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Bioengineering

폴 리 비닐 알코올-Co-Itaconic 산 Hydrogels 이종 없는 조건 하에서 다양 한 강성에 인간의 Pluripotent 줄기 세포 문화

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

프로토콜은 차별화에 생체 재료의 강성 효과 확산의 조사와 펩타이드, 없이 투입 했다 다양 한 뻣 뻣 함과 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 hydrogels를 준비 하 여 줄기 세포입니다. hydrogels 강성 가교에 의해 통제 되었다.

Abstract

확산에 생체 재료의 강성과 줄기 세포의 분화와 같은 물리적 단서의 효과가 여러 연구자에 의해 조사 했다. 그러나,이의 대부분 polyacrylamide hydrogels 그들의 연구에서 줄기 세포 배양에 대 한 사용. 따라서, 그들의 결과 그 결과 polyacrylamide의 특정 한 특성에서와 생체 재료의 물리적 큐 (강성)에서 발생 될 수 있습니다 때문에 논란이 있습니다. 여기, 우리가 polyacrylamide, 다양 한 줄기, 인간 미 발달 줄기 (ES) 세포를 포함 하 여 셀 및 인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포를 배양 수 있습니다 어디를 기반으로 하지 hydrogels를 준비 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 다양 한 강성과 Hydrogels 강성 가교 시간을 변경 하 여 가교 정도 의해 제어와 bioinert 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 (P-IA)에서 준비 되었다. 펩타이드 기질에서 파생 하지 않고 투입 P-IA hydrogels 줄기 세포 배양 및 분화에 대 한 미래의 플랫폼으로 조사 되었다. 문화와 액체 양수 줄기 세포, 줄기 세포 지방이 많은 파생, 인간 ES 세포, 및 인간 iPS 세포의 통로 여기에 설명 되어 있습니다. 펩타이드 P-IA hydrogels가 보였다 우수한 공연, 그들의 강성 속성에 의해 유도 했다. 이 프로토콜의 소재, 강성 속성 및 마지막으로, 이종 무료 문화 조건을 사용 하 여 줄기 세포 운명에 미치는 영향을 제어 하는 함께 그들의 표면 조작, 합성을 보고 합니다. 최근 연구를 바탕으로, 그러한 수정된 기판 지원 하 고 다른 연계; 다양 한 줄기 세포 라인의 운명을 직접 미래의 플랫폼으로 작동할 수 있다 또한, 재생성 하 고 잃어버린된 기관 또는 조직의 기능을 복원 합니다.

Introduction

세포와 줄기 세포, 특히 인간 유도 만능 (iPS) 세포와 인간 배아 줄기 (ES) 세포의 장기 확산의 특정 계보에 줄기 세포 분화의 운명을 억제제, 성장 요인에 의해 통제 될 것으로 알려져 고 / 또는 문화 미디어에 작은 생리 활성 분자입니다. 최근, 생체 재료, 특히 셀 문화 생체 재료의 강성의 물리적 신호 줄기 세포 확산 그리고 감 별 법1,2,의 운명을 인도 하는 중요 한 요소가 될 인정을 받고 있다 3,4,,56. 따라서, 여러 연구자 다양 한 강성과 polyacrylamide hydrogels를 사용 하 여 주로 hydrogels, 차별화에 교양 줄기 세포의 운명을 조사 하기 시작 했습니다.

생체 재료의 강성은 초점 접착, 세포 형태학, 셀 형 및 줄기 세포 접착, 2 차원 (2 차원) 재배1,2,,35에 (서) 특히 제어할 수 있습니다. 줄기 세포에 의해 생체 재료의 메카노 감지 일반적으로 초점 접착 integrin 수용 체를 통해 신호에 의해 제어 됩니다. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA 종속 수축 말라의 골격의 중요 한 역할을 2 차원 셀 재배 시스템3,,45, 에서 줄기 세포의 mechanosensing 과정에서 7,,89,,1011.

Engler와 그의 동료 성인 줄기 세포, 골 수 줄기 (BMS) 세포는 특정 조직에 유사한 강성과 셀 문화 생체에 재배 등에서 유래 하는 세포로 분화 하는 경향이 있는 재미 있는 개념 개발 특정 조직5. BMS 셀 2 차원 소프트 polyacrylamide hydrogels 콜라겐 유형 I (강성 뇌 조직의 비교) 확장 미디어에 저절로 BMS 셀에 경작 하는 반면 초기 신경 혈통으로 차별화 하는 유도 했다 코팅에 인 큐베이 팅 collagenous 뼈 조직 또는 근육의 강성과 hydrogels 2 차원 polyacrylamide hydrogels3,5에 각각, myocytes 및 osteoblasts의 이른 계보에 차별화를 유도 하는 것 발견 되었다. 많은 연구 자들은 분화의 줄기 세포 운명 조사 polyacrylamide에 교양 hydrogels 콜라겐 움직일 유형 I12,,1314,,1516 , 17 , 18 , 19 , 20 , 그러나 21., 그것은 언급 한다는 몇 가지 모순 보고1,,1822,,2324 Engler에 의해 제안 하는 잘 알려진 아이디어에 대 한 존재 외. 5 이것이 Engler의 아이디어5 polyacrylamide hydrogels에 전적으로 개발 되었다 및 그들의 결과의 물리적 큐 (강성) 아니라 전적으로 및 소재 (polyacrylamide)의 특정 한 특성에서 유래 하기 때문에 소재입니다. 따라서, 그것은의 강성은 hydrogels의 가교에 의해 통제 될 수 있다, 하이드로 겔의 다른 유형을 개발 하는 것이 중요. 이 위해 bioinert hydrogels 개발 되었다는 가교 정도는 변화 가교 시간25, 이전에 의해 통제 되었다 다른 강성으로 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 (P-IA)에서 준비 했다 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. 줄기 세포 nonmodified P-IA hydrogels P-IA hydrogels 세포 외 매트릭스 (ECMs)와 펩타이드 융합에 재배 될 수 있다. 이전 연구25의 경우, 인간 조 혈 줄기 세포 (hHSCs) 탯 줄 혈액에서 다른 강성 값에서 3 kPa fibronectin 또는 한 펩타이드에서 파생 된 30 kPa 저장 모듈러스와 P-IA hydrogels에 재배 했다 fibronectin (CS1, EILDVPST)는 P-IA hydrogels에 융합 되었다. HHSCs의 배 확장 높은 비보 전 P-IA hydrogels CS1 또는 30 kPa2512 kPa에서 배열 하는 중간 강성 표시 fibronectin 투입에서 관찰 되었다.

인간 iPS와 ES 세포 수 수 재배 기존의 조직 문화 폴리스 티 렌 (TCP) 요리33,34 에 인간의 ES와 iPS 세포 vitronectin 등 그들의 pluripotency를 유지 하기 위해 laminin ECMs, 특정 바인딩이 필요로 하기 때문에 중 장기적인 문화. 따라서, 최적의 강성 특성을 가진 P-IA hydrogels 펩타이드 융합의 여러 구조 설계 하 고 단일 체인, 공동 세그먼트와 단일 체인, 공동 세그먼트와 분기 종류 듀얼 체인의 형성에 체인32. 펩타이드 시퀀스 integrin glycosaminoglycan 바인딩 도메인 소프트웨어의 선정 됐다. 약 25 kPa에서 저장 탄성 률을가지고, 듀얼 체인 또는 공동 세그먼트, vitronectin에서 파생 된 펩타이드와 융합 하는 P-IA hydrogels 이종 무료 및 화학 이상 12 구절에 대 한 인간의 ES와 iPS 세포의 장기 문화 지원 정의 된 조건32. 공동 세그먼트와 듀얼 체인은 hydrogels에 세포 접착 분자 확산을 촉진 하 고 인간의 ES와 iPS의 pluripotency 세포32. 여기, (와 함께 공기에 젖은 조건 하에서 측정 되었다 30 kPa에 10 kPa의 저장 모듈러스) P-IA hydrogels를 준비 하기 위한 프로토콜 융합 펩타이드 없이 또는 소프트웨어를 설명. 문화 및 여러 줄기 세포 (를 포함 하 여 액체 양수 줄기 세포, 줄기 세포 지방이 많은 파생, 인간 ES 세포, 및 인간 iPS 세포)를 통과 하는 방법에 표시 됩니다.

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Protocol

이 연구에서 실험 대만 Landseed 병원 (IRB-13-05)와 중앙 대학교의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 모든 실험은이 연구 기간 동안 모든 관련 및 적용 가능한 정부 및 기관 지침 및 규정에 따라 실시 했다.

1. 솔루션 및 미디어 준비

  1. 폴리머 정화
    1. P-IA carboxylic 산 그룹의 가수분해의 학위와 정화 > 96.5% 에탄올과 P-IA를 세척 하 여. 500 mL 원뿔 비 커에 200ml의 에탄올에 P-IA의 20 g을 배치 하 고 모든 8-10 h 24-30 헤 교환 신선한 에탄올 에탄올에 대 한 자력에 선동.
    2. Büchner 퍼 널을 사용 하 여 여과 하 여 에탄올에서 P-IA를 제거 합니다.
    3. 24 h에 대 한 실내 온도에서 진공 건조 하 여 P-아이오와 건조.
      참고: 것이 좋습니다 청소 함정 진공 건조 시스템에서 (에탄올의 제거)에 의해 자주, 특히 초기 몇 시간 동안 함정 많은 양의 P 아이오와에에서 에탄올의 제거 후 막힌 될 경향이 있기 때문에
  2. P i A 솔루션의 준비
    참고: 용 매 (물)에 매우 느리게 폴리머를 추가 합니다. 그것은 용 매에 P-IA를 추가 하려면 적어도 15 분 걸릴 것이 좋습니다. 용 매는 폴리머에 추가 되 면 폴리머 완전히 해산 하지 것 이다. P i A 솔루션의 폭발성 비등을 생성할 수 없는 주의 해야 합니다. 보호 안경을 사용 하 여 P-i A 솔루션의 준비 하는 동안. P i A 솔루션의 난방 과정은 결정 P-아이오와에 분해에 필수적 그것은 제안 (바람직) 가능한 경우 상대적으로 깨끗 한 실험 실에서 P i A 솔루션을 준비 하.
    1. P-IA 0.050 무게 % 농도 세포 배양 실험을 위해 또는 고분자 측정에 대 한 0.50 무게 % 농도에 순수한 물에 분해: 예를 들어 분해 세포 배양에 대 한 순수한 물 100 mL 및 100 ml의 P-IA의 500 mg에 P-IA의 50 밀리 그램 제가 측정을 위한 이온된 (DI) 물.
    2. 핫 플레이트에 1 h P-i A 솔루션을 교 반 하십시오.
      참고: 폭발성 끓는 피하기 위해, 할 열 하지 솔루션 이상 95 ° c. 높은 온도에서 폴리머 솔루션의 폭발성 비등 하는 것은 피부 화상을 생성할 수 있습니다. 따라서 매우 신중 하 게, P-IA의 난방을 수행 하 고 난방 중 P i A 솔루션의 온도 모니터링.
    3. P i A 솔루션은 주위 온도에 냉각 했다, 후 48 h. 난방, 없이 뜨거운 접시에 두고 뜨거운 P i A 솔루션에 대 한 실 온에서 P i A 솔루션을 선동 하 고 공기 방울을 20-24 h에 대 한 실 온에서 교 반 하지 않고 그것을 두고합니다 P i A 솔루션에 존재 하지.
  3. 가교 솔루션의 준비
    1. 가교 솔루션 1.0 중량 %도 25% 수성도 솔루션에서의 구성, 20.0% 나2그래서 무게 99%를 사용 하 여4 > 순도, 및 1.0 무게 % H2이렇게4. 예를 들어 1 개의 6 또는 12에 대 한 셀 문화 판 잘, 순수한 물 10 mL에도 솔루션, 나트륨 황산 염의 2 g 및 황산의 100 µ L의 100 µ L를 추가.
  4. 인간의 ES/PS 셀 문화 미디어
    참고: 사용 DMEM/F12 미디어, 필수 6 미디어와 세포 배양에 대 한 필수적인 8 미디어.
    1. 4 ° C 냉장고에 녹고 천천히 솔루션에 50 X 필수 8 보충 하룻밤 고정 반환 합니다.
    2. 50 X 필수 8 보충 필수 8 기저 미디어의 한 병으로 한 병을 추가 합니다. 100 mL 원심 분리 관에 작은 aliquots (각 50 mL)에 미디어를 분리 후-20 ° c.에 미디어를 저장

2. P-IA 히드로 요리 준비

  1. P-아이오와 영화 준비
    1. 35mm TCP 접시 P i A 솔루션의 약 1 mL 수를 주입 하 고 건조 한 깨끗 한 벤치에 P-IA 필름 생산을 2 일 동안 45 ° C 오븐에서 요리.
  2. P-IA 히드로 요리의 가교
    1. 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 및 48 h에 대 한 수성 가교 솔루션으로 P-IA 영화를 담가.
      참고: ' P-아이오와-X' (예를 들어, P-아이오와-12 h) X 높이 (예를 들어, 12 h)에 대 한 P i A 히드로 가교 화를 말합니다.
    2. 가교, 후 주위 온도에서 순수한 물 P-IA hydrogels 린스 하 고 깨끗 한 벤치에 주위 온도에서 순수한 물에 hydrogels를 유지 합니다.
    3. 1 분 동안 75.0 volume/volume% 에탄올 솔루션에 집중 하 여 P-IA hydrogels 소독, 린스 순수한 물 P-IA hydrogels 6 번, 그리고 P-IA hydrogels 순수한 물 세포 배양을 위해 사용 될 때까지 계속.
  3. P-IA 히드로 요리 펩타이드 또는 ECM 투입 준비
    1. 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl)-를 포함 하는 수성 해결책의 1 mL에 침수를 통해 P-IA hydrogels 활성화N'-ethylcarbodiimide 염 산 염 (EDC) 및 10 mg/mL N-hydroxysuccinimide (NHS) 37 ° C 또는 4 h h 1에 대 한 4 ° c.에
    2. 린스 1 mL의 인산 염과 P-IA hydrogels 버퍼링 식 염 수 (PBS, pH 7.2) 3 번 4 ° c.에 24 h에 대 한 펩타이드 (100-1500 µ g/mL) 또는 ECM (10-100 µ g/mL) 1 mL를 포함 하는 PBS 솔루션에 P-IA hydrogels 젖어
      참고: 펩타이드 시퀀스 및 ECMs 줄기 세포 배양에 사용 되는 표 1에 요약 됩니다.
    3. 펩타이드 또는 ECM을 접목, 후 P-IA hydrogels 순수한 물으로 3 회 세척.
      참고: P-IA hydrogels Y µ g/mL의 펩타이드 또는 ECM (Z)와 융합이 라고도 P-아이오와-Xh-Z 또는P-아이오와-Xh-Z-Y여기서 X _ 가교 시간 (h), Y 를 나타냅니다의 펩타이드 또는 ECM, 농도 Z 는 다른 펩타이드 또는 ECM를 나타냅니다.

3. 인간의 ES/iPS 세포 배양

  1. 통로 및 undifferentiated 인간의 ES와 iPS 세포의 유지 관리 방법
    1. 인간의 ES (예를 들어, WA09 또는 H9) 유지 셀 또는 인간의 Ip (예, HS0077) 6 cm 요리 표준 인간의 ES/Ip를 사용 하 여 필수 8 미디어에서 Matrigel 셀 세포 문화 프로토콜28,32.
    2. 8-10 분 동안 37 ° C에서 DMEM/F-12 미디어에서 2.0 mg/mL dispase II와 합칠 근처 인간의 ES/iPS 세포를 품 어 그리고 두 번 DMEM/F12 매체와 인간의 ES/iPS 세포를 씻어.
    3. 인간의 ES/iPS 세포 문화 요리 DMEM/F-12 미디어의 2 mL의 추가 약하게 부착 식민지 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 분리 후 또는 pipetting으로.
    4. 15 mL 원심 분리 관으로 인간의 ES/iPS 세포를 수집 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 160 × g에서 인간의 ES/iPS 세포를 원심
    5. 원심, 후 DMEM/f12 키를 삭제 하 고 E8 미디어의 1 mL에 인간의 ES/iPS 세포를 일시 중단 한 다음 셀 카운터를 사용 하 여 셀 밀도 계산.
    6. 새로운 문화 요리 (P-IA hydrogels 펩타이드 또는 ECM 투입)에 적절 한 밀도 조정 (1-5 cm2 뿌리고 또는 표시 된 당 104 셀 배) 후 ES/iPS 세포를 접종.

4. 인간의 ES/iPS 셀 특성의 특성

  1. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 활동의 평가
    1. 표준 알칼리 성 인산 가수분해 효소 라이브 얼룩을 사용 하 여 인간의 ES/iPS 세포의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 활동을 측정 합니다.
  2. Immunostaining
    1. Tra-1-81, SSEA 4, Sox2와 Oct3/4 immunostaining pluripotency 기존의 프로토콜28,32다음 조사를 hES와 엉덩이 셀에 수행 합니다.
    2. 있는 인간의 ES/iPS 세포 경작, 되었고 그 후, 셀을 해결 하기 위해 4 ° C에서 15 분 동안 요리를 품 어 각 24 잘 접시에 4% (볼륨/볼륨) paraformaldehyde 양의 0.5 mL를 추가 합니다.
    3. 각 우물에서 paraformaldehyde 솔루션 발음 그런 다음, 잘 당 1 mL의 PBS 추가 하 고 셀 린스를 PBS 발음. 3 번 헹 구는 과정을 수행 합니다.
    4. 0.3% (볼륨/볼륨) 실 온에서 30 분 PBS에서 트리톤 X 100 솔루션의 0.5 mL을 추가 하 여 세포 막 permeabilize.
    5. 트리톤 X 100 솔루션 발음 및 각 음에 PBS (버퍼 차단)에 2% (무게/볼륨) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 300 µ L을 추가 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.
    6. Pipetting에 의해 블로킹 버퍼를 제거 하 고 그 후, 원하는 기본 항 체를 추가 (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200), 그리고 피 펫, 여 Tra-1-81(1:200) 표 2참조) 어디 1: 200의 항 체 희석 했다 나타냅니다. 각 음에 PBS와 200-fold 및 4 ° c.에 1 일 동안 incubated
    7. 1 차적인 항 체 솔루션을 발음 하 고 0.05%의 300 µ L로 세포 세척 3 번 실 온에서 PBS 솔루션에서 트윈 20.
    8. 이차 항 체의 300 µ L를 추가 (1: 200, 표 2참조), 기본 IgG 하위 형식에, 각 2% (무게/볼륨) BSA 솔루션에 잘 그리고 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 품 어.
    9. 0.05%의 300 µ L로 세포 세척 어둠 속에서 실 온에서 3 회 PBS 솔루션에서 트윈 20.
    10. Confocal 현미경 검사 법 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 스테인드 세포 분석.
  3. Embryoid 몸 형성
    1. 10과 20 구절에서 embryoid 몸 (EB) 형성에 의해 인간의 ES/iPS 세포의 pluripotency를 조사 합니다.
      참고: 80%에 가까운 6 잘 플레이트에 합류 EB 형성의 준비를 위해 충분 하다.
    2. 인간의 ES 또는 DMEM/F-12 미디어의 2 mL와 iPS 세포를 두 번, 린스 하 고 필수 6 미디어의 1.5 ml에서 셀을 담가.
    3. 80 %confluent 인간의 ES 또는 iPS 셀 근처 200 µ L 팁을 사용 하 여 약 32 조각으로 잘라. 다음으로, 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 요리에서 세포를 분리 합니다.
    4. 6 잘 ultralow 첨부 파일 접시에 인간의 ES/iPS 세포 및 전송을 수집 합니다.
    5. 필수 6 미디어를 오래 된 미디어를 pipetting 추가 신선한 미디어 2 일 마다 교환 합니다.
      참고: 5% CO2와 37 ° C에서 2 주 동안에 세포 문화.
    6. EBs homogenously 필수 6 미디어에서 중단 되었다, 후 EBs 0.1 중량 % 젤라틴 코팅 24 잘 TCP 요리 문화를 전송 및 추가로 1 주일에 대 한 필수 6 미디어 셀 문화.
    7. 3 개의 미 발달 생식 층에서 파생 된 세포의 표식에 대 한 항 체와 세포 얼룩 [AFP (endoderm), 연 면적 (ectoderm), β III-Tubulin (ectoderm)와 SMA (mesoderm)] 위에서 설명한 immunostaining 메서드에서 셀 평가 및.
  4. 기형종 형성
    1. 10과 20 구절에서 기형종 형성에 의해 인간의 ES/iPS 세포의 pluripotency를 조사 합니다.
      참고: 6 잘 플레이트에 80% 합류 근처의 5 요리는 기형종 형성에 대 한 충분 한 (적어도 3 x 106 세포가 기형종 형성 실험에 필요한).
    2. 2 mL DMEM/F-12 미디어와 셀을 두 번, 린스 하 고 셀 문화 요리 1.5 mL DMEM/F-12 미디어를 추가 합니다.
    3. 200 µ L 팁을 사용 하 여 거의 80 %confluent 인간의 ES 또는 iPS 셀 약 32 조각으로 잘라. 다음으로, 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 요리에서 세포를 분리 합니다.
    4. 15 mL 원심 분리 관으로 인간의 ES/iPS 세포를 수집 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 160 × g에서 세포를 원심
    5. 원심, 후 100 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단 DMEM/F12, 그리고 다음 믹스 100 µ L로 알 약을 셀 Matrigel (볼륨 1:1 비율).
    6. -20 ° C 중 냉각된 주사기로 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 총, 적어도 3 × 10에에서6 셀 피하에 주사 남성 끄 덕-SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdascid/JNarl) 마우스 (5-8 주).
    7. 5-8 주 후, teratomas를 해 부, 4.0% (무게/볼륨) paraformaldehyde 솔루션을 수정 하 고 4 ° c.에 저장
    8. 파라핀은 기형종 해결, 파라핀 끼워 넣어진 teratomas 슬라이스와 hematoxylin와 오신 (H & E) 얼룩 표준 프로토콜28,32를 사용 하 여.
      참고: 연구원 고정된 기형종 조직 파라핀, 파라핀 끼워 넣어진 슬라이스 teratomas는 teratomas 해결 얼룩 H & E, 병원에서 병 리과에서 일반적으로 사용 되는 샘플을 회사에 보낼 수 있습니다.
  5. 인간 지방이 많은 파생 된 줄기 (광고) 세포 배양
    1. 따뜻한 문화 미디어 (DMEM 1 %antimycotic 항생제와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함), 사용 하기 물 목욕 전에에서 37 ° C에 트립 신-EDTA, 그리고 PBS의 0.25%.
    2. 인간의 광고 셀 셀 교양 있는 각 6 cm 문화 접시에 pipetting 10 mL의 PBS로 세척.
    3. 6 cm 문화 요리에 트립 신-EDTA 용액 (0.25%)의 1 mL을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에서 솔루션을 품 어.
    4. 셀 분리 되 확인 현미경 아래 6 cm 문화 요리에 세포를 관찰 합니다.
    5. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포를 수집 하 고 문화 미디어의 동일한 볼륨을 추가 (DMEM 1 %antimycotic 항생제 및 10 %FBS) 트립 신-EDTA 무력화 원심 분리기 관으로.
    6. 37 ° c.에 5 분 동안 250 × g에서 세포를 원심
    7. 원심, 후 pipetting 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 여는 상쾌한을 신중 하 게 삭제 합니다.
    8. 문화 미디어에 셀 resuspend 그리고 새로운 문화 요리 (P-IA hydrogels 펩타이드와 ECM 없이 투입)에 적절 한 밀도 (5-10 cm2 뿌리고 또는 표시 된 당 103 셀 배)에서 세포를 시드하십시오.
  6. 인간의 양수 줄기 세포 배양 (AFS)
    1. 재배 미디어 (DMEM/MCDB 201 (2:3) 포함 20% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5 ng/mL bFGF와 1 %antimycotic 항생제), 따뜻한 물 목욕 전에 사용에서 37 ° C에 트립 신-EDTA, 그리고 PBS의 0.25%.
    2. 인간의 AFS 셀 셀 교양 있는 각 6 cm 문화 접시에 PBS의 pipetting 10 mL로 씻어.
    3. 6 cm 문화 요리에 트립 신-EDTA 용액 (0.25%)의 1 mL을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.
    4. 셀을 확인 하는 현미경 아래 6 cm 문화 요리에 셀 분리 관찰 합니다.
    5. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포를 수집 하 고 트립 신-EDTA 무력화 원심 분리기 관으로 문화 미디어 (DMEM/MCDB 201 (2:3) 포함 20% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5 ng/mL bFGF와 1 %antimycotic 항생제)의 동일한 볼륨을 추가.
    6. 37 ° c.에 5 분 동안 250 × g에서 세포를 원심
    7. 원심, 후 pipetting으로 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 신중 하 게 삭제.
    8. 재배 미디어에 셀 resuspend 하 고 새로운 문화 요리 (P-IA hydrogels 펩타이드와 ECM 없이 투입)에 적절 한 밀도 (5-10 cm2 뿌리고 또는 표시 된 당 103 셀 배)에서 세포를 시드하십시오.

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Representative Results

P-IA hydrogels ECM 파생 된 펩타이드 (oligoECM)로 융합 또는 다른 신축성으로 ECM 준비 반응 체계에 따라 그림 1A에서 보이는 것과 같이 oligoECM (그림 1B)의 다른 종류를 사용 하 여. hydrogels의 신축성은 적용된 가교 강도 (시간) (그림 1C)에 의해 규제 했다. P-IA hydrogels 25.3 kPa (24 h 가교 시간)의 저장 탄성 률이 vitronectin에서 파생 된 펩타이드와 융합 지원 인간 iPS와 이상에 대 한 ES 세포의 장기 문화 10-20 구절. 특히, 공동 세그먼트 (P-i A-24 h-VN1G)와 P-IA hydrogels 투입 또는 듀얼 체인 (P-i A-24 h-VN2G) 인간 iPS와 P-아이오와-VN1 보다 oligoECM (200-500 μ g/mL)의 상대적으로 낮은 농도로 준비 했다 ES 세포의 pluripotency 지원 oligoECM의 높은 농도 사용 하 여 필요한 hydrogels (> 1000 μ g/mL) 인간의의 pluripotency를 유지 하기 위해 iPS와 ES 세포28,32.

인간의 ES 세포에 유지 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 다른 합성된 코팅 코팅 재료 (예를 들어, Synthemax II) 요리와 P-i A-24 h-VN1 히드로 요리 (그림 2)28에 문화에 이동 되었다. 상업적으로 이용 가능한 코팅 요리 차별화 하는 데 보다 쉽게, 특히 (그림 2a 및 2 c), 식민지의 가장자리에서 인간의 ES 세포의 pluripotency P-i A-24 h-VN1-1000에 유지할 수 있는 반면 발견에 교양 인간 ES 세포 히드로 차별화 된 셀 P i A 24 h VN1 1000 히드로 요리 (그림 2b와 2d)28에 인간 ES 세포의 형태에서 관찰 하지 수 있기 때문에 요리.

인간의 ES (그림 3A)와 P-i A-24 h hydrogels에 교양 (그림 3B) iPS 세포의 pluripotency 기존의 재조합 vitronectin (뿐만 아니라 oligoECM (P-i A-24 h-VN1-1000, P-i A-24 h-VN1G-1000, P-i A-24 h-VN2C)와 융합 rVitronectin)-요리 코팅, 만능 메이커 단백질 (Nanog, Sox2와 Oct3/4)의 식에 따라 평가 했다 후 셀 이종 무료 조건 10 구절32에 대 한 필수 8 미디어를 사용 하 여 각 접시에 배양 했다. 이러한 pluripotency 단백질 인간 iPS와 ES 세포 이종 무료 조건에서 rVitronectin 코팅 접시에 뿐만 아니라 oligoECM, 함께 융합 하는 P-IA hydrogels에 교양된에 만족 스럽게 표현 되었다.

3 개의 세균 층에서 생체 외에서 (EB 형성)에서 파생 된 세포로 분화 능력의 평가 그리고 vivo에서 (기형종 형성) 합성에 재배 후 인간의 ES와 iPS 세포의 pluripotency를 확인 필수 바이오 소재입니다. 따라서, 인간의 ES 세포 (그림 4)와 인간 iPS 세포 (그림 5) P-i A-oligoECM 히드로 요리에 재배 했다 고 10 구절, 그리고 그 후, 세포를 위한 재조합 vitronectin 코팅 접시 모양에 경작 했다 EBs입니다. EBs 요리 (그림 4A 와 그림 5A)32에 확산 하는 세포의 능력을 관찰 하는 몇 주를 위한 젤라틴 코팅 접시에 추가 재배 했다. 차별화 된 인간의 ES (그림 4B)와 (그림 5B) iPS 세포 했다 3 개의 세균 층에서 파생 된 단백질에 대 한 immunostained: alpha-fetoprotein (AFP, endoderm), 부드러운 근육 말라 (SMA, mesoderm)와 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP ectoderm)32. 인간의 iPS와 ES 세포 인간 iPS와 ES 세포의 pluripotency의 또 다른 확인을 나타내는 모든 3 개의 세균 층에서 파생 된 세포로 분화를 발견 했다 P-IA hydrogels 이종 무료 oligoECM와 투입에 재배 후에 긴 기간에 대 한 조건 (통과 > 10 구절).

3 개의 세균 층에서 vivo에서 (기형종 형성 분석 결과)에서 유래 하는 세포로 인간 ES 세포의 분화 능력 또한 평가 했다. 10 구절에 대 한 이종 무료 문화 조건 P i A VN1-1000 (그림 6A) 및 P-i A-VN2C-1000 (그림 6B)에 재배 되었다, 인간 ES 세포는 끄 덕 SCID 쥐32에 피하 주입 했다. Teratomas는 쥐, 격리 되었고 기형종 조직 단면도 고정 되었고 H & E (그림 6A , 6B)32스테인드. Teratomas는 모든 3 개의 세균 층에서 발생 하는 세포의 존재를 표시: endoderm (장 상피, 그림 6A(b) 및 6B(b)), mesoderm (연골, 그림 6A(c) 및 6B(c)), 및 (ectoderm neuroepithelium, 그림 6A(d); 망막 색소 상피, 그림 6B(d)). 이 결과 제안 10 구절 수에 대 한 이종 무료 조건 P i A 24 h VN1 1000 P-i A-24 h-VN2C-1000에 교양된 인간의 ES 세포에 그들의 pluripotency 유지 됩니다 나타내는 3 개의 세균 층에서 발생 하는 세포로 분화 vivo.

인간의 AFS 셀 수정 되지 않은 P-IA 히드로, P-i A-oligoECM 하이드로 겔 및 확장 미디어에서 TCP 요리 또한 경작 했다. 그림 7 에 신축성과 P-IA 및 P-i A-oligoECM 히드로 요리에서 문화의 4 일 후에 재배 하는 인간의 AFS 세포의 형태학 (E') 12.2의 (가교 시간 = 6 h), 18.3 (가교 시간 = 12 h), 25.3 (가교 시간 = 24 h), 그리고 30.4 kPa (가교 시간 = 48 h) 강성30의 3-12 평점과 요리 0 또는 50 μ g/mL로 TCP의 oligoECM 농도 사용 하 여.

인간의 AFS 셀 수 또는 oligoECM 없이 P-IA 히드로 요리에 증식 하지 때 인간의 AFS 셀 수 또는 oligoECM 없이 격 증 하는 반면 P-IA hydrogels 강성 미만 11 kPa (PV-2 h, PV 2 h Y, PV-4 h, 그리고 태양광 발전-4 h-Y) 때 E' P-i A-6 h 태양광 발전-아이오와-6 h-c o l 1 히드로 요리 제외한 12 kPa 보다 컸다. P-i A-6 h와 P-i A-6 h-c o l 1 하지 소프트 셀 문화 생체 세포 주기 진행30정지 때문에 인간의 AFS 셀의 문화에 대 한 유리한 것으로 보인다.

위의 결과 제안 P-IA 히드로 요리는 긴 기간 줄기 세포 배양에 대 한 최적의 재료와 특정 강성 및 oligoECM, oligoECM의 최적의 반응 농도 의해 줄기 세포의 pluripotency를 유지 (oligoECM의 표면 밀도)입니다.

Figure 1
그림 1: P-IA hydrogels oligoECM 또는 ECM 투입의 준비. P-IA hydrogels ECM와 ECM에서 파생 된 펩타이드 (oligoECM) 융합에 대 한 반응의 (A) 계획29. 저작권 2015입니다. 화학의 왕 사회 허가 적응. (B) 디자인 및 P-IA hydrogels에 투입 하는 펩타이드의 순서. 단일 체인 펩타이드 (P-아이오와-BSP, P-아이오와-VN1 및 P-i A-HBP1), 단일 체인 펩타이드 공동 세그먼트 (P-i A-VN1G), 그리고 듀얼 체인 (P-i A-VN2C 및 P-i A-HBP2C) 및 ECM (P-아이오와-ECM) P-IA hydrogels32에 투입 했다. 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스 하에서 적응. (C) 강성의 P-IA hydrogels 가교29의 다른 기간에 의해 준비. 저작권 2015입니다. 화학의 왕 사회 허가 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: P-i A-24 h-VN1 hydrogels 및 상용 코팅 요리 인간 ES 세포의 비교 문화. 인간의 ES 세포 (WA09) 인간의 ES 세포에 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)에 경작에서 이동 되었다 때 상용 코팅 요리 (a, b)와 통로 1에 P-i A-24 h-VN1-1000 (c, d) 요리 재배의 형태 상업적으로 이용 가능한 코팅 요리 또는 PVA-24 h-VN1-1000 요리에 재배. 빨간색 화살표는 차별화 된 인간의 ES 세포를 보여줍니다. 눈금 막대 표시 50 µ m (a, b) 및 100 µ m (c, d)28. 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스 하에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 인간의 ES와 iPS의 pluripotency의 P-IA hydrogels 다른 펩타이드 디자인 융합에 셀. (A) 식의 pluripotency 단백질 Nanog (빨간색), Sox2 (녹색), 그리고 Oct3/4 (녹색) 인간의 ES (H9) 세포에 핵는 라벨 (블루) (한)에 경작 후에 대 한 Hoechest33342와 듀얼 얼룩과 immunostaining에 의해 분석 P-i A-24 h-VN1-1000, (b) P-i A-24 h-VN1G-1000, 및 (c) P-i A-24 h-VN2C-1000 hydrogels, 및 (d) 재조합 vitronectin (rVitronectin)에-요리 10 구절에 대 한 이종 무료 조건에서 코팅. (B) 식의 pluripotency 단백질 Nanog (빨간색), (녹색), Sox2와 Oct3/4 (녹색)에 인간 iPS 세포 핵는 라벨 (블루) (한)에 경작 후에 대 한 Hoechest33342와 듀얼 얼룩과 immunostaining에 의해 분석 P-i A-24 h-VN1-1000 하이드로 겔, 하이드로 겔 (b) P-i A-24 h-VN2C-1000, 및 (c) 재조합 vitronectin (rVitronectin)-hydrogels 코팅 이종 무료 조건 요리 10 구절32에 대 한. 스케일 바 나타냅니다 50 µ m. 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스 적응 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 인간의 ES의 차별화 능력의 세포 P-IA hydrogels 다른 펩타이드 디자인 융합에. (A) (a) P-i A-24 h-VN1-1000, (b)에 자란 P-i A-24 h-VN1G-1000, 및 (c) P-i A-24 h-VN2C-1000 hydrogels 후 인간의 ES (H9) 세포 및 (d) 재조합에서 분화 하는 EBs에서 세포의 형태학 vitronectin (rVitronectin)-요리 10 구절에 대 한 이종 무료 조건에서 코팅. 눈금 막대 표시 100 µ m. (B) ectoderm 단백질 (GFAP, 빨간색), mesoderm 단백질 (SMA, 녹색), 및 인간 ES (H9) 세포에 대 한 Hoechest33342와 듀얼 얼룩과 immunostaining에 의해 평가에서 endoderm 단백질 (AFP, 녹색) 식 핵 P-i A-24 h-VN1-1000, P-i A-24 h-VN1G-1000, 및 P-i A-24 h-VN2C-1000 hydrogels 및 재조합 vitronectin (rVitronectin) 배양 후 (파란색) 라벨-10 구절32대 한 이종 무료 조건에서 요리를 코팅. 스케일 바 나타냅니다 50 µ m. 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스 적응 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 인간 iPS의 분화 능력의 세포 P-IA hydrogels 다른 펩타이드 디자인 융합에. EBs에서 셀의 (A) 형태 (a) P-i A-24 h-VN1-1000 hydrogels, (b) P-i A-24 h-VN2C-1000 hydrogels, 및 (c) 재조합 vitronectin (rVitronectin) 배양 후 (HPS0077) 인간 iPS 세포에서 분화- 10 구절에 대 한 이종 무료 조건에서 코팅된 요리. 눈금 막대 표시 100 µ m. (B)는 ectoderm 단백질 (GFAP, 빨간색), mesoderm 단백질 (SMA, 녹색), 및 인간 iPS (HPS0077) 셀에 대 한 Hoechest33342와 듀얼 얼룩과 immunostaining에 의해 분석에 endoderm 단백질 (AFP, 녹색) 식 핵 (a) P-i A-24 h-VN1-1000 hydrogels, (b) P-i A-24 h-VN2C-1000 hydrogels, 및 (c) 재조합 vitronectin (rVitronectin) 배양 후 (파란색) 라벨-10 구절32대 한 이종 무료 조건에서 요리를 코팅. 스케일 바 나타냅니다 50 µ m. 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스 적응 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 인간의 ES (H9)의 분화 능력의 P-i A-24 h-VN1 및 P-i A-24 h-VN2C hydrogels에 경작 후 에 vivo 세포. (A) 10 구절 후 P i A 24 h VN1 1000 hydrogels 이종 무료 셀 문화 조건에 배양 후 셀 (a) 인간의 ES 주입 기형종의 사진. 조직 (b) 장 상피 (endoderm)를 포함 하 여, (c) 연골 (mesoderm), 및 (d) neuroepithelium (ectoderm) 관찰 될 수 있다. (B) 10 구절 후 P-i A-24 h-VN2C-1000 hydrogels 이종 무료 셀 문화 조건에 배양 후 셀 (a) 인간의 ES 주입 기형종의 사진. (B) 장 상피 (endoderm)를 포함 하는 조직, (c) 연골 (mesoderm), 및 (d) 망막 안료 상피 (ectoderm)32를관찰할 수 있습니다. 스케일 바 나타냅니다 100 µ m. 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스 적응 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: TCP 요리에 재배 하는 인간의 AFS 셀과 P-IA 히드로 요리 문화의 4 일 후 또는 ECM 파생 펩타이드 없이 움직일 형태학. TCP 요리 인간의 AFS 셀의 (A) 형태로 인간의 AFS의 (B) 형태 세포 P i A-6 h P-i A-6 h-Z 에 히드로 요리 (P-i A-6 h, P-i A-6 h-c o l 1-50, P-i A-6 h-FN1-50, P i A 6 h VN1 50, P-i A-6 h-HBP1-50, 및 P-i A-6 h-cRGD-50). P-아이오와-12 h P-i A-12 h-Z 히드로 요리 (P-아이오와-12 h, P-아이오와-12 h-c o l 1-50, P-아이오와-12 h-FN1-50, P-아이오와-12 h-VN1-50, P-아이오와-12 h-HBP1-50, 및 P-아이오와-12 h-cRGD-50)에 hAFCs의의 (C) 형태로 인간의 AFS의 (D) 형태 세포 P-i A-24 h P-i A-24 h-Z 에 히드로 요리 (P-i A-24 h, P-i A-24 h-c o l 1-50, P-i A-24 h-FN1-50, P-i A-24 h-VN1-50, P-i A-24 h-HBP1-50, 및 P-i A-24 h-cRGD-50). 인간의 AFS의 (E) 형태 세포 P-아이오와-48 h 및 P-아이오와-48 h-Z 에 히드로 요리 (P-아이오와-48 h, P-아이오와-48 h-c o l 1-50, P-아이오와-48 h-FN1-50, P-아이오와-48 h-VN1-50, P-아이오와-48 h-HBP1-50, 및 P-아이오와-48 h-cRGD-50). 눈금 막대는 100 μ m30을 나타냅니다. 저작권 2017입니다. 화학의 왕 사회 허가 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

재료의 이름 / 장비 약어
GTPGPQGIAGQRGVV C O L 1
GACRGDCLGA 주기적 RGD (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectin rVN
Fibronectin FN

표 1: ECM 파생 펩타이드 시퀀스와 ECM이이 연구에 사용 된

항 체 농도 (희석 속도)
Nanog 1: 200
SSEA4 1: 200
OCT3/4 1: 200
Sox2 1: 200
부드러운 근육 걸 1: 200
(Α-SMA) 1: 200
AFP = 연합 뉴스 1: 200
GFAP 1: 200
알 렉 사 Fluor 555-활용된 염소 안티 마우스 1: 200

표 2: 항 체가이 연구에서 immunostaining에 대 한 사용.

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Discussion

P-i A-oligoECM 및 다양 한 강성과 P-아이오와-ECM hydrogels 인간의 ES와 이종 무료 조건에 이상 10 구절 뿐만 아니라 인간의 AFS 셀, 광고 셀의 문화에 대 한 그들의 pluripotency를 유지 하는 iPS 세포의 장기 확장을 위해 개발 되었다 그리고 조 혈 줄기 세포25,,2832. P-IA hydrogels oligoECM와 함께 움직일 수는 차별화의 운명과 기본 세포로 서 줄기 세포의 다양 한 종류의 확산에 셀 문화 자료의 효과 조사 하기 위해 세포 배양 재료에 대 한 훌륭한 후보와 암 세포입니다.

P i A 솔루션 P i A 솔루션 요리에 캐스팅은 투명 해야 합니다. 가교 시간 P-IA hydrogels의 가교 강도 결정합니다. 24 h P-IA hydrogels의 가교 인간의 ES/iPS 세포 배양에 대 한 최적의 hydrogels를 생성합니다. 모든 펩타이드 및 ECMs 펩타이드 및 ECMs 있는 무료 아미노 그룹25,,2829,30,31, 이 프로토콜을 사용 하 여 P-IA hydrogels에 투입 될 수 있다 32. XPS는 표면 밀도의 절대 값을 제시 수 없습니다 하지만 펩타이드 또는 소프트웨어의 존재는 안전 하 게 수 펩타이드 또는 소프트웨어의 표면 밀도, 엑스레이 광전자 분광학 (XPS) 측정에 의해 검출 될 수 있다 분석.

P-IA hydrogels 이식할된 펩타이드 또는 소프트웨어 없이, 있는 가교 시간에 따라 3-30 조선에서 저장 모듈러스 준비 수 있습니다. 그것은 오히려 3 인민군 보다 적은 저장 모듈러스와 30 kPa25,,2829,30,31,32보다 더 높은 저장 모듈러스 P-IA hydrogels 준비 어렵다. 이 P-IA hydrogels의 화학 가교의 현재 히드로 준비 방법의 제한 사항입니다. 그러나, 현재 프로토콜 기본 세포, 암 세포, 또는 인간의 ES와 iPS 세포를 포함 하 여 줄기 세포의 문화를 지원할 수 있지만 polyacrylamide의 만들지는 다른 탄력 있는 hydrogels의 다른 옵션을 제공 합니다. 특히, 인간의 ES와 iPS 세포 polyacrylamide hydrogels에 확산 수 없습니다 하지만 그림 2, 그림 3, 그림 4, 그림 5와 그림 6에서 같이 P-IA hydrogels에 확산 수 있습니다. 실제로, P-i A-24 h-VN1 hydrogels 인간의 ES 세포 배양 상용 코팅 요리 (그림 2) 보다 더 나은 지원. 따라서, P-IA hydrogels는 인간의 ES와 iPS 세포의 문화에 대 한 것이 좋습니다.

Cardiomyocytes35, 망막 안료 상피36, β 세포6, TH 등 셀의 특정 계보에 인간의 ES와 iPS 세포 분화 된다 그것은 조사는 hydrogels의 최적의 탄성 재미 있을 것 이다 + 세포 재생 의학의 미래 개발을 위한6 .

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 연구는 부분적으로 부여 번호 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006, 104-2221-E-008-107-MY3 아래 과학과 기술, 대만 의해 지원 됩니다. 이 연구는 대만 Landseed 병원 프로젝트 (NCU-LSH-105-A-001)에 의해 또한 지원 되었다. 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 일본에서 과학 연구 (숫자 15 K 06591)에 대 한 특정도 인정 했다. A. 히구치 대학원 및 연구, 킹 사우드 대학, 리야드 11451, 사우디아라비아 왕국에 대 한 국제 과학 파트너십 프로그램 (ISPP-0062) 부회장 Rectorate에 대 한 인정 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

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References

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