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Bioengineering

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

Ein Protokoll wird präsentiert, um bereiten polyvinyl Alkohol-co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit, die mit und ohne Oligopeptide, aufgepfropft wurden, um zu untersuchen, die Wirkung der Steifigkeit von Biomaterialien auf die Differenzierung und Proliferation von Stammzellen. Die Steifigkeit der Hydrogele wurde dadurch die Vernetzung bestimmt.

Abstract

Die Wirkung der körperliche Signale, wie die Steifigkeit der Biomaterialien auf die Proliferation und Differenzierung von Stammzellen, die von verschiedenen Forschern untersucht worden ist. Jedoch haben die meisten dieser Ermittler Polyacrylamid Hydrogele für Stammzelle-Kultur in ihren Studien verwendet. Ihre Ergebnisse sind daher umstritten, weil diese Ergebnisse von den Besonderheiten der Polyacrylamid und nicht von der physischen Cue (Steifigkeit) von Biomaterialien stammen könnte. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Zubereitung von Hydrogele, basieren nicht auf Polyacrylamid, wo verschiedene Stamm, Zellen, einschließlich menschliche embryonale Stammzellen (ES) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Zellen gezüchtet werden können. Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit wurden von Bioinert polyvinyl Alkohol-co-Itaconic Säure (P-IA), mit Steifigkeit gesteuert durch Vernetzung Grad ändern Vernetzung Zeit vorbereitet. Die P-IA-Hydrogele veredelt mit und ohne Oligopeptide, die extrazelluläre Matrix abgeleitet wurden als zukünftige Plattform für Stammzelle-Kultur und Differenzierung untersucht. Die Kultur und den Durchgang von amniotische Flüssigkeit Stammzellen, Fettgewebe Stammzellen und humanen ES-Zellen menschlichen iPS-Zellen wird hier ausführlich beschrieben. Die Oligopeptid P-IA-Hydrogele zeigten hervorragende Leistungen, die durch ihre Steifigkeitseigenschaften induziert wurden. Dieses Protokoll berichtet die Synthese von Biomaterial, ihre Oberfläche Manipulation, zusammen mit die Steifigkeitseigenschaften und schließlich, ihre Auswirkungen auf die Stammzellen Schicksal mit Xeno-freie Kulturbedingungen zu kontrollieren. Basierend auf Studien, können solche modifizierten Substraten als zukünftigen Plattformen zu unterstützen und lenken das Schicksal der verschiedenen Stammzellen-Linie zu verschiedenen Verbindungen handeln; und weiter, Regeneration und Wiederherstellung der Funktionen der verlorenen Organs oder Gewebes.

Introduction

Das Schicksal der Stammzelldifferenzierung in einer bestimmten Linie von Zellen und die langfristige Proliferation von Stammzellen, vor allem menschlichen induzierten pluripotenten (iPS) Zellen und menschliche embryonale Stammzellen (ES), ist bekannt durch Inhibitoren, Wachstumsfaktoren, geregelt und / oder kleine bioaktiven Moleküle in Kulturmedien. Vor kurzem wurden die körperliche Signale von Biomaterialien, besonders die Steifigkeit der Zelle Kultur Biomaterialien, anerkannt, ein wichtiger Faktor, der das Schicksal der Stem Cell Proliferation und Differenzierung1,2Führung sein, 3,4,5,6. Daher haben einige Forscher damit begonnen, das Schicksal von Stammzellen, zu untersuchen, die auf Hydrogele auf Differenzierung, kultiviert werden hauptsächlich mit Polyacrylamid Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit.

Die Steifigkeit der Biomaterialien kann fokale Adhäsionen, Zellmorphologie und Zelle Phänotyp Stammzell-Haftung, vor allem in zweidimensionalen (2D) Anbau1,2,3,5steuern. Mechano-sensing Biomaterialien durch Stammzellen wird in der Regel durch fokale Adhäsion Signalisierung über Integrin-Rezeptoren gesteuert. NMMIIA, Nonmuscle Myosin IIA-abhängige Kontraktilität des Zytoskeletts von Aktin spielt eine entscheidende Rolle bei der Mechanosensing der Stammzellen in 2-D-Zelle Anbau-Systeme3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler und seinen Kollegen entwickelte eine interessante Vorstellung, die adulten Stammzellen wie (BMS) Knochenmarksstammzellen auf Zelle Kultur Biomaterialien mit eine ähnliche Steifigkeit der spezifische Gewebe kultiviert in stammt tendenziell aus Zellen zu differenzieren spezifische Gewebe5. BMS-Zellen inkubiert auf 2-D weich Polyacrylamid Hydrogele mit Kollagen Typ I (mit einer Steifigkeit von Hirngewebe vergleichbar) in Erweiterung Medien waren spontan veranlasst, in frühen Neuron Abstammungen zu differenzieren, während auf BMS-Zellen kultiviert beschichtet Hydrogele mit einer Steifigkeit ähnlich dem des Muskels oder kollagenen Knochengewebe erwiesen sich als Differenzierung in frühen Abstammungen der Myozyten und Osteoblasten, jeweils auf 2-D Polyacrylamid Hydrogele3,5induzieren. Viele Forscher haben untersucht, die Stammzell-Schicksal der Differenzierung auf Polyacrylamid kultivierten Hydrogele immobilisiert mit Kollagen Typ I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. es sollte jedoch erwähnt werden, dass einige widersprüchliche1,Berichte18,22,23,24 gibt es für die bekannte Idee vorgeschlagen von Engler Et al. 5 Dies ist weil Engler Idee5 , ausschließlich auf Polyacrylamid Hydrogele entwickelt wurde und ihre Ergebnisse aus bestimmten Merkmalen von Biomaterial (Polyacrylamid) und nicht allein aus der physischen Cue (Steifigkeit) der stammen Das Biomaterial. Daher ist es wichtig, eine andere Art von Hydrogel, zu entwickeln, von denen die Steifigkeit durch Vernetzung der Hydrogele gesteuert werden kann. Zu diesem Zweck wurden Bioinert Hydrogele entwickelt, die waren aus polyvinyl Alkohol-co-Itaconic Säure (P-IA) mit unterschiedlicher Steifigkeit, vorbereitet, die durch den Grad der Vernetzung mit einer veränderten Vernetzung Zeit25, kontrolliert wurde, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. die Stammzellen können auf nonmodified P-IA Hydrogele sowie P-IA Hydrogele mit extrazellulären Matrizen (ECMs) und Oligopeptide veredelt kultiviert werden. In einer früheren Studie25waren humanen hämatopoetischer Stammzellen (hHSCs) aus Nabelschnurblut kultiviert auf P-IA Hydrogele mit verschiedenen Steifigkeiten von 3 kPa bis hin zu 30 kPa-Speicher-Modul wo Fibronektin oder ein Oligopeptid abgeleitet Fibronektin (CS1, EILDVPST) wurde auf der P-IA-Hydrogele gepfropft. Hoher ex-Vivo Falte Ausbau des hHSCs wurde beobachtet, in der P-IA-Hydrogele veredelt mit CS1 oder Fibronektin, die eine mittlere Steifigkeit von 12 kPa bis hin zu 30 kPa25angezeigt.

Menschliche iPS und embryonaler Stammzellen können nicht auf herkömmliche Gewebekultur Polystyrol (TCP) Gerichte33,34 angebaut werden da humanen und iPS-Zellen spezifische Bindung an ECMs, z. B. Vitronectin oder Laminin erfordern weiterhin ihre Pluripotenz während langfristige Kultur. Daher wurden mehrere Strukturen der Oligopeptid gepfropft P-IA Hydrogele mit optimaler Steifigkeit Eigenschaften entworfen und hergestellt in Formationen eine einzelne Kette, eine einzelne Kette mit einem gemeinsamen Segment, eine doppelte Kette mit einem gemeinsamen Segment und eine verzweigte Art Kette-32. Oligopeptid-Sequenzen wurden von Integrin und Glykosaminoglykan-bindende Domänen des ECMs ausgewählt. Die P-IA-Hydrogele, veredelt mit Vitronectin abgeleitet Oligopeptide mit einer doppelten Kette oder gemeinsame Segment, die einen Speicher-Modul auf ca. 25 kPa haben, unterstützt die langfristige Kultur des humanen und iPS-Zellen für über 12 Passagen unter Xeno-frei und chemischen definierten Bedingungen32. Die gemeinsame Segment und doppelte Kette mit Zelle Adhäsionsmoleküle auf die Hydrogele erleichtert die Verbreitung und Pluripotenz menschliche ES und iPS Zellen32. Hier ein Protokoll für die Zubereitung von P-IA Hydrogele (mit einem Speicher Modulus von 10 kPa bis 30 kPa, gemessen unter nassen Bedingungen in der Luft) veredelt mit und ohne Oligopeptide oder ECMs beschrieben. Wird gezeigt, wie man Kultur und passage mehrere Stammzellen (einschließlich amniotische Flüssigkeit Stammzellen, Fettgewebe Stammzellen und humanen ES-Zellen menschlichen iPS-Zellen).

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Protocol

Die Experimente in dieser Studie wurden durch die Ethik-Kommissionen der Taiwan Landseed Krankenhaus (IRB-13-05) und der National Central University angenommen. Während dieser Studie wurden alle Experimente in Übereinstimmung mit allen einschlägigen und anwendbaren staatlichen und institutionellen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

1. Lösung und Medien-Vorbereitung

  1. Polymer-Reinigung
    1. P-IA mit Carbonsäure-Gruppe mit einem Grad der Hydrolyse von reinigen > 96,5 % durch P-IA mit Ethanol zu waschen. 20 g P-IA in 200 mL Ethanol in einer konischen 500-mL-Becherglas und agitieren auf einen Magnetrührer für 24-30 h Exchange das Ethanol mit frischem Ethanol jeweils ca. 8-10 h.
    2. Entfernen Sie P-IA aus dem Ethanol durch Filtration mit einem Büchner-Trichter.
    3. Trocknen Sie P-IA durch Vakuumtrocknung bei Raumtemperatur für 24 h.
      Hinweis: Es empfiehlt sich, die Falle in der Vakuumtrocknung System (durch den Abbau von Ethanol) häufig, vor allem während der ersten paar Stunden zu reinigen, weil die Falle neigt dazu, nach der Entfernung einer großen Menge von Ethanol aus P-IA verstopft
  2. Vorbereitung der P-IA-Lösung
    Hinweis: Fügen Sie das Polymer sehr langsam in das Lösungsmittel (Wasser). Es wird empfohlen, mindestens 15 Minuten hinzufügen von P-IA in das Lösungsmittel zu nehmen. Wenn Lösungsmittel in das Polymer hinzugefügt wird, würde das Polymer nicht vollständig gelöst. Achten Sie darauf, dass Sie keine explosiven Kochen der P-IA-Lösung zu generieren. Verwenden Sie Schutzbrillen bei Vorbereitung der P-IA-Lösung. Der Aufheizvorgang der P-IA-Lösung ist für kristalline P-IA auflösen Es ist vorgeschlagen (und besser), die P-IA-Lösung in einem relativ sauberen experimenteller Raum, wenn möglich vorzubereiten.
    1. Auflösen der P-IA in reinem Wasser eine Konzentration von 0,050 Gewicht % für die Zelle Anbau Experiment oder einer 0,50 Gewicht % Konzentration für die Rheometer-Messung: z. B. auflösen 50 mg P-IA in 100 mL reines Wasser für die Zellkultur und 500 mg P-IA in 100 mL de ionisiertes Wasser mit (DI) für die Rheometer-Messungen.
    2. Schütteln Sie die P-IA-Lösung für 1 h auf der Heizplatte.
      Hinweis: Zur Vermeidung von explosiven Kochen erhitzen Sie nicht die Lösung über 95 ° C. Explosive Sieden der Polymerlösung bei hohen Temperaturen kann Verbrennungen der Haut erzeugen. Daher führen Sie die Erwärmung des P-IA sehr sorgfältig, und überwachen Sie die Temperatur der P-IA-Lösung während des Heizens.
    3. Nachdem die P-IA-Lösung bei Raumtemperatur abgekühlt war, agitieren Sie die P-IA-Lösung bei Raumtemperatur für 48 h Urlaub heißen P-IA-Lösung auf der Heizplatte ohne Heizung, und dann lassen Sie es ohne Rühren bei Raumtemperatur für 20-24 h, damit Luftblasen sind nicht in der P-IA-Lösung zu präsentieren.
  3. Zubereitung der Vernetzung
    1. Die Zusammensetzung der Vernetzungsgrad Lösung 1.0 Gewicht % Glutaraldehyd von 25 % wässrige Glutaraldehyd Lösung machen, 20,0 % Na2SO Gewicht4 mit 99 % > Reinheit und 1,0 Gewicht % H2SO4. Zum Beispiel für einen 6 oder 12 nun Kultur Zellplatte, 100 µL Glutaraldehyd Lösung, 2 g Natriumsulfat und 100 µL der Schwefelsäure in 10 mL reines Wasser hinzufügen.
  4. Menschliche ES/PS Zellkulturmedien
    Hinweis: Verwendung DMEM/F12 Medien, wesentliche 6 Medien und wesentliche 8 Medien für die Zellkultur.
    1. Zurück 50 X wesentliche 8 Ergänzung langsam die Lösung über Nacht durch Auftauen im Kühlschrank 4 ° C eingefroren.
    2. Fügen Sie eine Flasche 50 X wesentliche 8 Ergänzung in eine Flasche wesentlich 8 basale Medien. Trennen Sie die Medien in kleinen Aliquote (50 mL) in 100 mL Zentrifugation Rohre, dann speichern Sie die Medien bei-20 ° C.

2. P-IA Hydrogel Gericht Vorbereitung

  1. P-IA Film Vorbereitung
    1. Injizieren Sie eine 1 mL Aliquot der P-IA-Lösung in ein 35 mm-TCP-Gericht, und trocknen Sie die Schale in einem 45 ° C Backofen für 2 Tage, einen P-IA-Film in einer sauberen Werkbank zu produzieren.
  2. Vernetzung der P-IA Hydrogel Gerichte
    1. Tauchen Sie die P-IA-Filmen in eine wässrige Vernetzung Lösung für 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 und 48 h.
      Hinweis: "P-IA -X" (z.B.P-IA-12 h) bezieht sich auf eine P-IA Hydrogel vernetzt für X h (z.B. 12 h).
    2. Spülen Sie nach Vernetzung den P-IA Hydrogele mit reinem Wasser bei Raumtemperatur und dann halten Sie Hydrogele in reinem Wasser bei Raumtemperatur in einer sauberen Werkbank.
    3. Sterilisieren Sie P-IA Hydrogele durch Eintauchen in eine 75.0 volume/volume% Ethanol-Lösung für 1 min, spülen Sie den P-IA Hydrogele in reinem Wasser sechsmal und halten Sie dann die P-IA-Hydrogele in reinem Wasser bis zur Zellkultivierung.
  3. Zubereitung von P-IA Hydrogel Speisen mit Oligopeptid oder ECM veredelt
    1. Aktivieren Sie den P-IA Hydrogele durch Eintauchen in 1 mL einer wässrigen Lösung enthält 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- Ethylcarbodiimide-Hydrochlorid (EDC) und 10 mg/mL N- Hydroxysuccinimide (NHS) für 1 h bei 37 ° C oder 4 h bei 4 ° C.
    2. Spülen Sie den P-IA Hydrogele mit 1 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) 3 Mal und Tauchen Sie den P-IA Hydrogele in einem PBS-Lösung mit 1 mL Oligopeptid (100-1.500 µg/mL) oder ECM (10-100 µg/mL) für 24 h bei 4 ° C.
      Hinweis: Die Oligopeptid-Sequenzen und ECMs für Stammzelle-Kultur verwendet, sind in Tabelle 1zusammengefasst.
    3. Waschen Sie die P-IA Hydrogele mit reinem Wasser nach Pfropfung Oligopeptid oder ECM, 3 Mal.
      Hinweis: Die P-IA-Hydrogele mit Y µg/mL Oligopeptid oder ECM (Z) veredelt sind nachstehend P-IA -Xh -Z oderP-IA-Xh -Z-Y, wo X bezieht sich auf die Vernetzung-Zeit (h), Y steht für die Konzentration der Oligopeptid oder ECM, und Z weist auf ein anderes Oligopeptid oder ECM.

3. menschliche ES/iPS Zellkultur

  1. Methode der Passage und Wartung der undifferenzierten humanen und iPS-Zellen
    1. Pflegen (z.B.WA09 oder H9) humane Embryonale Zellen oder menschliche iPS (z.B.HS0077) Zellen auf Matrigel im wesentlichen 8 Medien in 6 cm Gerichte mit standard menschlichen ES/IPS-Zelle Kultur Protokolle28,32.
    2. Inkubieren Sie in der Nähe von Zusammenfluss menschliche ES/iPS-Zellen mit 2,0 mg/mL Dispase II in DMEM/F-12 Medien bei 37 ° C für ca. 8-10 min und dann spülen Sie menschliche ES/iPS-Zellen zweimal mit DMEM/F12-Medien ab.
    3. Nach Zugabe von 2 mL DMEM/F-12 Medien menschliche ES/IPS-Zelle Kultur Gerichte, lösen schwache haftende Kolonien mit einem Schaber Zelle oder durch pipettieren.
    4. Sammeln Sie die menschlichen ES/iPS-Zellen in 15 mL Zentrifugation Röhren und Zentrifugieren Sie menschliche ES/iPS-Zellen bei 160 × g für 5 min bei 37 ° C.
    5. Nach Zentrifugation aussetzen der menschlichen ES/iPS-Zellen in 1 mL E8 Medien DMEM/F12 zu verwerfen und dann zählen die Zelldichte mithilfe eines Zelle Zählers.
    6. ES/iPS-Zellen nach der geeigneten Dichte Einstellung (1-5 x 104 -Zellen pro cm2 für Passagierung oder wie angegeben) in neue Kultur Gerichte (P-IA Hydrogele mit Oligopeptid oder ECM veredelt) zu impfen.

4. Charakterisierung der humanen ES/iPS-Zelle-Charakterisierung

  1. Bewertung der Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP)
    1. Die alkalische Phosphatase (AP) Aktivität menschlicher ES/iPS-Zellen mit einem standard alkalische Phosphatase live Färbung zu messen.
  2. Immunostaining
    1. Führen Sie Immunostaining Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 und Oct3/4 hES und Hüften Zellen, nach der herkömmlichen Protokoll28,32Pluripotenz zu untersuchen.
    2. Fügen Sie ein 0,5 mL Volumen von 4 % (Volumen/Volumen) Paraformaldehyd in jedes 24 gut Gericht, in dem die menschliche ES/iPS-Zellen wurden kultiviert und inkubieren Sie anschließend das Geschirr für 15 min bei 4 ° C, die Zellen zu beheben.
    3. Paraformaldehyd-Lösung von jedem Bohrloch abzusaugen. Dann fügen Sie 1 mL PBS pro Bohrloch und aspirieren Sie PBS um die Zellen zu spülen. Führen Sie den Spülvorgang 3 Mal.
    4. Permeabilize Zellmembranen durch Zugabe von 0,5 mL 0,3 % (Volumen/Volumen) Triton X-100 Lösung mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur.
    5. Aspirieren Sie Triton X-100 Lösung fügen Sie 300 µL 2 % (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin (BSA hinzu) in PBS (blocking-Puffer) in jede Vertiefung und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Entfernen Sie die blockierenden Puffer durch pipettieren, und fügen Sie anschließend die gewünschten Primärantikörper (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) und Tra-1-81(1:200) mit Pipette, siehe Tabelle 2) in jedem Brunnen, wo zeigt die Antikörper wurden verdünnt 1: 200 mit PBS 200-fold und inkubierten für einen Tag bei 4 ° C.
    7. Aspirieren Sie die primären Antikörper-Lösung, und waschen Sie die Zellen mit 300 µL von 0,05 % Tween 20 in PBS-Lösung 3 Mal bei Raumtemperatur.
    8. 300 µL der Sekundärantikörper hinzufügen (1: 200, siehe Tabelle 2), die sind spezifisch für die primäre IgG-Subtyp, in 2 % (Gewicht/Volumen) BSA Lösung in jedem gut und 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
    9. Waschen Sie die Zellen mit 300 µL von 0,05 % Tween 20 in PBS-Lösung 3 Mal bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    10. Analysieren Sie die gefärbten Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie oder der konfokalen Mikroskopie.
  3. Embryoid Körper Bildung
    1. Embryoid Körper (EB) Bildung an Stellen 10 und 20 untersuchen Sie Pluripotenz von humanen ES/iPS-Zellen.
      Hinweis: In der Nähe von 80 % ist Zusammenfluss in 6-Well Platten ausreichend für die Vorbereitung der EB Bildung.
    2. Spülen Sie humane Embryonale oder iPS-Zellen mit 2 mL DMEM/F-12 Medien zweimal, und dann tauchen Sie die Zellen in 1,5 mL wesentlich 6 Medien.
    3. In der Nähe von 80 % konfluierende menschliche ES oder IPS-Zellen in ca. 32 Stücke mit 200 µL Spitzen schneiden. Als nächstes lösen Sie die Zellen von den Speisen mithilfe eines Zelle Schabers.
    4. Sammeln Sie menschliche ES/iPS-Zellen und Transfer in eine 6-Well Frequenzverschiebungen Aufsatz-Schale.
    5. Tauschen Sie Essential 6 Media durch Pipettieren alte Medien und Hinzufügen von neuen Medien alle 2 Tage aus.
      Hinweis: Kultur der Zellen in der Suspension für 2 Wochen bei 37 ° C mit 5 % CO2.
    6. Nachdem der EBs waren homogen im wesentlichen 6 Medien ausgesetzt, EBs auf 24 wohlen TCP-Teller mit 0,1 Gewicht % Gelatine beschichtet Kultur übertragen und Kultur der Zellen im wesentlichen 6 Medien für eine weitere Woche.
    7. Färben die Zellen mit Antikörpern gegen Marker für die Zellen aus drei embryonalen Keimbahn-Schichten [AFP (Entoderm), GFA (Ektoderm), β III-Tubulin (Ektoderm) und SMA (Mesoderm)] und die Zellen durch die oben beschriebene Immunostaining-Methode zu bewerten.
  4. Teratom Bildung
    1. Teratom Bildung an Stellen 10 und 20 untersuchen Sie Pluripotenz von humanen ES/iPS-Zellen.
      Hinweis: 5 Gerichte von in der Nähe von 80 % Zusammenfluss in 6-Well Platten sind ausreichend für Teratom Bildung (mindestens 3 x 106 Zellen sind notwendig für die Teratom Bildung Experimente).
    2. Spülen Sie die Zellen mit 2 mL DMEM/F-12 Medien zweimal, und dann die Zelle Kultur Gerichte 1,5 mL DMEM/F-12 Medien hinzu.
    3. Schneiden Sie fast 80 % konfluierende menschliche ES oder IPS-Zellen in ca. 32 Stücke mit 200 µL Spitzen. Als nächstes lösen Sie die Zellen von den Speisen mithilfe eines Zelle Schabers.
    4. Sammeln Sie menschliche ES/iPS-Zellen in eine Zentrifugation 15 mL Tube und Zentrifugieren der Zellen bei 160 × g für 5 min bei 37 ° C.
    5. Nach Zentrifugation, unterbrechen die Zelle Pellets in 100 µL DMEM/F12 und dann mischen die Zelle pellets mit 100 µL Matrigel (Volumenverhältnis 1:1).
    6. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine vorgekühlte Spritze von-20 ° C. Injizieren Sie, insgesamt mindestens 3 × 106 Zellen subkutan in männlichen NOD-SCID (NICKEN. CB17 -Prkdascid/JNarl) Mäuse (5-8 Wochen).
    7. Nach 5-8 Wochen darum zu sezieren, mit 4,0 % (Gewicht/Volumen) Paraformaldehyd Lösung zu beheben und dann bei 4 ° c lagern
    8. Befestigen Sie das Teratom mit Paraffin, Paraffin-eingebetteten darum in Scheiben schneiden und Färben mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) mit einem Standardprotokoll28,32.
      Hinweis: Forscher können senden feste Teratom Gewebe der Gesellschaft zu beheben die darum mit Paraffin, Slice Paraffin-eingebetteten darum, und färben die Probe mit H & E, die in der Regel im Institut für Pathologie in Krankenhäusern verwendet wird.
  5. Zellkultur menschlichen Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ADS)
    1. Warmen Nährmedien (DMEM mit 1 % antimykotische antibiotische und 10 % fetalen bovine Serum (FBS)), 0,25 % von Trypsin-EDTA und PBS auf 37 ° C in einer Wasser-Bad-vor dem Gebrauch.
    2. Waschen Sie menschliche Zellen anzeigen durch Pipettieren 10 mL PBS in jeweils 6 cm Kulturschale, wo die Zellen kultiviert werden.
    3. Fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA-Lösung (0,25 %) in die 6-cm-Kultur-Gerichte und inkubieren Sie die Lösung bei 37 ° C für 5 min.
    4. Beobachten Sie die Zellen in den 6 cm Kultur Gerichten unter Mikroskopie zu bestätigen, dass die Zellen gelöst werden.
    5. Sammeln Sie die Zellen in einer 15 mL Zentrifugenröhrchen, und fügen Sie ein gleiches Volumen von Nährmedien (DMEM mit antimykotischen Antibiotikum 1 % und 10 % FBS) in die Zentrifugenröhrchen, Trypsin-EDTA zu neutralisieren.
    6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 5 min bei 37 ° C.
    7. Nach Zentrifugation verwerfen des Überstands vorsichtig durch pipettieren, ohne zu stören die Zelle Pellet.
    8. Aufschwemmen der Zellen in der Kultur, Medien, und dann die Zellen an die entsprechende Dichte (5-10 x 103 Zellen pro cm2 für Passagierung oder wie angegeben) in neue Kultur Gerichte (P-IA Hydrogele veredelt mit und ohne Oligopeptide und ECM) Samen.
  6. Menschliche Fruchtwasser Stammzellen Zellkultur (AFS)
    1. Warm Anbau-Medien (DMEM/MCDB-201 (2:3) mit 20 % fetalen bovine Serum (FBS), 5 ng/mL bFGF und antimykotischen Antibiotikum 1 %), 0,25 % von Trypsin-EDTA und PBS auf 37 ° C in einer Wasser-Bad-vor dem Gebrauch.
    2. Waschen Sie menschliche AFS Zellen durch Pipettieren 10 mL PBS in jeweils 6 cm Kulturschale, wo die Zellen kultiviert werden.
    3. Fügen Sie 1 mL Trypsin-EDTA-Lösung (0,25 %) in 6 cm Kultur Gerichte, und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 5 min.
    4. Beachten Sie, dass die Zellen auf 6cm Kultur Gerichte unter Mikroskopie bestätigen die Zellen gelöst werden.
    5. Sammeln Sie die Zellen in einer 15 mL Zentrifugenröhrchen, und fügen Sie ein gleiches Volumen von Nährmedien (DMEM/MCDB-201 (2:3) mit 20 % fetalen bovine Serum (FBS), 5 ng/mL bFGF und 1 % Antimykotikums Antibiotikum) in die Zentrifugenröhrchen, Trypsin-EDTA zu neutralisieren.
    6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 5 min bei 37 ° C.
    7. Nach Zentrifugation verwerfen des Überstands vorsichtig ohne zu stören die Zelle Pellet durch pipettieren.
    8. Aufschwemmen der Zellen in den Anbau-Medien und dann die Zellen an die entsprechende Dichte (5-10 x 103 Zellen pro cm2 für Passagierung oder wie angegeben) in neue Kultur Gerichte (P-IA Hydrogele veredelt mit und ohne Oligopeptid und ECM) Samen.

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Representative Results

P-IA Hydrogele veredelt mit ECM-abgeleitete Oligopeptid (OligoECM) oder ECM mit unterschiedlichen Elastizitäten bereiteten das Reaktionsschema folgen wie in Abbildung 1A, mit verschiedenen Arten von OligoECM (Abbildung 1 b). Die Elastizität der Hydrogele wurden durch die angewandte Vernetzung Intensität (Zeit) (Abbildung 1) geregelt. P-IA Hydrogele veredelt mit Vitronectin abgeleitet Oligopeptide, die eine Speicher-Modul von 25,3 kPa (24 h Vernetzung Zeit) hat, unterstützt die langfristige Kultur der menschlichen iPS und embryonaler Stammzellen für über 10-20 Passagen. Vor allem, P-IA Hydrogele veredelt mit einem gemeinsamen Segment (P-IA-24h-VN1G) oder eine doppelte Kette (P-IA-24h-VN2G) unterstützt die Pluripotenz von humanen iPS und ES-Zellen, die mit einer relativ geringen Konzentration von OligoECM (200-500 μg/mL) als P-IA-VN1 vorbereitet wurden Hydrogele, die erforderte, mit einer hohen Konzentration von OligoECM (> 1000 μg/mL) Aufrechterhaltung der Pluripotenz der menschlichen iPS und ES Zellen28,32.

Humanen ES-Zellen gewarteten Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) Kultur auf andere synthetisierten Beschichtungsstoffe (z.B., Synthemax II) beschichtet Gerichte und P-IA-24 h-VN1 Hydrogel Gerichte (Abbildung 2)28verschoben wurden. Humanen ES-Zellen kultiviert auf handelsüblichen Beschichtung, die Gerichte wurden gefunden, um leichter, vor allem am Rand der Kolonien (Abbildung 2a und 2 c), differenzieren während humanen ES-Zellen ihre Pluripotenz auf P-IA-24 h-VN1-1000 behaupten konnte Hydrogel Gerichte, weil die Körperzellen nicht von der Morphologie des humanen ES-Zellen auf P-IA-24 h-VN1-1000 Hydrogel Gerichte (Abbildung 2 b und 2d)28beobachtet werden konnte.

Die Pluripotenz von humanen (Abbildung 3A) und (Abb. 3 b) IPS‐Zellen kultiviert auf P-IA - 24 h Hydrogele mit OligoECM (P-IA-24 h-VN1-1000, P-IA-24 h-VN1G-1000, P-IA-24 h-VN2C), sowie konventionelle rekombinante Vitronectin (veredelt rVitronectin)-beschichtete Gerichte, basierend auf den Ausdruck der pluripotenten Maker Proteine (Nanog, Sox2 und Oct3/4) ausgewertet wurde nach die Zellen, auf jedes Gericht in Xeno-freien Bedingungen mit wesentlichen 8 Medien gezüchtet wurden für 1032Passagen. Diese Pluripotenz Proteine wurden zufriedenstellend auf menschliche iPS und ES-Zellen kultiviert auf P-IA Hydrogele veredelt mit OligoECM sowie rVitronectin-beschichtete Gerichte in Xeno-freien Bedingungen ausgedrückt.

Bewertung der Fähigkeit der Differenzierung in die Zellen aus drei Mikrobeschichten in Vitro (EB-Formation) und in Vivo (Teratom Bildung) ist unerlässlich, die Pluripotenz von humanen und iPS-Zellen nach Kultivierung auf synthetische überprüfen Biomaterialien. Daher auf P-IA-OligoECM Hydrogel Gerichte wurden humanen ES-Zellen (Abbildung 4) und menschliche iPS-Zellen (Abbildung 5) angebaut und rekombinante Vitronectin-beschichtete Gerichte für 10 Passagen, und anschließend die Zellen wurden kultiviert in der Schwebe zu bilden EBs. Die EBs wurden weiter auf Gelatine beschichtet Gerichte für ein paar Wochen zu beobachten, die Fähigkeit der Zellen, auf die Gerichte (Abbildung 4A und Abbildung 5A)32verbreitet angebaut. Differenzierte humanen (Abbildung 4 b) und (Abb. 5 b) iPS-Zellen wurden Immunostained für Proteine, die aus drei Mikrobeschichten abgeleitet: Alpha-Fetoprotein (AFP, Entoderm), Aktin glatte Muskulatur (SMA, Mesoderm) und glial fibrillary sauren Protein (GFAP Ektoderm)32. Menschlichen iPS und embryonaler Stammzellen wurden gefunden, um in den Zellen aus allen drei Mikrobeschichten, zeigt eine weitere Überprüfung der Pluripotenz von humanen iPS und embryonaler Stammzellen differenzieren auch nach Anbau auf P-IA Hydrogele veredelt mit OligoECM in Xeno-frei Bedingungen für die langfristige (Durchgang > 10 Durchgänge).

Auch wurde die Möglichkeit der Differenzierung von humanen ES-Zellen in die Zellen stammen aus drei Mikrobeschichten in Vivo (Teratom Bildung Assay) bewertet. Humanen ES-Zellen, welche in Xeno-freie Kulturbedingungen für 10 Passagen auf P-IA-VN1-1000 (Abb. 6A) und P-IA-VN2C-1000 (Abb. 6 b) kultiviert wurden, waren NOD SCID Mäuse32subkutan injiziert. Die Teratombildung wurden von den Mäusen isoliert und Teratom Gewebeschnitte wurden fixiert und gefärbt mit H & E (Abb. 6A und 6 b)32. Die darum angezeigt die Existenz von Zellen aus allen drei Mikrobeschichten: Entoderm (Darmepithel, Abbildung 6A(b) und 6B(b)), Mesoderm (Knorpel, Abbildung 6A(c) und 6B(c)) und Ektoderm ( Neuroepithelium, Abbildung 6A(d); retinalen Pigmentepithels, Abbildung 6 b(d)). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass humanen ES-Zellen kultiviert auf P-IA-24h-VN1-1000 und P-IA-24h-VN2C-1000 in Xeno-freien Bedingungen für 10 Passagen können unterschieden werden in Zellen, die aus drei Mikrobeschichten, darauf hinweist, dass ihre Pluripotenz beibehalten wird, in Vivo.

Menschliche AFS Zellen waren auch nicht modifizierte P-IA Hydrogel, P-IA-OligoECM Hydrogel und TCP-Gerichte im Ausbau Medien kultiviert. Abbildung 7 zeigt die Morphologien menschlicher AFS-Zellen kultiviert nach vier Tagen der Kultur in P-IA und P-IA-OligoECM Hydrogel Gerichte mit Elastizitäten (E') von 12,2 (Vernetzung Zeit = 6 h), 18,3 (Vernetzung Zeit = 12 h), 25,3 (Vernetzung Zeit = (24 Stunden), und 30,4 kPa (Vernetzung Zeit = 48 h) mit einer OligoECM Konzentration von 0 oder 50 μg/mL sowie TCP mit 3-12 GPa Steifigkeit30Gerichten.

Menschliche AFS Zellen konnte nicht vermehren sich auf P-IA Hydrogel Gerichte mit oder ohne OligoECM als die Steifigkeit des P-IA Hydrogele weniger als 11 kPa (PV - 2 h, PV-2 h-Y PV - 4 h und PV-4 h-Y), war während menschliche AFS Zellen mit oder ohne OligoECM vermehren konnte beim E " war größer als 12 kPa, mit Ausnahme der P-IA - 6 h und PV-IA-6 h-COL1 Hydrogel-Gerichte. P-IA - 6h und P-IA-6h-COL1 scheinen nicht günstig für die Kultur der menschlichen AFS Zellen sein, weil die weiche Zelle Kultur Biomaterialien der Zellzyklus Fortschreiten30Einhalt zu Gebieten.

Die oben genannten Ergebnisse legen nahe, dass P-IA Hydrogel Gerichte ein optimales Material für lange Begriff Stammzellen Anbau sind und die Pluripotenz der Stammzellen durch Auswahl an spezifische Steifigkeit und OligoECM, sowie die optimale Reaktion Konzentration der OligoECM pflegen (Oberflächendichte des OligoECM).

Figure 1
Abbildung 1: Vorbereitung der P-IA Hydrogele mit OligoECM oder ECM veredelt. (A) Regelung der Reaktion für P-IA Hydrogele veredelt mit ECM und ECM-abgeleitete Oligopeptid (OligoECM)29. Copyright 2015. Adaptiert mit Erlaubnis von The Royal Society of Chemistry. (B) Design und Reihenfolge der Oligopeptide auf P-IA Hydrogele aufgepfropft. Einzelne Kette Oligopeptide (P-IA-BSP, P-IA-VN1 und P-IA-HBP1), einzelne Kette Oligopeptide mit einem gemeinsamen Segment (P-IA-VN1G) und dual-Ketten (P-IA-VN2C und P-IA-HBP2C) und ECM (P-IA-ECM) wurden auf P-IA Hydrogele32gepfropft. Unter einer Creative Commons Attribution Lizenz angepasst. (C) Steifigkeit des P-IA Hydrogele nach verschiedenen Perioden der Vernetzungsgrad29vorbereitet. Copyright 2015. Adaptiert mit Erlaubnis von The Royal Society of Chemistry. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Vergleich der menschlichen ES Zellen Kulturen auf P-IA-24h-VN1 Hydrogele und handelsüblichen Beschichtung Gerichte. Morphologie des humanen ES-Zellen (WA09) auf handelsüblichen Beschichtung (a, b) und P-IA-24 h-VN1-1000 (c, d) Gerichten in der Passage 1 kultiviert, wenn humanen ES-Zellen aus dem Anbau auf Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) in verschoben wurden Anbau auf handelsüblichen Beschichtung Gerichte oder PVA-24h-VN1-1000 Gerichte. Rote Pfeile zeigen die differenzierte humanen ES-Zellen. Die Skala Balken zeigen 50 µm (a, b) und 100 µm (C, d)28. Unter einer Creative Commons Attribution Lizenz angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Charakterisierung der Pluripotenz menschliche ES und IPS-Zellen auf P-IA Hydrogele mit verschiedenen Oligopeptid Designs veredelt. (A) Ausdruck der Pluripotenz Proteine Nanog (rot), Sox2 (grün) und Oct3/4 (grün) auf humanen ES (H9)-Zellen analysiert, indem Immunostaining mit dual Färbung mit Hoechest33342 für nukleare Kennzeichnung (blau) nach Kultivierung auf (eine) P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000, und (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 Hydrogele, und (d) rekombinante Vitronectin (rVitronectin)-Gerichte unter Xeno-freien Bedingungen für 10 Passagen beschichtet. (B) Ausdruck der Pluripotenz Proteine Nanog (rot), Sox2 (grün) und Oct3/4 (grün) auf menschliche iPS-Zellen analysiert, indem Immunostaining mit dual Färbung mit Hoechest33342 für nukleare Kennzeichnung (blau) nach Kultivierung auf (eine) P-IA-24 h-VN1-1000 Hydrogel, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 Hydrogel und (c) rekombinante Vitronectin (rVitronectin)-Hydrogele beschichtet Gerichte Xeno-freien Bedingungen für 1032Passagen. Die Skala Balken zeigen 50 µm. Adapted unter einer Creative Commons Attribution License. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Charakterisierung von der Fähigkeit der Differenzierung von humanen Zellen auf P-IA Hydrogele mit verschiedenen Oligopeptid Designs veredelt. (A) Morphologie der Zellen von EBs aus humanen ES (H9)-Zellen nach Kultivierung auf (eine) P-IA-24 h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000, und (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 Hydrogele und (d) rekombinante differenziert Vitronectin (rVitronectin)-Gerichte unter Xeno-freien Bedingungen für 10 Passagen beschichtet. Die Skala Balken 100 µm. (B) Ausdruck einer Ektoderm Protein (GFAP, rot), Mesoderm Protein (SMA, grün) und Entoderm Protein (AFP, grün) in humanen ES (H9)-Zellen ausgewertet durch Immunostaining mit dual Färbung mit Hoechest33342 für nukleare Kennzeichnung nach Kultivierung auf P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000 und P-IA-24h-VN2C-1000 Hydrogele und auf rekombinante Vitronectin (rVitronectin) (blau)-beschichtet Gerichte Xeno-freien Bedingungen für 1032Passagen. Die Skala Balken zeigen 50 µm. Adapted unter einer Creative Commons Attribution License. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Charakterisierung der Differenzierung Fähigkeit der menschlichen IPS-Zellen auf P-IA Hydrogele mit verschiedenen Oligopeptid Designs veredelt. (A) Morphologie der Zellen von EBs von humanen iPS (HPS0077) Zellen differenziert nach Kultivierung auf (eine) P-IA-24 h-VN1-1000 Hydrogele, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 Hydrogele und (c) rekombinante Vitronectin (rVitronectin)- beschichtete Platten Xeno-freien Bedingungen für 10 Passagen. Die Skala Balken 100 µm. (B) Ausdruck einer Ektoderm Protein (GFAP, rot), Mesoderm Protein (SMA, grün) und Entoderm Proteins (AFP, grün) in den menschlichen (HPS0077) IPS‐Zellen analysiert, indem Immunostaining mit dual Färbung mit Hoechest33342 für nukleare Kennzeichnung nach Kultivierung auf (eine) P-IA-24 h-VN1-1000 Hydrogele, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 Hydrogele und (c) rekombinante Vitronectin (rVitronectin) (blau)-beschichtet Gerichte Xeno-freien Bedingungen für 1032Passagen. Die Skala Balken zeigen 50 µm. Adapted unter einer Creative Commons Attribution License. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Charakterisierung von der Fähigkeit der Differenzierung von humanen (H9) Zellen in Vivo nach Kultivierung auf P-IA-24 h-VN1 und P-IA-24 h-VN2C Hydrogele. (A) (ein) Bild von einem Teratom durch Injektion mit humanen embryonalen Zellen nach Kultivierung auf P-IA-24 h-VN1-1000 Hydrogele unter Kulturbedingungen Xeno-freie Zelle nach 10 Passagen. Geweben einschließlich (b) Darmepithels (Entoderm), kann (c) Knorpel (Mesoderm) und (d) Neuroepithelium (Ektoderm) beobachtet werden. (B) (ein) Bild von einem Teratom durch Injektion mit humanen embryonalen Zellen nach Kultivierung auf P-IA-24 h-VN2C-1000 Hydrogele unter Kulturbedingungen Xeno-freie Zelle nach 10 Passagen. Geweben einschließlich (b) Darmepithels (Entoderm), (c) Knorpel (Mesoderm) und (d) retinalen Pigmentepithels (Ektoderm)32zu erkennen. Die Skala Balken 100 µm. Adapted unter einer Creative Commons Attribution License. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Morphologie des menschlichen AFS-Zellen kultiviert auf TCP-Gerichte und P-IA Hydrogel Gerichte mit oder ohne ECM-abgeleitete Oligopeptide nach 4 Tagen Kultur immobilisiert. (A) Morphologie der menschlichen AFS-Zellen auf TCP-Gerichte. (B) Morphologie der menschlichen AFS Zellen auf P-IA - 6 h und P-IA-6 h -Z Hydrogel Gerichte (P-IA - 6 h, P-IA-6 h-COL1-50, P-IA-6 h-FN1-50, P-IA-6 h-VN1-50, P-IA-6 h-HBP1-50 und P-IA-6 h-cRGD-50). (C) Morphologie der hAFCs P-IA - 12 h und P-IA-12 h -Z Hydrogel Gerichte (P-IA - 12 h, P-IA-12 h-COL1-50, P-IA-12 h-FN1-50, P-IA-12 h-VN1-50, P-IA-12 h-HBP1-50 und P-IA-12 h-cRGD-50). (D) Morphologie der menschlichen AFS Zellen auf P-IA - 24 h und P-IA-24 h -Z Hydrogel Gerichte (P-IA - 24 h, P-IA-24 h-COL1-50, P-IA-24 h-FN1-50, P-IA-24 h-VN1-50, P-IA-24 h-HBP1-50 und P-IA-24 h-cRGD-50). (E) Morphologie der menschlichen AFS Zellen auf P-IA - 48 h und P-IA-48 h -Z Hydrogel Gerichte (P-IA - 48 h, P-IA-48 h-COL1-50, P-IA-48 h-FN1-50, P-IA-48 h-VN1-50, P-IA-48 h-HBP1-50 und P-IA-48 h-cRGD-50). Die Skala Balken 100 μm30. Copyright 2017. Adaptiert mit Erlaubnis von The Royal Society of Chemistry. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Namen von Material / Ausrüstung Abkürzung
GTPGPQGIAGQRGVV COL1
GACRGDCLGA Zyklische RGD (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectin rVN
Fibronektin FN

Tabelle 1: ECM-abgeleitete Oligopeptid-Sequenzen und ECM in dieser Studie verwendet.

Antikörper Konzentration (Verdünnung)
NANOG 1: 200
SSEA4 1: 200
OCT3/4 1: 200
Sox2 1: 200
Glatte Muskulatur Aktin 1: 200
(Α-SMA) 1: 200
AFP 1: 200
GFAP 1: 200
Alexa Fluor 555-konjugierten Goat Anti-Maus 1: 200

Tabelle 2: Für Immunostaining in dieser Studie verwendeten Antikörper.

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Discussion

P-IA-OligoECM P-IA-ECM Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit für den langfristigen Ausbau der humanen und iPS-Zellen erhalten ihre Pluripotenz für mehr als zehn Passagen in Xeno-freien Bedingungen sowie für die Kultur der menschlichen AFS, ADS Zellen entstanden, und Blutstammzellen25,28,32. P-IA Hydrogele immobilisiert mit OligoECM sind ein ausgezeichneter Kandidat für Zelle Anbau Materialien zu untersuchen, die Wirkung von Zelle Kultur Materialien auf das Schicksal der Differenzierung und Proliferation von verschiedenen Arten von Stammzellen sowie Primärzellen und Krebszellen.

P-IA-Lösung sollte transparent sein, wenn P-IA-Lösung an die Gerichte zaubert. Die Vernetzung Zeit entscheidet die Intensität der Vernetzung der P-IA Hydrogele. 24 h Vernetzung von P-IA Hydrogele erzeugt optimale Hydrogele menschliche ES/iPS-Zellkultur. Alle Oligopeptide und ECMs auf P-IA Hydrogele mithilfe dieses Protokolls haben wo die Oligopeptide und ECMs freie Aminogruppen25,28,29,30,31, aufgepfropft werden können 32. Oberflächendichte der Oligopeptide oder ECMs kann durch Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie (XPS) Messungen nachgewiesen werden, obwohl XPS keinen absoluten Wert der Oberfläche Dichte darstellen, aber die Existenz der Oligopeptide oder ECMs kann sicher sein analysiert.

P-IA Hydrogele mit und ohne aufgepfropfte Oligopeptide oder ECMs können vorbereitet werden, haben die Speicher-Modul von 3-30 kPa, abhängig von der Vernetzung. Es ist ziemlich schwierig, P-IA Hydrogele mit weniger Speicher-Modul als 3 kPa und höhere Speicher-Modul als 30 kPa25,28,29,30,31,32vorzubereiten. Dies ist die Einschränkung der vorliegenden Hydrogel Vorbereitung Methode der chemischen Vernetzung von P-IA Hydrogele. Dieses Protokoll bietet jedoch eine weitere Möglichkeit, die Hydrogele mit unterschiedlicher Elastizität, die die Kultur von Primärzellen, Krebszellen oder Stammzellen einschließlich humanen und iPS-Zellen zu unterstützen, aber sind nicht aus Polyacrylamid. Vor allem, humanen und iPS-Zellen können nicht auf Polyacrylamid Hydrogele vermehren, aber auf P-IA Hydrogele wie in Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5und Abbildung 6gezeigt vermehren können. In der Tat unterstützt P-IA-24 h-VN1 Hydrogele menschliche ES Zellkultur besser als handelsübliche Beschichtung Gerichte (Abbildung 2). P-IA Hydrogele sind daher für die Kultur des humanen und iPS-Zellen vorzuziehen.

Es wäre interessant zu untersuchen, optimale Elastizität die Hydrogele, wo humanen und iPS-Zellen in bestimmten Linien der Zellen wie Kardiomyozyten35, retinalen Pigment Epithel36und β-Zellen6TH differenziert + Zellen6 für die zukünftige Entwicklung der regenerativen Medizin.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde teilweise durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan unter Grantnummern 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 und 104-2221-E-008-107-MY3 unterstützt. Diese Forschung wurde auch durch die Taiwan-Landseed-Krankenhaus-Projekt (NCU-LSH-105-A-001) unterstützt. Eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung (Nummer 15K 06591) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan wird auch anerkannt. A. Higuchi möchte für das International Scientific Partnership Program (Praktizierende-0062) Vizerektorat für Studium und Forschung, König-Saud-Universität, Riyadh 11451, Königreich Saudi-Arabien anerkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

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References

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Biotechnologie Ausgabe 132 Hydrogel induzierte pluripotente Stammzellen embryonale Stammzellen Elastizität Zellkultur Oligopeptid Oberflächenmodifizierung nanosegment
Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen
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Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., … More

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

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