current Protocols in Molecular Biology. , Wiley. (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 135 Pseudomonas aeruginosa mariner transposon mutant bibliotek mutagenese mikrobiologi opportunistisk infeksjon immunologi
Replikering av bestilt, Nonredundant bibliotek av <em>Pseudomonas aeruginosa</em> belastning PA14 Transposon innsetting mutanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu,… More

Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter