JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Mänskliga pluripotenta stamceller kultur på Polyvinyl alkohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels med varierande stelhet Xeno-fria villkor

Published: February 03, 2018
doi:
10.3791/57314
, , , , , , , , , , ,
1Department of Chemical and Materials Engineering,National Central University, 2Department of Botany and Microbiology,King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute,Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics,National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology,Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine,Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology,Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

Summary

Ett protokoll presenteras för att förbereda polyvinyl alkohol-co-itaconic acid hydrogels med varierande stelhet, som var ympade med och utan oligopeptider, för att undersöka effekten av styvheten i biomaterial på differentiering och spridning av stamceller. Styvheten i hydrogels kontrollerades av crosslinking tiden.

Abstract

Effekten av fysiska ledtrådar, såsom styvheten i biomaterial om spridning och differentiering av stamceller, har undersökts av flera forskare. Men har de flesta av dessa utredare använt polyakrylamid hydrogeler för stamceller kultur i sina studier. Därför, deras resultat är kontroversiella eftersom dessa resultat kan härröra från polyakrylamid särdrag och inte från den fysiska cue (stelhet) av biomaterial. Här beskriver vi ett protokoll för att förbereda hydrogels, som inte bygger på polyakrylamid, där olika stamceller, celler, inklusive mänskliga embryonala stamceller (ES) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPS), kan vara odlade. Hydrogeler med varierande stelhet var beredda från bioinert polyvinyl alkohol-co-itaconic syra (P-IA), med styvhet kontrolleras av crosslinking grad av crosslinking tiden förändras. De P-IA hydrogels ympade med och utan oligopeptider härrör från extracellulär matrix undersöktes som en framtida plattform för stamceller kultur och differentiering. Kultur och passage av fostervatten vätska stamceller, adipose-derived stamceller, mänskliga ES-celler och mänskliga iPS-celler beskrivs i detalj här. Den oligopeptide P-IA hydrogels visade överlägsen föreställningar, som var induceras av deras styvhet egenskaper. Detta protokoll rapporterar syntesen av biomaterial, deras yta manipulation, tillsammans med kontrollera egenskaperna stelhet och slutligen deras inverkan på stamceller öde med hjälp av xeno-fri odlingsbetingelser. Baserat på senaste studier kan sådana modifierade substrat fungera som framtida plattformar att stödja och styra ödet för olika stamceller linje till olika kopplingar; och ytterligare, återhämta sig och återställa den förlorade organ eller vävnad.

Introduction

Ödet för stamcellers differentiering in en specifik härstamning av celler och långsiktiga spridningen av stamceller, särskilt mänskliga inducerade pluripotenta (iPS) och mänskliga embryonala stamceller (ES) celler, är känd för att regleras av hämmare, tillväxtfaktorer, och / eller små bioaktiva molekyler i kultur media. Nyligen, de fysiska ledtrådar biomaterial, särskilt styvheten i cell kultur biomaterial, har erkänts vara en viktig faktor som styr ödet för stem cell proliferation och differentiering1,det2, 3,4,5,6. Därför har flera forskare börjat utreda ödet för stamceller, som är odlade på hydrogels, på differentiering, främst använder polyakrylamid hydrogels med varierande stelhet.

Styvheten i biomaterial kan styra fokal sammanväxningar, cellmorfologi, cell fenotyp och stem celladhesion, särskilt i tvådimensionell (2D) odling1,2,3,5. Mechano-sensing biomaterial av stamceller styrs generellt av fokal vidhäftning signalering via integrin receptorer. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA-beroende kontraktilitet i cytoskeleton av aktin spelar en avgörande roll i den mechanosensing processen att stamceller i 2-D-cell odling system3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler och hans kollegor utvecklat en intressant föreställning som vuxna stamceller, såsom benmärg stamceller (BMS) odlas på cell kultur biomaterial med en liknande stelhet som specifika vävnader, tenderar att differentieras till celler härstammar från specifika vävnader5. BMS cellerna inkuberas i 2-D mjuk polyakrylamid hydrogels belagd med kollagen typ I (med en stelhet som är jämförbar med hjärnans vävnader) i expansion media förmåddes spontant att differentieras till tidig neuron utvecklingslinjerna medan BMS celler odlade på hydrogeler med en stelhet som är liknande till det av muskel- eller kollagena ben vävnader befanns inducerar differentiering in tidiga härstamningar myocyter och osteoblaster, respektive, på 2-D polyakrylamid hydrogels3,5. Många forskare har undersökt stamceller öde differentiering odlade på polyakrylamid hydrogels orörlig med kollagen typ I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. det bör dock nämnas att vissa motstridiga rapporter1,18,22,23,24 finns för den välkända idé som föreslagits av Engler o.a. 5 detta är eftersom Englers idé5 utvecklades enbart på polyakrylamid hydrogels och deras resultat har sitt ursprung från särdrag av biomaterial (polyakrylamid) och inte enbart från den fysiska cue (stelhet) av biomaterial. Det är därför viktigt att utveckla en annan typ av hydrogel, varav styvheten kan styras av crosslinking av hydrogels. För detta ändamål framkallades bioinert hydrogels, som utarbetades från polyvinyl alkohol-co-itaconic syra (P-IA) med annorlunda styvhet, som kontrollerades av crosslinking graden med en föränderlig crosslinking tid25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. stamcellerna kan odlas på nonmodified P-IA hydrogels, liksom P-IA hydrogels ympade med extracellulära matriser (ECMs) och oligopeptider. I en tidigare studie25odlades mänskliga hematopoetiska stamceller (hHSCs) från navelsträngsblod på P-IA hydrogels med annorlunda styvhet värden sträcker sig från en 3 kPa till 30 kPa lagring modulus där Fibronektin eller en oligopeptide härrör från Fibronektin (CS1, EILDVPST) var ympade på den P-IA hydrogels. Hög ex vivo fold expansion av hHSCs observerades i den P-IA hydrogels ympade med CS1 eller Fibronektin, som visas en mellanliggande styvhet alltifrån 12 kPa till 30 kPa25.

Mänskliga iPS och ES-celler kan inte odlas på konventionella vävnadsodling polystyren (TCP) rätter33,34 eftersom mänskliga ES och iPS-celler kräver specifik bindning till ECMs, såsom Aktiebolaget Trav & galopp eller laminin att upprätthålla deras pluripotens under långsiktig kultur. Därför var flera strukturer av oligopeptide-ympade P-IA hydrogels med optimal styvhet egenskaper konstruerade och iordningställda i formationer av en enda kedja, en enda kedja med ett gemensamt segment, en dubbel kedja med ett gemensamt segment och en grenad-typ kedjan32. Oligopeptide sekvenser valdes från integrin – och glykosaminoglykan-bindning domäner för ECMs. Den P-IA hydrogels ympade med Aktiebolaget Trav & galopp-derived oligopeptider med en dubbel kedja eller gemensamma segment, som har en lagring modulus på ungefärligt 25 kPa, stöds den långsiktiga kulturen av mänskliga ES och iPS-celler för över 12 passager under xeno-fri och kemiska definierade villkor32. Den gemensamma segment och dubbel kedja med Celladhesionmolekylar på hydrogels underlättat spridningen och pluripotenta mänskliga ES och iPS celler32. Här, ett protokoll för att förbereda P-IA hydrogels (med en lagring modulus från 10 kPa till 30 kPa, som mättes under våta betingelser i luften) ympade med och utan oligopeptider eller ECMs beskrivs. Hur kultur och passage flera stamceller (inklusive amniotiska vätskan stamceller, adipose-derived stamceller, mänskliga ES-celler och mänskliga iPS-celler) visas.

Protocol

Experimenten i denna studie godkändes av de etiska kommittéerna av Taiwan Landseed sjukhuset (IRB-13-05) och National Central University. Alla experiment genomfördes i enlighet med alla relevanta och tillämpliga statliga och institutionella riktlinjer och förordningar under denna studie. 1. lösning och Media förberedelse Polymer rening Rena P-IA med karboxylsyra grupp med en grad av hydrolys av > 96,5% genom tvättning P-IA med etanol. Placera 20 g …

Representative Results

P-IA hydrogels ympade med ECM-derived oligopeptide (oligoECM) eller ECM med olika elasticiteter var förberedda genom att följa reaktionsformel, som kan ses i figur 1A, använda olika typer av oligoECM (figur 1B). Elasticiteterna av hydrogels reglerades av tillämpad crosslinking intensiteten (tid) (figur 1 c). P-IA hydrogels ympade med Aktiebolaget Trav & galopp-derived oligopeptider, som har en la…

Discussion

P-IA-oligoECM och P-IA-ECM hydrogels med varierande stelhet utvecklades för långsiktig utbyggnad av mänskliga ES och iPS-celler att upprätthålla deras pluripotency för över tio passager i xeno-fria förhållanden, liksom för kulturen av mänskliga AFS celler, annonser celler, och hematopoetiska stamceller25,28,32. P-IA hydrogels orörlig med oligoECM är en utmärkt kandidat för cell odling material att undersöka effek…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning var delvis stöds av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan under grant nummer 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 och 104-2221-E-008-107-MY3. Denna forskning stöddes också av Taiwan Landseed Hospital Project (NCU-LSH-105-A-001). Ett bidrag för vetenskaplig forskning (nummer 15K 06591) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan är också erkänt. A. Higuchi vill erkänna för den internationella vetenskapliga Partnership-Program (ISPP-0062) Vice rektoratet för forskarutbildning och forskning, King Saud University, Riyadh 11451, Saudiarabien.

Materials

GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

Tags

Polyvinyl Alcohol-co-itaconic Acid HydrogelsStem Cell CultureXeno-free ConditionsHydrogel ElasticityStem Cell DifferentiationCrosslinkingHydrogel PreparationP-IA Films

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sung, T., Li, H., Higuchi, A., Ling, Q., Yang, J., Tseng, Y., Pan, C. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image