Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ثقافة الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية على حمض البولي فينيل الكحول-Co-إيتاكونيك الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة تحت ظروف خالية من كرة

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

ويرد على بروتوكول تحضير البولي فينيل الكحول-co-إيتاكونيك الهلاميات المائية الحمضية بصلابة متفاوتة، التي كانت المطعمة مع أو بدون أوليجوبيبتيديس، للتحقيق في تأثير صلابة الحيوية على التفرقة وانتشار الخلايا الجذعية. وتسيطر صلابة من الهلاميات المائية الوقت كروسلينكينج.

Abstract

تأثير الرموز المادية، مثل تصلب الحيوية في انتشار وتمايز الخلايا الجذعية، وكانت قد أجرت التحقيق العديد من الباحثين. ومع ذلك، استخدمت معظم هؤلاء المحققين polyacrylamide الهلاميات المائية لاستزراع الخلايا الجذعية في دراساتهم. ولذلك، نتائجها مثيرة للجدل لأن هذه النتائج قد تنشأ من الخصائص التي تنفرد بها بولياكريلاميدي وليس من الرمز المادي (تصلب) الحيوية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإعداد الهلاميات المائية، التي لا تستند إلى بولياكريلاميدي، حيث يمكن أن تكون مثقف مختلف الجذعية والخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ES) والبشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (iPS)،. وأعدت الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة من بيوينيرت البولي فينيل الكحول-co-إيتاكونيك حامض (ف-IA)، مع تصلب تسيطر عليها درجة كروسلينكينج بتغيير الوقت كروسلينكينج. وتم التحقيق الهلاميات المائية ف-IA المطعمة مع أو بدون أوليجوبيبتيديس المستمدة من المصفوفة خارج الخلية كمنصة مستقبل لزراعة الخلايا الجذعية وتمايزها. ويرد في الثقافة ومرور السائل السلوى في مجال الخلايا الجذعية والخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية وحقوق دإط الخلايا والخلايا البشرية المتكاملة هنا بالتفصيل. وأظهرت الهلاميات المائية أوليجوبيبتيدي ف-IA متفوقة الأداء، التي كانت تحدثها خصائصها صلابة. هذا البروتوكول تقارير توليف مادة بيولوجية، التلاعب بهم السطحية، جنبا إلى جنب مع التحكم في خصائص صلابة، وأخيراً، أثرها على مصير الخلايا الجذعية باستخدام شروط ثقافة خالية من كرة. استناداً إلى الدراسات التي أجريت مؤخرا، مثل ركائز المعدلة يمكن أن تعمل كمنصات مستقبلا لدعم وتوجيه مصير مختلف خط الخلايا الجذعية للروابط المختلفة؛ وعلاوة على ذلك، تجديد واستعادة وظائف الجهاز المفقودة أو الأنسجة.

Introduction

يعرف مصير تمايز الخلايا الجذعية إلى نسب محددة للخلايا وانتشار طويلة الأجل للخلايا الجذعية، ولا سيما البشرية المستحثة pluripotent (iPS) الخلايا والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ES)، ينظمها مثبطات، عوامل النمو، و/ أو صغيرة الجزيئات النشطة بيولوجيا في ثقافة وسائل الإعلام. في الآونة الأخيرة، تم الاعتراف العظة المادية الحيوية، لا سيما صلابة خلية الثقافة الحيوية، لتكون عاملاً مهما في توجيه مصير الخلايا الجذعية الانتشار والتمايز1،2، 3،4،،من56. ولذلك، بدأ الباحثون عدة للتحقيق في مصير الخلايا الجذعية، التي تستزرع في الهلاميات المائية، على التمايز، أساسا باستخدام polyacrylamide الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة.

يمكن التحكم صلابة الحيوية الالتصاقات المحورية ومورفولوجيا الخلايا، خلية النمط الظاهري والتصاق الخلايا الجذعية، لا سيما في ثنائي الأبعاد (2-d) زراعة1،2،،من35. الاستشعار عن بعد Mechano الحيوية بالخلايا الجذعية عموما يسيطر التصاق تركيز إشارات عبر مستقبلات إنتغرين. نمييا، نونموسكلي الميوسين كونتراكتيليتي تعتمد على معهد مراجعي الحسابات الداخليين من سيتوسكيليتون أكتين يلعب دوراً حاسما في عملية ميتشانوسينسينج للخلايا الجذعية في الخلية 2-د زراعة النظم3،،من45، 7،،من89،،من1011.

انجلر وزملائه بوضع فكرة مثيرة لاهتمام أن الخلايا الجذعية البالغة، مثل الخلايا الجذعية (خدمات إدارة المباني) نخاع العظام المزروعة في خلية الثقافة الحيوية مع صلابة مماثلة لانسجة محددة، تميل إلى التفريق في الخلايا التي نشأت من 5من أنسجة محددة. خدمات إدارة المباني الخلايا المحتضنة على polyacrylamide ناعمة 2-د الهلاميات المائية مغطاة بطبقة الكولاجين النوع الأول (مع صلابة مماثلة لانسجة المخ) في التوسع في وسائل الإعلام كانت المستحث تلقائياً تفرق في وقت مبكر العصبية الأنساب، بينما مثقف خلايا خدمات إدارة المباني في الهلاميات المائية مع تصلب مماثل للعضلات أو الأنسجة العظام collagenous وجد أن يحفز التمايز في وقت مبكر الأنساب myocytes وخلايا الاوستيوبلاستس، على التوالي، في الهلاميات المائية polyacrylamide 2-د3،5. وحققت العديد من الباحثين مصير تمايز الخلايا الجذعية المستزرعة في polyacrylamide الهلاميات المائية المعطل تداولها مع الكولاجين النوع الأول من12،،من1314،،من1516 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21-ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تقارير بعض متناقضة1،18،22،،من2324 موجودة لفكرة معروفة واقترح قبل انجلر et al. 5 هذا بسبب انجلر في فكرة5 وضعت فقط على polyacrylamide الهلاميات المائية ونتائجها قد نشأت من الخصائص المحددة لمادة بيولوجية (polyacrylamide)، وليس فقط من الرمز المادي (تصلب) من مادة بيولوجية. ولذلك، من المهم تطوير نوع آخر من المائية، التي يمكن التحكم بصلابة قبل crosslinking من الهلاميات المائية. ولهذا الغرض، وضعت الهلاميات المائية بيوينيرت، التي أعدت من البولي فينيل حمض الكحول-co-إيتاكونيك (ف-IA) مع صلابة مختلفة، التي كان يسيطر عليها درجة كروسلينكينج مع متغيرة crosslinking وقت25، 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32-يمكن زراعة الخلايا الجذعية في نونموديفيد ف-IA الهلاميات المائية، فضلا عن ف-IA الهلاميات المائية المطعمة بمصفوفات خارج الخلية (ECMs) وأوليجوبيبتيديس. في دراسة سابقة25، كانت تزرع الخلايا الجذعية البشرية المكونة للدم (هسكس) من دم الحبل السري في ف-IA الهلاميات المائية مع قيم صلابة مختلفة تتراوح الجيش الشعبي الكوري 3 إلى 30 معامل التخزين الجيش الشعبي الكوري حيث فيبرونيكتين أو أوليجوبيبتيدي المستمدة من وكان المطعمة فيبرونيكتين (CS1, ايلدفبست) إلى الهلاميات المائية ف-IA. ولوحظ عالية السابقين فيفو التوسع في حظيرة هسكس في الهلاميات المائية ف-IA المطعمة ب CS1 أو فيبرونيكتين، الذي عرض صلابة متوسطة تتراوح بين 12 الجيش الشعبي الكوري إلى 30 كيلو باسكال25.

لا تزرع iPS البشرية وخلايا ES في زراعة الأنسجة التقليدية البوليستيرين (TCP) الأطباق33،34 لوفاق البشرية وخلايا iPS تتطلب ملزمة محددة إلى ECMs، مثل فيترونيكتين أو لامينين للحفاظ على ما بلوريبوتينسي خلال الثقافة طويلة الأجل. ولذلك، صممت عدة هياكل المطعمة أوليجوبيبتيدي الهلاميات المائية ف-IA مع خصائص صلابة الأمثل وإعدادها في تشكيلات من سلسلة واحدة، وسلسلة واحدة مع جزء مشترك، وسلسلة مزدوجة مع جزء مشترك، ونوع تشعبت سلسلة32. تسلسل أوليجوبيبتيدي اختيرت من مجالات ربط إنتغرين و glycosaminoglycan ECMs. الهلاميات المائية ف-IA المطعمة مع أوليجوبيبتيديس المستمدة من فيترونيكتين مع سلسلة مزدوجة أو الجزء المشترك، الذي يكون معامل تخزين في حوالي 25 الجيش الشعبي الكوري، دعم ثقافة طويلة الأجل ES البشرية وخلايا iPS لما يزيد على 12 من الممرات تحت خالية من كرة والكيميائية 32من شروط محددة. الجزء المشترك وسلسلة مزدوجة مع جزيئات التصاق الخلية في الهلاميات المائية يسرت الانتشار والخلايا بلوريبوتينسي البشرية وفاق والبرامج المتكاملة32. هنا، المطعمة بروتوكول لإعداد الهلاميات المائية ف-IA (مع معامل تخزين من الجيش الشعبي الكوري 10 إلى 30 الجيش الشعبي الكوري، الذي تم قياسه تحت ظروف رطبة في الهواء) مع أو بدون أوليجوبيبتيديس أو هو وصف ECMs. ويبين كيف أن الثقافة ومرور العديد من الخلايا الجذعية (بما في ذلك الخلايا الجذعية السائل السلوى والخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية وحقوق دإط الخلايا والخلايا البشرية المتكاملة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ووافقت لجان الأخلاقيات للمستشفى لاندسيد تايوان (مجلس الهجرة واللاجئين-13-05) والجامعة المركزية الوطنية التجارب في هذه الدراسة. أجريت جميع التجارب وفقا لجميع المبادئ التوجيهية الحكومية والمؤسسية ذات الصلة وقابلة للتطبيق واللوائح خلال هذه الدراسة.

1-حل وإعداد وسائل الإعلام

  1. تنقية البوليمر
    1. نق ف-IA مع مجموعة حمض الكربوكسيلية مع درجة التحلل من > 96.5 في المائة قبل الغسيل ف-IA مع الإيثانول. 20 غراما من فالف في 200 مل إيثانول في دورق مخروطي 500 مل وتحرض على محرض مغناطيسي ل 24-30 h. تبادل الإيثانول مع الإيثانول الطازجة كل ح 8-10.
    2. إزالة ف-IA من الإيثانول بالترشيح باستخدام قمع [بشنر].
    3. ف الجاف-IA من فراغ التجفيف في درجة حرارة الغرفة ح 24.
      ملاحظة: من المستحسن لتنظيف الفخ في نظام التجفيف الفراغ (عن طريق إزالة الإيثانول) في كثير من الأحيان، لا سيما خلال ساعات قليلة، لأن الفخ الذي يميل إلى انسداد بعد إزالة كمية كبيرة من الإيثانول من جوعه ف
  2. إعداد الحل ف-IA
    ملاحظة: إضافة البوليمر ببطء شديد في المذيب (الماء). من المستحسن أن تتخذ على الأقل 15 دقيقة لإضافة ف-IA في المذيب. إذا تم إضافة المذيب إلى البوليمر، وسوف لا يجوز حل البوليمر تماما. كن حذراً لا لتوليد الغليان المتفجرة من الحل ف-IA. استخدام النظارات الواقية أثناء إعداد الحل ف-IA. عملية تدفئة الحل ف-IA ضروري لحل يحالون ف البلورية فمن المقترح (والأفضل) لإعداد الحل ف-IA في غرفة نظيفة نسبيا تجريبية، إذا كان ذلك ممكناً.
    1. حل ف-IA في المياه النقية إلى تركيز وزن 0.050% لتجربة زراعة الخلية أو وزن 0.50% تركيز لقياس رهيوميتير: على سبيل المثال، يحل 50 مغ من ف-IA في 100 مل الماء النقي لثقافة الخلية و 500 ملغ من ف-IA في 100 مل دي الماء المتأين (DI) لقياسات رهيوميتير.
    2. تحرض حل ف-IA ح 1 على صفيحة.
      ملاحظة: لتجنب غليان المتفجرة، لا حرارة في حل ما يزيد على 95 درجة مئوية. الغليان المتفجرة من الحل البوليمر في درجة حرارة عالية قد تؤدي حروق الجلد. ولذلك، أداء التدفئة من ف-IA بعناية فائقة، ورصد درجة حرارة الحل ف-IA أثناء التسخين.
    3. بعد أن كان الحل ف-IA تبرد في درجة حرارة الغرفة، تحرض الحل ف-IA في درجة حرارة الغرفة ل h. 48 إجازة حل ف-IA الساخنة على صفيحة دون تدفئة، وثم تركها دون إثارة الشغب في درجة حرارة الغرفة ح 20-24 التأكد من وجود فقاعات الهواء غير موجودة في الحل ف-IA.
  3. إعداد الحل كروسلينكينج
    1. جعل تكوين crosslinking الحل 1.0 وزن ٪ glutaraldehyde من حل 25 ٪ glutaraldehyde مائي، وزن 20.0 Na2حتى4 باستخدام 99% > نقاء، و 1.0 وزن ٪ ح2حتى4. على سبيل المثال، واحد 6 أو 12 لوحة الثقافة الخلية جيدا، وإضافة 100 ميليلتر من حل glutaraldehyde، 2 غ كبريتات الصوديوم، و 100 ميليلتر من حامض الكبريتيك إلى 10 مل الماء النقي.
  4. دإط/PS الخلية البشرية ثقافة وسائل الإعلام
    ملاحظة: استخدام DMEM/F12 وسائط الإعلام وأساسي 6 الوسائط والوسائط 8 أساسي لثقافة الخلية.
    1. إعادة تجميد 50 X 8 الأساسية الملحق ببطء للحل بين عشية وضحاها بذوبان الجليد في ثلاجة 4 درجات مئوية.
    2. إضافة زجاجة واحدة من الملحق 8 أساسي X 50 في زجاجة واحدة من الوسائط 8 الأساسية القاعدية. فصل وسائط الإعلام إلى مختبرين الصغيرة (50 مل في كل) في أنابيب الطرد المركزي 100 مل، ثم تخزين الوسائط في-20 درجة مئوية.

2 إعداد طبق المائية ف-IA

  1. إعداد الفيلم ف-IA
    1. حقن قاسمة 1 مل الحل ف-IA طبق TCP 35 ملم، والجاف للطبق في فرن 45 درجة مئوية لمدة يومين لإنتاج فيلم ف-IA في مقاعد البدلاء نظيفة.
  2. كروسلينكينج الأطباق المائية ف-IA
    1. تزج الأفلام ف-IA في حلاً crosslinking مائي 0.5، 1، 2، 4 و 6، 12، 24، و 48 ساعة.
      ملاحظة: 'ف-IA-X' (مثلاً، ح فالف-12) يشير إلى كروسلينكيد المائية IA ف على ح س (مثلاً، ح 12).
    2. بعد كروسلينكينج، شطف الهلاميات المائية ف-IA مع الماء النقي في درجة الحرارة المحيطة، وثم الاحتفاظ الهلاميات المائية في الماء النقي في درجة الحرارة المحيطة في مقاعد البدلاء نظيفة.
    3. تعقيم الهلاميات المائية ف-IA من الغمر في محلول إيثانول 75.0 volume/volume% لمدة 1 دقيقة، شطف ف-IA الهلاميات المائية في المياه النقية ست مرات، وثم الاحتفاظ الهلاميات المائية ف-IA في المياه النقية حتى تستخدم لزراعة الخلية.
  3. إعداد أطباق المائية ف-IA المطعمة مع أوليجوبيبتيدي أو إدارة المحتوى في المؤسسة
    1. تنشيط الهلاميات المائية ف-IA عبر الانغماس في 1 مل من محلول مائي يحتوي على 10 ملغ/مل ن-(3-Dimethylaminopropyl)-ن 'هيدروكلوريد-اثيلكاربودييميدي (EDC) و 10 ملغ/مل ن-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS) ل 1 ح في 37 درجة مئوية أو ح 4 في 4 درجات مئوية.
    2. شطف الهلاميات المائية ف-IA مع 1 مل فوسفات مخزنة المالحة (PBS، الرقم الهيدروجيني 7.2) 3 مرات وتزج الهلاميات المائية ف-IA في برنامج تلفزيوني محلول يحتوي على 1 مل أوليجوبيبتيدي (100-1,500 ميكروغرام/مل) أو إدارة المحتوى في المؤسسة (10-100 ميكروغرام/مل) عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تسلسل أوليجوبيبتيدي و ECMs المستخدمة لزراعة الخلايا الجذعية ويرد في الجدول 1.
    3. بعد تطعيم أوليجوبيبتيدي أو إدارة المحتوى في المؤسسة، يغسل الهلاميات المائية ف-IA مع الماء النقي 3 مرات.
      ملاحظة: الهلاميات المائية ف-IA المطعمة مع Y ميكروغرام/مل من أوليجوبيبتيدي أو إدارة المحتوى في المؤسسة (Z) هي يشار إليه ف-IA-سح-Z أو ف-IA-ح-XZ-Y، حيث X تشير إلى وقت كروسلينكينج (ح)، ص يشير إلى تركيز أوليجوبيبتيدي أو إدارة المحتوى في المؤسسة، ويشير إلى Z أوليجوبيبتيدي مختلفة أو إدارة المحتوى في المؤسسة.

3-الإنسان ES/iPS خلية ثقافة

  1. أسلوب المرور وصيانة ES البشرية غير متمايزة، وخلايا iPS
    1. الحفاظ على وفاق البشرية (مثلاً، WA09 أو H9) خلايا أو المؤسسة البشرية (مثلاً، HS0077) الخلايا على ماتريجيل في وسائل الإعلام 8 أساسي في أطباق 6 سم باستخدام القياسية البشرية ES/iPS خلية ثقافة البروتوكولات28،32.
    2. احتضان خلايا ES/iPS الإنسان القرب من روافد مع 2.0 ملغ/مل ديسباسي الثاني في وسائل الإعلام دميم/و-12 في 37 درجة مئوية لمدة 8-10 دقيقة وشطف ثم خلايا ES/iPS الإنسان مرتين مع وسائط الإعلام DMEM/F12.
    3. بعد إضافة 2 مل دميم/و-12 وسائل الإعلام للبشرية ES/iPS خلية ثقافة الأطباق، فصل ضعيف المستعمرات ملتصقة مكشطة خلية باستخدام أو بواسطة بيبيتينج.
    4. جمع الخلايا البشرية ES/iPS إلى أنابيب الطرد المركزي 15 مل والطرد المركزي خلايا ES/iPS الإنسان في 160 × ز لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    5. بعد الطرد المركزي، تجاهل DMEM/F12 وتعليق الخلايا ES/iPS البشرية في 1 مل الإعلام E8، وثم حساب كثافة الخلية باستخدام عداد خلايا.
    6. تلقيح خلايا ES/iPS بعد تعديل الكثافة المناسبة (1-5 × 104 خلايا كل سم2 باساجينج أو كرد) في أطباق ثقافة جديدة (ف-IA الهلاميات المائية المطعمة أوليجوبيبتيدي أو بإدارة المحتوى في المؤسسة).

4-توصيف خصائص الخلية البشرية ES/iPS

  1. تقييم النشاط الفوسفاتيز القلوي (AP)
    1. قياس نشاط الفوسفاتيز القلوي (AP) البشرية ES/iPS الخلايا استخدام تلطيخ يعيش الفوسفاتيز القلوية القياسية.
  2. إيمونوستينينج
    1. تنفيذ إيمونوستينينج لهيئة تنظيم الاتصالات-1-81، 4 سا، Sox2، و Oct3/4 على خلايا هس والوركين للتحقيق في بلوريبوتينسي بعد28،التقليدية بروتوكول32.
    2. إضافة وحدة تخزين 0.5 مل من بارافورمالدهيد 4% (حجم/حجم) في كل طبق جيدا 24 التي كانت مثقف ES/iPS الخلايا البشرية، وفي وقت لاحق، احتضان الأطباق لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية إصلاح الخلايا.
    3. نضح الحل بارافورمالدهيد من كل بئر. ثم أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني في البئر ونضح برنامج تلفزيوني شطف الخلايا. القيام بعملية الشطف 3 مرات.
    4. بيرميبيليزي أغشية الخلية بإضافة 0.5 مل من 0.3% (حجم/حجم) الحل تريتون-X 100 في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. نضح الحل تريتون-X 100 وإضافة 300 ميليلتر من ألبومين المصل البقري 2% (وزن/حجم) (BSA) في برنامج تلفزيوني (حجب المخزن المؤقت) في كل بئر، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. إزالة المخزن المؤقت حظر بيبيتينج، ثم بعد ذلك إضافة الأجسام المضادة الأساسي المطلوب (Oct3/4 (1: 200)، Sox2 (1: 200)، سا-4 (1: 200)، و Tra-1-81(1:200) ماصة، انظر الجدول 2) في كل بئر، قد تضعف الأجسام المضادة التي تشير فيها إلى 1: 200 مع برنامج تلفزيوني 200-fold والمحتضنة لمدة يوم واحد في 4 درجات مئوية.
    7. نضح الحل جسم الأولية، وتغسل الخلايا مع 300 ميليلتر من 0.05% 20 توين في حل برنامج تلفزيوني 3 مرات في درجة حرارة الغرفة.
    8. إضافة 300 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية (1: 200، انظر الجدول 2)، والتي هي محددة لنوع فرعي مفتش الابتدائي، في حل جيش صرب البوسنة 2% (الوزن/الحجم) في كل جيدا واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    9. تغسل الخلايا مع 300 ميليلتر من 0.05% 20 توين في حل برنامج تلفزيوني 3 مرات في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    10. تحليل الخلايا ملطخة بالأسفار مجهرية أو مجهرية [كنفوكل].
  3. تشكيل هيئة امبريويد
    1. التحقيق بلوريبوتينسي خلايا البشرية ES/iPS بتشكيل هيئة امبريويد (المجلس التنفيذي) في الفقرات 10 و 20.
      ملاحظة: قرب 80% التقاء في لوحات 6-جيدا كافياً للتحضير لتشكيل المجلس التنفيذي.
    2. شطف ES البشرية أو خلايا iPS مع 2 مل من وسائط الإعلام دميم/و-12 مرتين، وثم تزج الخلايا في 1.5 مل وسائط الأساسية 6.
    3. قطع قرب خلايا ES أو المؤسسة البشرية المتلاقية 80% إلى حوالي 32 قطع استخدام 200 ميليلتر النصائح. بعد ذلك، فصل الخلايا من الأطباق باستخدام مكشطة خلية.
    4. جمع الخلايا ES/iPS البشرية ونقل إلى طبق مرفق معالجات 6-جيدا.
    5. تبادل الوسائط 6 الأساسية التي بيبيتينج وسائل الإعلام القديمة وإضافة وسائط جديدة كل يومين.
      ملاحظة: الثقافة الخلايا في تعليق لمدة أسبوعين في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
    6. بعد الحديدية علقت المتجانسة في الوسائط الأساسية 6، نقل الحديدية الثقافة على الأطباق TCP 24-بئر مغطاة بوزن 0.1 ٪ الجيلاتين، والثقافة الخلايا الموجودة في الوسائط الأساسية 6 لمدة أسبوع إضافي.
    7. وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على الأجسام المضادة ضد علامات الخلايا المستمدة من ثلاث طبقات جنينية germline [برس (الأنسجة)، والتحكيم (الأديم الظاهر)، بيتا ثالثا-Tubulin (الأديم الظاهر)، والإدارة البحرية السويدية (mesoderm)] وتقييم الخلايا بواسطة الأسلوب إيمونوستينينج الموصوفة أعلاه.
  4. تشكيل تيراتوما
    1. التحقيق بلوريبوتينسي خلايا البشرية ES/iPS بتشكيل تيراتوما في الفقرات 10 و 20.
      ملاحظة: 5 أطباق من القرب من التقاء 80% في لوحات 6-جيدا تكفي لتشكيل تيراتوما (على الأقل 3 × 106 خلايا ضرورية للتجارب تشكيل تيراتوما).
    2. شطف الخلايا مع 2 مل الإعلام دميم/و-12 مرتين، ثم قم بإضافة 1.5 مل دميم/و-12 وسائل الإعلام للاطباق ثقافة الخلية.
    3. قطع حوالي 80% المتلاقية ES أو iPS الخلايا البشرية إلى ما يقارب 32 قطعة باستخدام 200 ميليلتر نصائح. بعد ذلك، فصل الخلايا من الأطباق باستخدام مكشطة خلية.
    4. جمع الخلايا البشرية ES/iPS إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل والطرد المركزي الخلايا في 160 × ز لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    5. بعد الطرد المركزي، تعليق الكريات الخلية في 100 ميليلتر DMEM/F12، ومزيج ثم الخلية الكريات مع 100 ميليلتر ماتريجيل (نسبة حجم 1:1).
    6. نقل تعليق خلية في محقن يبرد قبل-20 درجة مئوية. حقن، في المجموع، على الأقل 3 × 106 خلايا تحت الجلد في الذكور إيماءة-إخضاعها (إيماءة. CB17-/JNarlبركدامشمولان) الفئران (5-8 أسابيع).
    7. بعد 5-8 أسابيع، تشريح teratomas والإصلاح مع الحل بارافورمالدهيد 4.0% (وزن/حجم) وتخزينها ثم في 4 درجات مئوية.
    8. إصلاح في تيراتوما مع البارافين وشريحة teratomas جزءا لا يتجزأ من البارافين ووصمة عار والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) باستخدام بروتوكول قياسي28،32.
      ملاحظة: قد ترسل الباحثون الأنسجة teratoma الثابتة للشركة لإصلاح في تيراتوماس مع البارافين، teratomas شريحة جزءا لا يتجزأ البارافين، ووصمة عار العينة مع ح & ه، التي عادة ما تستخدم في قسم علم الأمراض في المستشفيات.
  5. زراعة الخلايا الجذعية البشرية المستمدة من الدهنية (إعلان)
    1. حارة الثقافة الإعلام (التي تحتوي على 1% فطري المضادات الحيوية و 10% الجنيني البقري المصل (FBS) دميم)، 0.25% من التربسين-يدتا، وبرنامج تلفزيوني إلى 37 درجة مئوية في حمام مياه مسبقة لاستخدام.
    2. تغسل الخلايا البشرية إعلان قبل بيبيتينج 10 مل من برنامج تلفزيوني في كل طبق الثقافة 6-سم حيث يتم استزراع الخلايا.
    3. أضف 1 مل من محلول يدتا التربسين (0.25 في المائة) في أطباق الثقافة 6-سم واحتضان الحل في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. مراقبة الخلايا في أطباق الثقافة 6 سم تحت المجهر للتأكد من أن يتم فصل الخلايا.
    5. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل أجهزة الطرد مركزي، وإضافة وحدة تخزين متساوية من وسائط الثقافة (دميم التي تحتوي على مضاد حيوي فطري 1% و 10% FBS) في أنبوب الطرد المركزي لتحييد التربسين-يدتا.
    6. الطرد المركزي الخلايا في ز × 250 لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    7. بعد الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية بعناية قبل بيبيتينج، دون الإخلال ببيليه الخلية.
    8. ريسوسبيند الخلايا في ثقافة وسائل الإعلام، والبذور ثم الخلايا في كثافة مناسبة (5-10 × 103 خلايا كل سم2 باساجينج أو كرد) في أطباق ثقافة جديدة (ف-IA الهلاميات المائية المطعمة مع وبدون أوليجوبيبتيديس وإدارة المحتوى في المؤسسة).
  6. السائل السلوى البشرية تنبع الثقافة الخلية (AFS)
    1. الحارة وسائط زراعة (مكدب دميم/201 (2:3) تحتوي على 20% مصل بقرى الجنين (FBS)، 5 نانوغرام/مل بفجف و 1% مضاد حيوي فطري)، 0.25% من التربسين-يدتا، وبرنامج تلفزيوني إلى 37 درجة مئوية في حمام مياه مسبقة لاستخدام.
    2. غسل الخلايا البشرية في المؤسسة من خلال بيبيتينج 10 مل من برنامج تلفزيوني في كل طبق الثقافة 6-سم حيث يتم استزراع الخلايا.
    3. أضف 1 مل من محلول يدتا التربسين (0.25 في المائة) في أطباق الثقافة 6-سم، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. ملاحظة يتم فصل الخلايا على أطباق الثقافة 6-سم تحت المجهر للتأكد من الخلايا.
    5. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل أجهزة الطرد مركزي، وإضافة وحدة تخزين متساوية من ثقافة الإعلام (مكدب دميم/201 (2:3) تحتوي على 20% الجنيني البقري المصل (FBS)، 5 نانوغرام/مل بفجف ومضاد حيوي فطري 1%) في أنبوب الطرد المركزي لتحييد التربسين-يدتا.
    6. الطرد المركزي الخلايا في ز × 250 لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    7. بعد الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية بعناية دون إزعاج بيليه الخلية قبل بيبيتينج.
    8. ريسوسبيند الخلايا في وسائط الإعلام زراعة والبذور ثم الخلايا في كثافة مناسبة (5-10 × 103 خلايا كل سم2 باساجينج أو كرد) في أطباق ثقافة جديدة (ف-IA الهلاميات المائية المطعمة مع وبدون أوليجوبيبتيدي وإدارة المحتوى في المؤسسة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ف-IA الهلاميات المائية المطعمة مع أوليجوبيبتيدي المستمدة من إدارة المحتوى في المؤسسة (أوليجوكم) أو إدارة المحتوى في المؤسسة مع مرونة مختلفة أعدتها بعد رد فعل مخطط، كما هو مبين في الشكل 1 ألف، باستخدام أنواع مختلفة من أوليجوكم (الشكل 1B). مرونة من الهلاميات المائية تنظمها كثافة crosslinking التطبيقية (الوقت) (الشكل 1). ف-IA الهلاميات المائية المطعمة مع المستمدة من فيترونيكتين أوليجوبيبتيديس، الذي يحتوي معامل تخزين 25.3 كيلو باسكال (24 ح crosslinking الوقت)، أيد طويلة الأجل ثقافة البشرية المتكاملة وخلايا ES لأكثر الممرات 10-20. ف-IA الهلاميات المائية المطعمة بجزء مشترك (ف-IA-ح 24-VN1G) خاصة، أو يؤيد سلسلة مزدوجة (ف-IA-ح 24-VN2G) بلوريبوتينسي البشرية المتكاملة وداط الخلايا، التي أعدت بتركيز أقل نسبيا من أوليجوكم (200-500 ميكروغرام/مل) من فالف-VN1 الهلاميات المائية، مما استلزم استخدام تركيزات عالية من أوليجوكم (> 1000 ميكروغرام/مل) للحفاظ على بلوريبوتينسي للإنسان خلايا iPS و ES28،32.

دإط الخلايا البشرية الإبقاء على الماوس الجنينية الليفية (MEFs) كانت تحول لثقافة على أخرى تجميعي الأطباق طلاء المواد (مثلاً، سينثيماكس الثاني) المغلفة وف-IA-ح 24-VN1 المائية الأطباق (الشكل 2)28. البشرية دإط الخلايا المستزرعة في طلاء المتاحة تجارياً تم العثور على أطباق أكثر سهولة التفريق، خاصة عند الحافة من المستعمرات (الشكل 2 ألف و 2 (ج))، في حين يمكن الحفاظ على حقوق دإط الخلايا بهم بلوريبوتينسي على ف-IA-ح 24--VN1--1000 أطباق المائية لأن الخلايا المتمايزة يمكن لا يمكن ملاحظته من مورفولوجية دإط الخلايا البشرية على ف-IA-ح 24--VN1--1000 المائية الأطباق (الشكل 2b و 2d)28.

بلوريبوتينسي ES البشرية (الشكل 3A) وخلايا iPS (الشكل 3B) المزروع في ف-IA-24 ح الهلاميات المائية المطعمة مع أوليجوكم (ف-IA-ح 24--VN1--1000، ف-IA-ح 24--VN1G--1000، ف-IA-ح 24-VN2C)، فضلا عن (فيترونيكتين المؤتلف التقليدية رفيترونيكتين)-مغلفة بالاطباق، وجرى تقييم يستند إلى التعبير عن البروتينات صانع pluripotent (نانج، Sox2، و Oct3/4) بعد أن تم استزراع الخلايا على كل طبق في ظروف خالية من كرة باستخدام وسائط 8 أساسي لمقاطع 1032. وأعرب عن هذه البروتينات بلوريبوتينسي مرضية على البشرية من البرامج المتكاملة وداط الخلايا المستزرعة على ف-IA الهلاميات المائية المطعمة أوليجوكم، فضلا عن الأطباق المغلفة رفيترونيكتين في ظروف خالية من كرة.

تقييم القدرة على التمايز إلى الخلايا المستمدة من الطبقات الجرثومية الثلاث في المختبر (تشكيل المجلس التنفيذي)، و في فيفو (تيراتوما تشكيل) ضروري للتحقق من بلوريبوتينسي ES البشرية وخلايا iPS بعد زراعة على الاصطناعية الحيوية. ولذلك، حقوق دإط الخلايا (الشكل 4) والخلايا البشرية المتكاملة (الشكل 5) كانت تزرع على الأطباق المائية ف-IA-أوليجوكم وكانت مثقف المؤتلف أطباق 10 فقرات، وفي وقت لاحق، الخلايا المغلفة فيترونيكتين في التعليق بشكل الحديدية. كذلك كانت تزرع الحديدية الأطباق المغلفة بالجيلاتين لبضعة أسابيع لمراعاة قدرة الخلايا على الانتشار على الأطباق (4A الشكل و الشكل 5A)32. وفاق البشرية المتمايزة (الشكل 4 باء) وخلايا iPS (الشكل 5B) كانوا إيمونوستينيد للبروتينات المشتقة من الطبقات الجرثومية الثلاث: الفافيتوبروتين (وكالة فرانس برس، الأنسجة) والعضلات الملساء أكتين (SMA, mesoderm)، والبروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني ، الأديم الظاهر)32. المؤسسة البشرية وخلايا ES وجد أن تفرق في الخلايا المستمدة من كل الطبقات الجرثومية الثلاث، مما يشير إلى آخر التحقق من بلوريبوتينسي البشرية المتكاملة وخلايا ES، حتى بعد زراعة في ف-IA الهلاميات المائية المطعمة مع أوليجوكم في كرة مجاناً الظروف على المدى الطويل (مرور > 10 فقرات).

كما تم تقييم قدرة التمايز البشري دإط الخلايا إلى الخلايا نشأت من الطبقات الجرثومية الثلاث في فيفو (تيراتوما تكوين الإنزيم). دإط الخلايا البشرية، التي كانت تزرع في ف-IA-VN1-1000 (الشكل 6A) و P-IA-VN2C-1000 (الشكل 6B) في ظروف خالية من كرة الثقافة للممرات 10، تم حقن تحت الجلد في الفئران مشمولان الإيماءة32. تيراتوماس كانت معزولة من الفئران، وأقسام الأنسجة teratoma كانت ثابتة وملطخة H & E (الشكل 6 ألف و 6 باء)32. عرض تيراتوماس وجود الخلايا التي تنشأ من كل الطبقات الجرثومية الثلاث: الأنسجة (ظهارة الأمعاء و الشكل 6A(ب) 6B(b))، ميسوديرم (الغضاريف و الشكل 6A(ج) 6B(c))، والأديم الظاهر ( نيوروبيثيليوم، الشكل 6A(د)؛ صباغ الشبكية ظهارة 6B الشكل(د)). تشير هذه النتائج إلى أن البشرية دإط الخلايا المستزرعة في ف-IA-ح 24--VN1--1000 وف-IA-ح 24--VN2C--1000 في ظروف خالية من كرة للممرات 10 يمكن أن تفرق في الخلايا التي تنشأ من ثلاث طبقات جرثومية، مشيراً إلى الإبقاء على بلوريبوتينسي في فيفو.

كانت أيضا مثقف المؤسسة الخلايا البشرية في غير معدلة ف-IA المائية والمائية ف-IA-أوليجوكم والاطباق TCP في التوسع في وسائل الإعلام. يبين الشكل 7 مورفولوجيس البشرية المؤسسة الخلايا المزروعة بعد أربعة أيام ثقافة في الأطباق المائية IA ف وف-IA-أوليجويكم مع مرونة (ه ') من 12.2 (وقت كروسلينكينج = ح 6)، 18.3 (الوقت crosslinking = ح 12)، 25.3 (الوقت كروسلينكينج = 24 ساعة)، والجيش الشعبي الكوري 30.4 (وقت كروسلينكينج = ح 48) بتركيز أوليجويكم 0 أو 50 ميكروغرام/ملليلتر، فضلا عن برنامج التعاون الفني باستخدام أطباق مع برنامج العمل العالمي 3-12 من صلابة30.

لا يمكن أن تتكاثر الخلايا البشرية المؤسسة على الأطباق المائية ف-IA مع أو بدون أوليجوكم عند صلابة من الهلاميات المائية ف-IA كان أقل من 11 كيلو باسكال (PV-2 ح الكهروضوئية-ح 2-ص، PV-4 ح والكهروضوئية-ح 4-ص)، في حين يمكن أن تتكاثر الخلايا البشرية في المؤسسة مع أو بدون أوليجوكم عند ه ' وكان أكبر من 12 الجيش الشعبي الكوري، باستثناء الأطباق المائية فالف-6 ح والكهروضوئية-IA-ح 6-COL1. فالف-6 ح ف-IA-ح 6-COL1 يبدو ولا تكون مواتية لثقافة المؤسسة الخلايا البشرية نظراً للحيوية الثقافة خلية لينة وقف تقدم دورة الخلية30.

النتائج المذكورة أعلاه تشير إلى أن الأطباق المائية ف-IA مادة أمثل لوقت طويل الأجل الخلايا الجذعية زراعة والحفاظ على بلوريبوتينسي الخلايا الجذعية بالتحديد من صلابة محددة وأوليجوكم، فضلا عن تركيز الرد الأمثل أوليجوكم (الكثافة السطحية من أوليجوكم).

Figure 1
رقم 1: إعداد ف-IA الهلاميات المائية المطعمة مع أوليجوكم أو إدارة المحتوى في المؤسسة. (أ) نظام رد الفعل للرتبة ف-IA الهلاميات المائية المطعمة بإدارة المحتوى في المؤسسة، والمستمدة من إدارة المحتوى في المؤسسة أوليجوبيبتيدي (أوليجوكم)29. حقوق الطبع والنشر عام 2015. تكييف بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". (ب) تصميم وتسلسل أوليجوبيبتيديس المطعمة على ف-IA الهلاميات المائية. واحد أوليجوبيبتيديس واحد في سلسلة (ف-IA-باهوجان ساماج، ف-IA-VN1، وف-IA-HBP1)، أوليجوبيبتيديس سلسلة مع جزء مشترك (ف-IA-VN1G)، وسلاسل مزدوجة (ف-IA-VN2C وف-IA-HBP2C)، وإدارة المحتوى في المؤسسة (ف-IA-ECM) كانت المطعمة في الرتبة ف-IA الهلاميات المائية32. تكييف تحت ترخيص Creative Commons إسناد. (ج) تصلب ف-IA الهلاميات المائية أعدت خلال فترات مختلفة من كروسلينكينج29. حقوق الطبع والنشر عام 2015. تكييف بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مقارنة بين الخلية ES البشرية الثقافات على الأطباق طلاء المتاحة تجارياً والهلاميات المائية ف-IA-ح 24-VN1- مورفولوجيا الإنسان دإط الخلايا (WA09) المزروعة المتاحة تجارياً طلاء أطباق (أ، ب) والاطباق ف-IA-ح 24--VN1--1000 (ج، د) في مرور 1 عندما نقلوا دإط الخلايا البشرية من زراعة في الخلايا الجنينية الماوس الليفية (MEFs) في زراعة في طلاء المتاحة تجارياً الأطباق أو أطباق بولي-ح 24--VN1--1000. تبين الأسهم الحمراء الخلايا ES البشرية المتباينة. أشرطة مقياس تشير إلى 50 ميكرومتر (أ، ب) و 100 ميكرومتر (ج، د)28. تكييف تحت ترخيص Creative Commons إسناد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الخلايا توصيف بلوريبوتينسي البشرية وفاق والبرامج المتكاملة في ف-IA الهلاميات المائية المطعمة بتصاميم مختلفة أوليجوبيبتيدي- التعبير (ألف) من البروتينات بلوريبوتينسي Sox2 نانوج (أحمر)، (الأخضر)، و Oct3/4 (الأخضر) على الخلايا البشرية ES (H9) تحليلها بواسطة immunostaining مع تلطيخ المزدوج مع Hoechest33342 لوسم النووية (الأزرق) بعد استزراع على () ف-IA-ح 24--VN1--1000، (ب) ف-IA-ح 24--VN1G--1000، و (ج) ف-IA-ح 24--VN2C--1000 الهلاميات المائية، وفي (د) المؤتلف فيترونيكتين (رفيترونيكتين)--المغلفة الأطباق تحت ظروف خالية من كرة للممرات 10. (ب) التعبير عن البروتينات بلوريبوتينسي نانج (أحمر) و Sox2 (الأخضر) Oct3/4 (الأخضر) على الخلايا البشرية المتكاملة تحليلها بواسطة immunostaining مع تلطيخ المزدوج مع Hoechest33342 لوسم النووية (الأزرق) بعد استزراع على () ف-IA-ح 24--VN1--1000 المائية، المائية (ب) ف-IA-ح 24--VN2C--1000، و (ج) المؤتلف فيترونيكتين (رفيترونيكتين)-الهلاميات المائية المغلفة الأطباق تحت ظروف خالية من كرة لمقاطع 1032. تبين أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. مواءمة تحت "رخصة جميل العزو". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: وصف قدرة التمايز البشري دإط الخلايا في ف-IA الهلاميات المائية المطعمة بتصاميم مختلفة أوليجوبيبتيدي- مورفولوجيا (A) من الخلايا الحديدية متباينة من الخلايا البشرية ES (H9) بعد تثقيف على () ف-IA-ح 24--VN1--1000، (ب) ف-IA-ح 24--VN1G--1000، و (ج) ف-IA-ح 24--VN2C--1000 الهلاميات المائية، والمؤتلف (د) فيترونيكتين (رفيترونيكتين)--المغلفة الأطباق تحت ظروف خالية من كرة للممرات 10. الإشارة إلى أشرطة مقياس 100 ميكرومتر-(ب) التعبير البروتين الأديم الظاهر (توصيني، أحمر)، mesoderm البروتين (SMA) الخضراء، وبروتين الأنسجة (وكالة فرانس برس الأخضر) في الخلايا البشرية ES (H9) تقييمه بواسطة immunostaining مع تلطيخ المزدوج مع Hoechest33342 للنووي وسم (الأزرق) بعد استزراع ف-IA-ح 24--VN1--1000، ف-IA-ح 24--VN1G--1000 والهلاميات المائية ف-IA-ح 24--VN2C--1000، والمؤتلف فيترونيكتين (رفيترونيكتين)--المغلفة الأطباق تحت ظروف خالية من كرة لمقاطع 1032. تبين أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. مواءمة تحت "رخصة جميل العزو". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: وصف قدرة التمايز iPS البشرية خلايا في ف-IA الهلاميات المائية المطعمة بتصاميم مختلفة أوليجوبيبتيدي- مورفولوجيا (A) من الخلايا الحديدية متباينة من الخلايا البشرية المتكاملة (HPS0077) بعد استزراع على () ف-IA-ح 24--VN1--1000 الهلاميات المائية والهلاميات المائية (ب) ف-IA-ح 24--VN2C--1000 (ج) المؤتلف فيترونيكتين (رفيترونيكتين)- المغلفة الأطباق تحت ظروف خالية من كرة للممرات 10. الإشارة إلى أشرطة مقياس 100 ميكرومتر-(ب) التعبير البروتين الأديم الظاهر (توصيني، أحمر)، mesoderm البروتين (SMA) الخضراء، وبروتين الأنسجة (وكالة فرانس برس الأخضر) في الخلايا البشرية المتكاملة (HPS0077) تحليل بواسطة immunostaining مع تلطيخ المزدوج مع Hoechest33342 للنووي وسم (الأزرق) بعد استزراع على () ف-IA-ح 24--VN1--1000 الهلاميات المائية والهلاميات المائية (ب) ف-IA-ح 24--VN2C--1000 (ج) المؤتلف فيترونيكتين (رفيترونيكتين)--المغلفة الأطباق تحت ظروف خالية من كرة لمقاطع 1032. تبين أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. مواءمة تحت "رخصة جميل العزو". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6: وصف قدرة التمايز ES البشرية (H9) خلايا فيفو في بعد استزراع في الهلاميات المائية ف-IA-ح 24-VN1 وف-IA-ح 24-VN2C- (A) () صورة تيراتوما عن طريق الحقن مع البشرية دإط الخلايا بعد استزراع في ف-IA-ح 24--VN1--1000 الهلاميات المائية تحت ظروف ثقافة الخلية الحرة كرة بعد 10 مقاطع. الأنسجة بما في ذلك (ب) ظهارة الأمعاء (الأنسجة)، يمكن ملاحظة نيوروبيثيليوم الغضروف (mesoderm)، و (د) (ج) (الأديم الظاهر). (ب) () صورة تيراتوما عن طريق الحقن مع البشرية دإط الخلايا بعد استزراع في ف-IA-ح 24--VN2C--1000 الهلاميات المائية تحت ظروف ثقافة الخلية الحرة كرة بعد 10 مقاطع. الأنسجة بما في ذلك (ب) ظهارة الأمعاء (الأنسجة)، (ج) غضروف (mesoderm)، و (د) ظهارة صباغ الشبكية الأديم (الظاهر) ويمكن ملاحظة32. تبين أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. مواءمة تحت "رخصة جميل العزو". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: مورفولوجيا الخلايا المؤسسة البشرية المزروعة في أطباق TCP والاطباق المائية ف-IA المعطل تداولها مع أو بدون أوليجوبيبتيديس المستمدة من إدارة المحتوى في المؤسسة وبعد 4 أيام ثقافة- (أ) مورفولوجيا الخلايا البشرية المؤسسة على الأطباق TCP. (ب) مورفولوجية المؤسسة البشرية الخلايا على فالف-6 ح وف-ألف-6 ح-Z الأطباق المائية (فالف-6 ح، ف-IA-ح 6-العمود 1-50 وف-IA-ح 6-FN1-50، ف-IA-ح 6-VN1-50، ف-IA-ح 6-HBP1-50 وف-IA-ح 6-كرجد-50). (ج) مورفولوجية ةافكس فالف-12 ح وف-IA-12 ح-Z هيدروجيل الأطباق (فالف-12 ح، ف-IA-ح 12-العمود 1-50 وف-IA-ح 12-FN1-50، ف-IA-ح 12-VN1-50، ف-IA-ح 12-HBP1-50 وف-IA-ح 12-كرجد-50). مورفولوجيا (د) للمؤسسة البشرية الخلايا في ف-IA-24 ح وف-IA-24 ح-Z الأطباق المائية (ف-IA-24 ح، ف-IA-ح 24-العمود 1-50 وف-IA-ح 24-FN1-50، ف-IA-ح 24-VN1-50، ف-IA-ح 24-HBP1-50 وف-IA-ح 24-كرجد-50). مورفولوجيا (ه) للمؤسسة البشرية الخلايا في ف-IA-48 ح وف-IA-48 ح-Z الأطباق المائية (ف-IA-48 ح، ف-IA-ح 48-العمود 1-50 وف-IA-ح 48-FN1-50، ف-IA-ح 48-VN1-50، ف-IA-ح 48-HBP1-50 وف-IA-ح 48-كرجد-50). وتبين أشرطة مقياس 100 ميكرومتر30. حقوق الطبع والنشر عام 2017. تكييف بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

اسم المواد/المعدات اختصار
جتبجبقجياجقرجفف COL1
جاكرجدكلجا دوري إدارات (كرجد)
كجافتجرجدسباس FN1
ايلدفبست CS1
كجبقفترجدففتمب VN1
جكقرفرهرنركج HBP1
كججكقرفرهرنركج HBP2C
جججكجبقفترجدففتمب VN1G
جكجكجبقفترجدففتمب VN2C
فيترونيكتين rVN
فيبرونيكتين الجبهة الوطنية

الجدول 1: تسلسل أوليجوبيبتيدي المستمدة من إدارة المحتوى في المؤسسة وإدارة المحتوى في المؤسسة المستخدمة في هذه الدراسة.

الأجسام المضادة تركيز (إضعاف معدل)
نانج 1: 200
SSEA4 1: 200
OCT3/4 1: 200
Sox2 1: 200
أكتين العضلات الملساء 1: 200
(Α-SMA) 1: 200
وكالة فرانس برس أن 1: 200
توصيني 1: 200
أليكسا فلور 555 – مترافق الماعز المضادة الماوس 1: 200

الجدول 2: الأجسام المضادة المستخدمة إيمونوستاينينج في هذه الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتم وضع ف-IA-أوليجوكم والهلاميات المائية ف-IA-إدارة المحتوى في المؤسسة مع صلابة متفاوتة لتوسيع المدى الطويل ES البشرية وخلايا iPS الاحتفاظ بهم بلوريبوتينسي لأكثر من عشر فقرات في ظروف خالية من كرة، فضلا عن ثقافة المؤسسة الخلايا البشرية، إعلان الخلايا، والخلايا الجذعية المكونة للدم25،،من2832. ف-IA الهلاميات المائية المعطل تداولها مع أوليجوكم مرشح ممتاز لمواد زراعة الخلية للتحقيق في تأثير مواد الثقافة الخلية على مصير التمايز وانتشار الأنواع المختلفة من الخلايا الجذعية، فضلا عن الخلايا الأولية و الخلايا السرطانية.

ينبغي أن يكون الحل ف-IA شفافة، عندما يلقي الحل ف-IA في الأطباق. تقرر الوقت crosslinking كثافة crosslinking ف-IA الهلاميات المائية. وتنتج crosslinking ح 24 من الهلاميات المائية ف-IA الهلاميات المائية المثلى للثقافة الخلية ES/iPS البشرية. يمكن المطعمة أي أوليجوبيبتيديس و ECMs على ف-IA الهلاميات المائية باستخدام هذا البروتوكول، يكون فيها أوليجوبيبتيديس و ECMs للمجموعات الأمينية الحرة25،،من2829،،من3031، 32-الكثافة السطحية أوليجوبيبتيديس أو ECMs يمكن الكشف عنها بالأشعة السينية القياسات النانومترية القياس الطيفي (XPS)، رغم أن XPS لا يقدم قيمة مطلقة الكثافة السطحية، ولكن يمكن أن يكون وجود أوليجوبيبتيديس أو ECMs بأمان تحليل.

يمكن تحضير الهلاميات المائية ف-IA مع وبدون أوليجوبيبتيديس المطعمة أو ECMs، التي لها معامل التخزين من الجيش الشعبي الكوري 3-30، اعتماداً على الوقت كروسلينكينج. من الصعب بدلاً من تحضير الهلاميات المائية ف-IA وجود معامل التخزين أقل من 3 كيلو باسكال ومعامل التخزين أعلى من 30 الجيش الشعبي الكوري25،،من2829،30،،من3132. وهذا هو الحد طريقة إعداد المائية الحالية crosslinking الكيميائية من الهلاميات المائية ف-IA. ومع ذلك، يوفر هذا البروتوكول خيار آخر من الهلاميات المائية وجود مرونة المختلفة، التي يمكن أن تدعم ثقافة الخلايا الأولية، والخلايا السرطانية، أو الخلايا الجذعية، بما في ذلك خلايا iPS ووفاق البشرية، لكنها ليست مصنوعة من بولياكريلاميدي. خاصة، وفاق البشرية وخلايا iPS لا يمكن أن ينتشر في الهلاميات المائية بولياكريلاميدي، ولكن يمكن أن تنتشر في ف-IA الهلاميات المائية كما هو مبين في الشكل 2و الشكل 3، الرقم 4، و الرقم 5و الرقم 6. في الواقع، يؤيد الهلاميات المائية ف-IA-ح 24-VN1 البشرية ES خلية ثقافة أفضل من الأطباق طلاء المتاحة تجارياً (الشكل 2). ولذلك، ف-IA الهلاميات المائية الأفضل لثقافة وفاق البشرية وخلايا iPS.

سيكون من المثير للاهتمام أن التحقيق الأمثل مرونة الهلاميات المائية حيث يميز ES البشرية وخلايا iPS في الأنساب محددة من الخلايا مثل كارديوميوسيتيس35ظهارة صباغ الشبكية36، وخلايا بيتا6وال + الخلايا6 للتنمية المستقبلية للطب التجديدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا البحث كان جزئيا تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا، وتايوان تحت أرقام المنح-003 106-2119-M-008، 105-2119-M-008-006، و 104-2221-E-008-107-MY3. وأيد هذا البحث أيضا "مشروع مستشفى لاندسيد تايوان" (حاصلين-لش-105-أ-001). من المعترف به أيضا معونات "البحث العلمي" (رقم 15 ك 06591) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا في اليابان. أ هيجوتشي تود أن تقر للبرنامج الدولي للشراكة العلمية (ايسب-0062) "وكالة الجامعة" للدراسات العليا والبحوث، جامعة الملك سعود، الرياض 11451، المملكة العربية السعودية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

Tags

الهندسة الحيوية، مسألة 132، المائية، التي يسببها الخلايا الجذعية pluripotent، الخلايا الجذعية الجنينية، ومرونة، وخلية ثقافة، أوليجوبيبتيدي، وتعديل السطح، نانوسيجمينت
ثقافة الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية على حمض البولي فينيل الكحول-Co-إيتاكونيك الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة تحت ظروف خالية من كرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., … More

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter