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Bioengineering

Polyvinyl शराब पर मानव Pluripotent स्टेम सेल संस्कृति-सह-Itaconic एसिड Hydrogels के तहत अलग कठोरता के साथ एक्सो-मुक्त शर्तों

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

एक प्रोटोकॉल polyvinyl शराब तैयार करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है-सह-itaconic एसिड hydrogels बदलती कठोरता के साथ, जो और बिना oligopeptides के साथ भ्रष्टाचार कर रहे थे, के भेदभाव और प्रसार पर की कठोरता के प्रभाव की जांच स्टेम सेल । crosslinking समय hydrogels की कठोरता को नियंत्रित किया गया था ।

Abstract

शारीरिक संकेतों का प्रभाव, जैसे स्टेम कोशिकाओं के प्रसार और विभेद पर होने वाली सामग्री की कठोरता, कई शोधकर्ताओं द्वारा जांच की गई है. हालांकि, इनमें से अधिकांश जांचकर्ताओं ने अपनी पढ़ाई में स्टेम सेल कल्चर के लिए polyacrylamide hydrogels का इस्तेमाल किया है । इसलिए, उनके परिणाम विवादास्पद रहे है क्योंकि उन परिणामों polyacrylamide के विशिष्ट विशेषताओं से और नहीं भौतिक क्यू (कठोरता) से उत्पंन हो सकता है । यहां, हम hydrogels तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, जो polyacrylamide पर आधारित नहीं हैं, जहां विभिंन स्टेम, मानव भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं सहित कोशिकाओं, संस्कृति किया जा सकता है । अलग कठोरता के साथ Hydrogels को निष्क्रिय polyvinyl शराब से तैयार किया गया-co-itaconic एसिड (पी-IA), कठोरता के साथ crosslinking की डिग्री द्वारा नियंत्रित crosslinking समय बदलकर । पी-IA hydrogels के साथ और extracellular मैट्रिक्स से व्युत्पंन oligopeptides बिना भ्रष्टाचार स्टेम सेल संस्कृति और भेदभाव के लिए एक भविष्य के मंच के रूप में जांच की गई । एमनियोटिक द्रव स्टेम कोशिकाओं, वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल, मानव ES कोशिकाओं, और मानव आईपीएस कोशिकाओं की संस्कृति और बीतने यहाँ विस्तार से बताया गया है । oligopeptide पी-IA hydrogels बेहतर प्रदर्शन है, जो उनके कठोरता गुणों से प्रेरित थे दिखाया । इस प्रोटोकॉल में जकड़ना गुणों को नियंत्रित करने और अंत में, स्टेम सेल भाग्य पर उनके प्रभाव एक्सो मुक्त संस्कृति की स्थिति का उपयोग करने के साथ-साथ, उनके सतह हेरफेर, सामग्री के संश्लेषण की रिपोर्ट । हाल के अध्ययनों के आधार पर, इस तरह के संशोधित सब्सट्रेट भविष्य प्लेटफार्मों के रूप में कार्य करने के लिए विभिन्न संपर्क करने के लिए विभिंन स्टेम सेल लाइन के भाग्य का समर्थन और प्रत्यक्ष कर सकते हैं; और आगे, पुनर्जीवित और खो अंग या ऊतक के कार्यों को बहाल ।

Introduction

कोशिकाओं की एक विशिष्ट वंश में स्टेम सेल भेदभाव के भाग्य और स्टेम सेल के दीर्घकालिक प्रसार, विशेष रूप से मानव प्रेरित pluripotent (आईपीएस) कोशिकाओं और मानव भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं, के लिए अवरोधकों द्वारा विनियमित जाना जाता है, विकास कारकों, और/ या संस्कृति मीडिया में छोटे से अधिक सक्रिय अणुओं । हाल ही में, भौतिक संकेतों के शारीरिक cues, विशेष रूप से सेल संस्कृति की कठोरता, स्टेम सेल प्रसार और भेदभाव के भाग्य मार्गदर्शक एक महत्वपूर्ण कारक होने के लिए मांयता प्राप्त किया गया है1,2, 3,4,5,6. इसलिए, कई शोधकर्ताओं ने स्टेम सेल, जो hydrogels पर, भेदभाव पर, मुख्यतः कठोरता के साथ polyacrylamide hydrogels का उपयोग कर रहे है के भाग्य की जांच शुरू कर दिया है ।

विशेष रूप से दो आयामी (2-डी) खेती1,2,3,5में, केंद्र आसंजन, सेल आकृति विज्ञान, सेल phenotype, और स्टेम सेल आसंजन को नियंत्रित कर सकते है की कठोरता । स्टेम सेल द्वारा Mechano-संवेदन को आम तौर पर फोकल आसंजन द्वारा integrin रिसेप्टर्स के माध्यम से संकेतन द्वारा नियंत्रित किया जाता है । NMMIIA, मांसपेशी मायोसिन आईआईए-निर्भर सिकुड़ना cytoskeleton के actin के 2-डी सेल खेती प्रणालियों में स्टेम सेल की mechanosensing प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler और उनके सहयोगियों ने एक दिलचस्प धारणा विकसित की है कि वयस्क स्टेम सेल, जैसे अस्थि मज्जा स्टेम (बीएमएस) सेल संस्कृति पर खेती के लिए एक समान कठोरता के साथ विशिष्ट ऊतकों, कोशिकाओं में अंतर करने के लिए करते हैं की उत्पत्ति विशिष्ट ऊतकों5। बीएमएस कोशिकाओं पर मशीन 2-डी नरम polyacrylamide hydrogels कोलेजन प्रकार के साथ लेपित मैं (एक है कि मस्तिष्क के ऊतकों के बराबर कठोरता के साथ) विस्तार मीडिया में अनायास जल्दी ंयूरॉन वंश में अंतर करने के लिए प्रेरित किया गया, जबकि बीएमएस कोशिकाओं पर संस्कृति मांसपेशी या कोलेजन हड्डी के ऊतकों के समान कठोरता के साथ hydrogels myocytes और osteoblasts की प्रारंभिक वंश में विभेद पैदा करने के लिए पाया गया, क्रमशः 2 पर डी polyacrylamide hydrogels3,5. कई शोधकर्ताओं ने स्टेम सेल के भाग्य की जांच की है polyacrylamide पर प्रसंस्कृत विभेदक कोलेजन प्रकार के साथ hydrogels मैटीरियल मैं12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. तथापि, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि कुछ विरोधाभासी रिपोर्टों1,18,22,23,24 के लिए मौजूद प्रसिद्ध विचार Engler द्वारा सुझाए गए एट अल. 5 इसका कारण यह है Engler विचार5 polyacrylamide hydrogels पर पूरी तरह से विकसित किया गया था और उनके परिणाम (polyacrylamide), और केवल भौतिक क्यू (कठोरता) से नहीं की विशिष्ट विशेषताओं से उत्पन्न हुआ है सामग्री । इसलिए hydrogel का एक और प्रकार विकसित करना जरूरी है, जिसमें से कठोरता को hydrogels के crosslinking द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है । इस प्रयोजन के लिए, अपरिवर्तनीय hydrogels विकसित किए गए थे, जो एक अलग कठोरता के साथ polyvinyl शराब-सह-itaconic एसिड (पी-IA) से तैयार किए गए थे, जो crosslinking की डिग्री के साथ एक बदलते crosslinking समय के साथ नियंत्रित किया गया था25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , ३२. स्टेम कोशिकाओं को गैर-संशोधित पी-आइए hydrogels पर खेती की जा सकती है, साथ ही P-ia hydrogels extracellular मैट्रिक्स (ECMs) और oligopeptides के साथ भ्रष्टाचार किया जा सकता है । एक पिछले अध्ययन में25, गर्भनाल रक्त से मानव टेम स्टेम कोशिकाओं (hHSCs) पर खेती कर रहे थे अलग कठोरता एक 3 केपीए से लेकर 30 केपीए भंडारण मापांक जहां fibronectin या एक oligopeptide से व्युत्पंन को लेकर मूल्यों के साथ पी-आइए hydrogels fibronectin (CS1, EILDVPST) पी-IA hydrogels पर भ्रष्टाचार किया गया था । hHSCs के उच्च पूर्व vivo गुना विस्तार पी-IA में मनाया गया था hydrogels CS1 या fibronectin, जो एक मध्यवर्ती 12 केपीए से 30 केपीए25से लेकर कठोरता प्रदर्शित के साथ भ्रष्टाचार ।

मानव आईपीएस और es कोशिकाओं पारंपरिक ऊतक संस्कृति polystyrene (टीसीपी) व्यंजन पर खेती नहीं की जा सकती३३,३४ क्योंकि मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं ECMs के लिए विशिष्ट बंधन की आवश्यकता है, जैसे vitronectin या laminin अपने pluripotency को बनाए रखने के लिए लंबी अवधि के दौरान संस्कृति । इसलिए, oligopeptide की कई संरचनाओं----hydrogels इष्टतम कठोरता विशेषताओं के साथ पी-IA डिजाइन किए गए थे और एक एकल श्रृंखला के संरचनाओं में तैयार, एक संयुक्त खंड के साथ एक श्रृंखला, एक संयुक्त खंड के साथ एक दोहरी श्रृंखला, और एक शाखा-प्रकार चेन३२. Oligopeptide अनुक्रम ECMs के integrin-और glycosaminoglycan-बाइंडिंग डोमेन से चयनित किए गए थे । पी-IA hydrogels vitronectin के साथ भ्रष्टाचार-एक दोहरी श्रृंखला या संयुक्त खंड है, जो लगभग 25 केपीए में एक भंडारण मापांक है के साथ oligopeptides व्युत्पंन, एक्सो के तहत 12 से अधिक मार्ग के लिए मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति का समर्थन मुक्त और रासायनिक निर्धारित शर्तें३२। hydrogels पर सेल आसंजन अणुओं के साथ संयुक्त खंड और दोहरी श्रृंखला मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं के प्रसार और pluripotency की सुविधा३२। यहां, पी-IA hydrogels की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल (मापांक 10 केपीए से 30 केपीए है, जो हवा में गीला शर्तों के तहत मापा गया था) के साथ और बिना oligopeptides या ECMs वर्णित है । कैसे संस्कृति और बीतने के लिए कई स्टेम सेल (सहित एमनियोटिक द्रव स्टेम सेल, वसा-व्युत्पंन स्टेम सेल, मानव ES कोशिकाओं, और मानव आईपीएस कोशिकाओं) दिखाया गया है ।

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Protocol

इस अध्ययन में प्रयोगों को ताइवान Landseed अस्पताल (आईआरबी-13-05) और नेशनल सेंट्रल यूनिवर्सिटी की एथिक्स समितियों ने मंजूरी दी थी । इस अध्ययन के दौरान सभी प्रासंगिक और लागू अशासकीय और संस्थागत दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार सभी प्रयोग किए गए ।

1. समाधान और मीडिया की तैयारी

  1. बहुलक शुद्धि
    1. carboxylic एसिड समूह के साथ hydrolysis > 96.5% की एक डिग्री के साथ पी-आइए, इथेनॉल के साथ धोने से शुद्ध पी आइए । एक ५००-एमएल शंकु चोंच में इथेनॉल के २०० मिलीलीटर में पी के 20 जी-IA प्लेस और 24-30 एच के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी पर आंदोलन । ताजा इथेनॉल के साथ इथेनॉल विनिमय हर 8-10 एच ।
    2. एक Büchner कीप का उपयोग निस्पंदन द्वारा इथेनॉल से पी-आइए निकालें.
    3. सूखी पी-आइए वैक्यूम सुखाने के लिए कमरे के तापमान पर 24 ज.
      नोट: यह वैक्यूम सुखाने प्रणाली में जाल साफ करने के लिए सिफारिश की है (इथेनॉल को हटाने के द्वारा) अक्सर, विशेष रूप से प्रारंभिक कुछ घंटों के दौरान, क्योंकि जाल पी से इथेनॉल की एक बड़ी राशि के हटाने के बाद भरा हो जाता है-आइए ।
  2. पी-IA समाधान की तैयारी
    नोट: बहुत धीरे से विलायक (पानी) में बहुलक जोड़ें । यह पी-IA में विलायक जोड़ने के लिए कम से 15 मिनट लेने के लिए सिफारिश की है । यदि विलायक बहुलक में जोड़ा जाता है, बहुलक पूरी तरह से भंग नहीं किया जाएगा । पी-IA समाधान के विस्फोटक उबलते उत्पन्न करने के लिए नहीं सावधान रहें । P-IA समाधान की तैयारी के दौरान सुरक्षात्मक चश्मे का प्रयोग करें । पी-ia समाधान की हीटिंग प्रक्रिया क्रिस्टलीय पी-ia भंग करने के लिए आवश्यक है । यह (और बेहतर) एक अपेक्षाकृत साफ प्रयोगात्मक कमरे में पी-IA समाधान तैयार करने के लिए, यदि संभव हो तो सुझाव दिया है ।
    1. पी-आइए विशुद्ध जल में एक ०.०५० वजन% एकाग्रता के लिए सेल खेती प्रयोग या rheometer माप के लिए एक ०.५० वजन% एकाग्रता के लिए भंग: उदाहरण के लिए, भंग ५० एमजी के पी-ia में १०० मिलीलीटर सेल संस्कृति के लिए शुद्ध पानी और पी के ५०० मिलीग्राम-ia में १०० मिलीलीटर की de rheometer मापन के लिए जल (DI) ।
    2. गर्म प्लेट पर 1 घंटे के लिए पी-IA समाधान आंदोलन ।
      नोट: विस्फोटक उबलते से बचने के लिए, ९५ डिग्री सेल्सियस से अधिक समाधान गर्मी नहीं है । एक उच्च तापमान पर बहुलक समाधान के विस्फोटक उबलते त्वचा जलता उत्पंन कर सकते हैं । इसलिए, के ताप प्रदर्शन पी-ia बहुत ध्यान से, और ताप के दौरान पी ia समाधान के तापमान की निगरानी ।
    3. p-ia समाधान परिवेश के तापमान पर ठंडा किया गया था के बाद, ४८ घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पी-ia समाधान आंदोलन, हीटिंग के बिना गर्म थाली पर गर्म पी-ia समाधान छोड़ दो, और फिर यह सुनिश्चित करने के लिए कमरे के तापमान पर आंदोलन के बिना 20-24 h के लिए छोड़ कि हवा बुलबुले P-IA समाधान में मौजूद नहीं है ।
  3. crosslinking समाधान की तैयारी
    1. crosslinking समाधान की संरचना बनाओ १.० वजन% glutaraldehyde से 25% जलीय glutaraldehyde समाधान, २०.० वजन% ना2तो4 का उपयोग कर ९९% > शुद्धता, और १.० वजन% H2तो4. उदाहरण के लिए, एक 6 या 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के लिए, glutaraldehyde समाधान के १०० µ एल, सोडियम सल्फेट के 2 ग्राम, और सल्फर एसिड की १०० µ एल जोड़ें शुद्ध पानी की 10 मिलीलीटर में ।
  4. मानव ES/
    नोट: DMEM/F12 मीडिया, आवश्यक 6 मीडिया, और सेल संस्कृति के लिए आवश्यक 8 मीडिया का उपयोग करें ।
    1. वापसी जमे हुए 50X आवश्यक 8 पूरक एक 4 ° c रेफ्रिजरेटर में गल द्वारा रात भर समाधान के लिए धीरे से ।
    2. आवश्यक 8 बेसल मीडिया की एक बोतल में 50X आवश्यक 8 पूरक की एक बोतल जोड़ें । छोटे aliquots में मीडिया अलग (५० मिलीलीटर प्रत्येक) में १०० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों, तो-20 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया की दुकान ।

2. P-IA Hydrogel डिश तैयारी

  1. पी-आइए फिल्म की तैयारी
    1. एक ३५ मिमी टीसीपी डिश में पी-ia समाधान की एक 1 मिलीलीटर aliquot सुई, और एक ४५ डिग्री सेल्सियस ओवन में पकवान सूखी 2 दिनों के लिए एक स्वच्छ पीठ में एक पी IA फिल्म का उत्पादन ।
  2. Crosslinking के पी-आइए hydrogel व्यंजन
    1. ०.५, 1, 2, 4, 6, 12, 24, और ४८ एच के लिए एक जलीय crosslinking समाधान में पी-IA फिल्मों विसर्जित कर दिया ।
      नोट: ' p-ia-x' (उदा., p-ia-12 h) किसी p-ia hydrogel crosslinked के लिए X h (उदा., 12 h) को संदर्भित करता है ।
    2. crosslinking के बाद, पी-IA hydrogels परिवेश के तापमान पर शुद्ध पानी के साथ कुल्ला करें, और फिर एक स्वच्छ पीठ में परिवेश के तापमान पर शुद्ध पानी में hydrogels रखें ।
    3. एक ७५.० मात्रा में विसर्जन द्वारा पी-ia hydrogels को निष्फल/1 मिनट के लिए मात्रा% इथेनॉल समाधान, पी-ia hydrogels को छह बार शुद्ध पानी में कुल्ला करें, और फिर सेल की खेती के लिए इस्तेमाल होने तक शुद्ध पानी में पी-ia hydrogels रखें ।
  3. पी-IA hydrogel व्यंजन की तैयारी oligopeptide या ECM के साथ भ्रष्टाचार
    1. एक जलीय समाधान के 1 मिलीलीटर में विसर्जन के माध्यम से पी-IA hydrogels को सक्रिय करें जिसमें 10 मिलीग्राम/एमएल एन-(3-Dimethylaminopropyl)-n '-ethylcarbodiimide हाइडरोक्लॉराइड (EDC) और 10 मिलीग्राम/एमएल N-hydroxysuccinimide (एन एच) के लिए 1 ३७ डिग्री सेल्सियस या 4 ज पर एच 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. कुल्ला पी-आइए hydrogels के साथ 1 मिलीलीटर की फास्फेट बफर खारा (पंजाब, pH ७.२) 3 बार और विसर्जित करें P-IA hydrogels a पंजाबन समाधान में 1 मिलीलीटर oligopeptide (100-1500 µ g/एमएल) या ECM (10-100 µ g/एमएल) 24 के लिए 4 ° c ।
      नोट: स्टेम सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल oligopeptide दृश्यों और ECMs तालिका 1में संक्षेप हैं ।
    3. oligopeptide या ECM को भ्रष्टाचार करने के बाद, पी-आइए hydrogels को 3 बार शुद्ध पानी से धोएं ।
      नोट: p-ia hydrogels Y µ g/मब के oligopeptide या ECM (z) के साथ दिया गया है इसके बाद p-ia-xh-z याp-ia-xh-z-Yके रूप में संदर्भित किया जाता है, जहां X crosslinking समय (h) को संदर्भित करता है, Y oligopeptide या ECM की एकाग्रता को इंगित करता है, और Z किसी भिंन oligopeptide या ECM को इंगित करता है ।

3. मानव ES/आईपीएस सेल संस्कृति

  1. मार्ग और विभेदक मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं के रखरखाव की विधि
    1. मानव es (जैसे, WA09 या H9) कोशिकाओं या मानव आईपीएस (जैसे, HS0077) Matrigel पर आवश्यक 8 मीडिया में 6 सेमी व्यंजन में मानक मानव es/आईपीएस सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का उपयोग कर बनाए रखें28,३२।
    2. DMEM/F-12 मीडिया में ३७ ° c 8-10 मिनट के लिए और फिर कुल्ला मानव es/DMEM/F12 मीडिया के साथ दो बार के साथ dispase के पास-धाराप्रवाह मानव es/
    3. DMEM के 2 मिलीलीटर/एफ-12 मीडिया मानव ते/आईपीएस सेल संस्कृति व्यंजन के अलावा, कमजोर अनुयाई एक सेल खुरचनी या pipetting द्वारा का उपयोग कर कालोनियों अलग ।
    4. 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में मानव es/आईपीएस कोशिकाओं को इकट्ठा और १६० × जी में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मानव es/
    5. केंद्रापसारक के बाद, DMEM/F12 त्यागें और E8 मीडिया के 1 मिलीलीटर में मानव ES/आईपीएस कोशिकाओं को निलंबित, और फिर एक सेल काउंटर का उपयोग करके सेल घनत्व गिनती ।
    6. लगाना उपयुक्त घनत्व समायोजन के बाद ES/आईपीएस कोशिकाओं (1-5 x 104 प्रति सेमी2 कोशिकाओं passaging के लिए या के रूप में संकेत दिया) नई संस्कृति व्यंजन में (पी-IA hydrogels oligopeptide या ECM के साथ भ्रष्टाचार) ।

4. मानव ते/आईपीएस सेल लक्षण वर्णन

  1. क्षारीय फॉस्फेट (एपी) गतिविधि का मूल्यांकन
    1. एक मानक alkaline फॉस्फेट रहते धुंधला का उपयोग मानव ES/आईपीएस कोशिकाओं के alkaline फॉस्फेट (एपी) गतिविधि को मापने ।
  2. Immunostaining
    1. प्रदर्शन immunostaining के तर्-1-81, SSEA-4, Sox2, और Oct3/4 वह और कूल्हों कोशिकाओं पर pluripotency की जांच करने के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल के बाद28,३२।
    2. 4% की एक ०.५ मिलीलीटर की मात्रा में जोड़ें (volume/paraformaldehyde प्रत्येक में 24 अच्छी तरह से पकवान जिसमें मानव ES/आईपीएस कोशिकाओं, और बाद में, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए व्यंजन बनाना कोशिकाओं को ठीक करने के लिए ।
    3. प्रत्येक कुआं से paraformaldehyde समाधान महाप्राण । फिर, अच्छी तरह से प्रति पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें और महाप्राण पंजाबियों कोशिकाओं कुल्ला करने के लिए । 3 बार कुल्ला करने की प्रक्रिया को पूरा करें ।
    4. Permeabilize सेल झिल्ली के ०.३% (volume/ट्राइटन-X १०० के लिए पंजाब में 30 मिनट में कमरे के तापमान पर ०.५ मिलीलीटर जोड़कर ।
    5. महाप्राण ट्राइटन-X १०० समाधान और जोड़ें ३०० µ एल के 2% (वजन मात्रा) पंजाब में गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) प्रत्येक में अच्छी तरह से (बफर अवरुद्ध), और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    6. ब्लॉकिंग बफ़र pipetting द्वारा निकालें, और बाद में, वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (Oct3/4 (1:200), Sox2 (1:200), SSEA-4 (1:200), और तर्-1-81 (1:200) द्वारा पिपेट, देखें तालिका 2) प्रत्येक कुआं में, जहां 1:200 इंगित करता है एंटीबॉडी पतला थे पंजाब २००-गुना और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक दिन के लिए मशीन के साथ ।
    7. महाप्राण प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान, और ३०० µ एल के साथ कोशिकाओं को धो ०.०५% के बीच 20 पंजाबियों समाधान में कमरे के तापमान पर 3 बार ।
    8. माध्यमिक एंटीबॉडी के ३०० µ एल जोड़ें (1:200, तालिका 2देखें), जो प्राथमिक आईजीजी उपप्रकार के लिए विशिष्ट हैं, में 2% (वजन/BSA समाधान प्रत्येक अच्छी तरह से और गर्मी में अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए ।
    9. ३०० µ के साथ कोशिकाओं धो ०.०५% के बीच 20 पंजाबियों समाधान अंधेरे में कमरे के तापमान पर 3 बार ।
    10. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा सना हुआ कोशिकाओं का विश्लेषण करें ।
  3. Embryoid शरीर गठन
    1. embryoid शरीर (EB) गठन के द्वारा मानव ES/आईपीएस कोशिकाओं के pluripotency की जांच 10 और 20 ।
      नोट: के पास ८०% 6 में संगम-खैर प्लेटें EB गठन की तैयारी के लिए पर्याप्त है ।
    2. DMEM/एफ-12 मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ मानव ES या आईपीएस कोशिकाओं कुल्ला दो बार, और फिर आवश्यक 6 मीडिया के १.५ मिलीलीटर में कोशिकाओं विसर्जित कर दिया ।
    3. लगभग ३२ के टुकड़ों में ८०% धाराप्रवाह मानव ES या आईपीएस कोशिकाओं के पास कट २०० µ l टिप्स का उपयोग कर । अगले, एक सेल खुरचनी का उपयोग करके बर्तन से अलग कोशिकाओं ।
    4. एक 6-well ultralow लगाव डिश में मानव ES/आईपीएस कोशिकाओं और हस्तांतरण ले लीजिए ।
    5. विनिमय आवश्यक 6 मीडिया pipetting पुराने मीडिया और ताजा मीडिया हर 2 दिन जोड़ने के द्वारा ।
      नोट: संस्कृति निलंबन में 2 सप्ताह के लिए ३७ ° c पर 5% CO2के साथ ।
    6. EBs के बाद homogenously आवश्यक 6 मीडिया में निलंबित कर दिया, 24 अच्छी तरह से टीसीपी ०.१ वजन% जिलेटिन के साथ लेपित व्यंजन पर संस्कृति के EBs हस्तांतरण, और संस्कृति आवश्यक 6 मीडिया में एक अतिरिक्त सप्ताह के लिए कोशिकाओं ।
    7. तीन भ्रूण germline परतों से व्युत्पंन कोशिकाओं के मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग [एएफपी (अन्तः), GFA (बाह्यत्वक), β III-Tubulin (बाह्यत्वक), और SMA (त्वक)] और ऊपर वर्णित immunostaining विधि द्वारा कोशिकाओं का मूल्यांकन.
  4. टेराटोमा गठन
    1. 10 और 20 मार्ग पर टेराटोमा गठन के द्वारा मानव ES/आईपीएस कोशिकाओं के pluripotency की जांच ।
      नोट: पास के 5 व्यंजन 6-well प्लेट्स में ८०% संगम टेराटोमा गठन के लिए पर्याप्त है (कम से कम 3 x 106 कोशिकाओं टेराटोमा गठन प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं) ।
    2. 2 मिलीलीटर DMEM के साथ कोशिकाओं कुल्ला/एफ-12 मीडिया दो बार, और फिर जोड़ें १.५ मिलीलीटर DMEM/एफ 12 मीडिया सेल संस्कृति व्यंजन के लिए ।
    3. लगभग ३२ टुकड़ों में २०० µ l टिप्स का उपयोग करके लगभग ८०% धाराप्रवाह मानव ES या आईपीएस कोशिकाओं में कटौती । अगले, एक सेल खुरचनी का उपयोग करके बर्तन से अलग कोशिकाओं ।
    4. एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में मानव ES/आईपीएस कोशिकाओं को इकट्ठा करने और १६० × जी में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    5. केंद्रापसारक के बाद, १०० µ l DMEM/F12 में सेल छर्रों निलंबित, और फिर १०० µ एल Matrigel (1:1 मात्रा अनुपात) के साथ सेल छर्रों मिश्रण ।
    6. एक-20 ° c प्री-कूल्ड सिरिंज में सेल सस्पेंशन स्थानांतरित. इंजेक्षन, कुल में, कम से कम 3 × 106 पुरुष मंजूरी-SCID में चमड़े की कोशिकाओं (मंजूरी । CB17-Prkdascid/JNarl) चूहों (5-8 सप्ताह).
    7. 5-8 सप्ताह के बाद, टुकड़े teratomas, ४.०% के साथ फिक्स (वजन मात्रा/paraformaldehyde समाधान, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    8. आयल के साथ टेराटोमा फिक्स, आयल-एंबेडेड teratomas स्लाइस, और hematoxylin और eosin के साथ दाग (एच एंड ई) एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर28,३२।
      नोट: शोधकर्ताओं ने निश्चित टेराटोमा ऊतक कंपनी को तेल के साथ teratomas को ठीक करने के लिए भेज सकते हैं, आयल-एंबेडेड teratomas टुकड़ा, और एच एंड ई, जो आम तौर पर अस्पतालों में पैथोलॉजी विभाग में प्रयोग किया जाता है के साथ नमूना दाग ।
  5. मानव वसा-व्युत्पन्न स्टेम (विज्ञापन) सेल संस्कृति
    1. गर्म संस्कृति मीडिया (DMEM युक्त 1% antimycotic एंटीबायोटिक और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS)), ०.२५% trypsin-EDTA, और पंजाबियों के लिए एक पानी स्नान में ३७ ° c करने के लिए उपयोग करने से पहले.
    2. प्रत्येक 6-मुख्यमंत्री संस्कृति पकवान जहां कोशिकाओं को संस्कृति रहे है में पंजाब के 10 मिलीलीटर pipetting द्वारा मानव विज्ञापन कोशिकाओं धो लो ।
    3. 6-मुख्यमंत्री संस्कृति व्यंजन में trypsin-EDTA समाधान (०.२५%) की 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर समाधान की मशीन ।
    4. कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं कि पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोपी के तहत 6 सेमी संस्कृति व्यंजन में कोशिकाओं का निरीक्षण करें ।
    5. एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा, और संस्कृति मीडिया के एक समान मात्रा में जोड़ें (1% antimycotic एंटीबायोटिक और 10% FBS से युक्त DMEM) के केंद्रापसारक ट्यूब में trypsin-EDTA बेअसर ।
    6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० × जी में कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    7. केंद्रापसारक के बाद, supernatant ध्यान से pipetting द्वारा त्यागें, सेल गोली परेशान बिना ।
    8. संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं reसस्पेंड, और उसके बाद उपयुक्त घनत्व पर कोशिकाओं बीज (5-10 x 103 प्रति सेमी2 कोशिकाओं passaging के लिए या के रूप में संकेत के रूप में) नई संस्कृति व्यंजन में (पी-आइए hydrogels के साथ भ्रष्टाचार और बिना oligopeptides और ECM) ।
  6. मानव एमनियोटिक द्रव स्टेम (एएफएस) कोशिका संस्कृति
    1. गर्म खेती मीडिया (DMEM/MCDB २०१ (2:3) युक्त 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 एनजी/एमएल bFGF और 1% antimycotic एंटीबायोटिक), ०.२५% trypsin-EDTA, और पंजाब के लिए ३७ ° c के लिए एक जल स्नान में उपयोग करने से पहले ।
    2. प्रत्येक 6-मुख्यमंत्री संस्कृति पकवान में पंजाब के 10 मिलीलीटर pipetting द्वारा मानव एएफएस कोशिकाओं को धो जहां कोशिकाओं को संस्कृति रहे हैं ।
    3. 6-मुख्यमंत्री संस्कृति व्यंजन में trypsin-EDTA समाधान (०.२५%) की 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं को मशीन ।
    4. कोशिकाओं की पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोपी के तहत 6-सेमी संस्कृति व्यंजन पर कोशिकाओं अलग कर रहे हैं का निरीक्षण करें ।
    5. एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा, और संस्कृति मीडिया (DMEM/MCDB २०१ (2:3) 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 एनजी/एमएल bFGF और 1% antimycotic एंटीबायोटिक) के केंद्रापसारक ट्यूब में trypsin-EDTA बेअसर युक्त के बराबर मात्रा जोड़ें ।
    6. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २५० × जी में कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    7. केंद्रापसारक के बाद, supernatant ध्यान से pipetting द्वारा सेल गोली परेशान बिना त्यागें ।
    8. खेती मीडिया में कोशिकाओं reसस्पेंड और फिर बीज उपयुक्त घनत्व (5-10x103 कोशिकाओं के प्रति सेमी2 के लिए passaging के लिए या के रूप में संकेत दिया) नई संस्कृति व्यंजन में (पी-IA hydrogels के साथ और oligopeptide और ECM के बिना भ्रष्टाचार) ।

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Representative Results

पी-IA hydrogels ECM के साथ भ्रष्टाचार-व्युत्पंन oligopeptide (oligoECM) या विभिंन लोच के साथ ECM प्रतिक्रिया योजना का पालन करके तैयार किया गया, के रूप में चित्रा 1aमें देखा, oligoECM (चित्र 1b) के विभिंन प्रकार का उपयोग कर । hydrogels की लोच लागू crosslinking तीव्रता (समय) (चित्रा 1C) द्वारा विनियमित थे. पी-IA hydrogels vitronectin के साथ भ्रष्टाचार-व्युत्पंन oligopeptides, जो २५.३ केपीए (24 ज crosslinking समय) के एक भंडारण मापांक है, पर 10-20 मार्ग के लिए मानव आईपीएस और ES कोशिकाओं के दीर्घकालिक संस्कृति का समर्थन किया । विशेष रूप से, पी-ia hydrogels एक संयुक्त खंड (पी-ia-24-VN1G) या एक दोहरी श्रृंखला (पी-ia-24-VN2G) के साथ भ्रष्टाचार मानव आईपीएस और ES कोशिकाओं के pluripotency का समर्थन किया, जो oligoECM के अपेक्षाकृत कम एकाग्रता के साथ तैयार किए गए थे (200-500 μg/एमएल) से पी-IA-VN1 hydrogels, जो oligoECM की एक उच्च एकाग्रता का उपयोग आवँयक (> 1000 μg/एमएल) मानव आईपीएस और ES कोशिकाओं के pluripotency बनाए रखने के लिए28,३२।

मानव ES कोशिकाओं पर बनाए रखा माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) अन्य संश्लेषित कोटिंग सामग्री पर संस्कृति में स्थानांतरित कर दिया गया (उदा., Synthemax II) लेपित व्यंजन और पी-IA-24-VN1 hydrogel व्यंजन (चित्रा 2)28. मानव es कोशिकाओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोटिंग व्यंजन पर प्रसंस्कृत और अधिक आसानी से अंतर करने के लिए पाया गया, विशेष रूप से कालोनियों के किनारे पर (चित्रा 2a और 2c), जबकि मानव es कोशिकाओं पर अपने pluripotency बनाए रख सकता है P-IA-24-VN1-1000 hydrogel व्यंजन क्योंकि विभेदित कोशिकाओं P-IA-24-VN1-1000 hydrogel व्यंजन (चित्रा 2 बी और 2d)28पर मानव ES कोशिकाओं की आकृति विज्ञान से नहीं देखा जा सकता है ।

मानव ES के pluripotency (चित्रा 3) और आईपीएस (चित्रा बी) कोशिकाओं पर कल्चरित पी-ia-24 hydrogels oligoECM के साथ भ्रष्टाचार (पी-ia-24-VN1-1000, p-ia-24-VN1G-१०००, p-ia-24-VN2C), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पारंपरिक संयोजक vitronectin ( rVitronectin)-लेपित व्यंजन, pluripotent निर्माता प्रोटीन की अभिव्यक्ति के आधार पर मूल्यांकन किया गया था (Nanog, Sox2, और Oct3/4) के बाद कोशिकाओं को एक्सो में प्रत्येक डिश पर संस्कृति थे मुक्त 10 अंश के लिए आवश्यक 8 मीडिया का उपयोग कर शर्तों३२। इन pluripotency प्रोटीन पर व्यक्त की ड्यूटियां दी गई मानव आईपीएस और ES कोशिकाओं पर कल्चरित P-IA hydrogels oligoECM के साथ, साथ ही साथ rVitronectin-लेपित व्यंजन पर एक्सो-मुक्त परिस्थितियों में ।

इन विट्रो (EB गठन) में तीन रोगाणु परतों से व्युत्पन्न कोशिकाओं में विभेदक क्षमता का मूल्यांकन और vivo में (टेराटोमा गठन) सिंथेटिक पर खेती के बाद मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं की pluripotency सत्यापित करने के लिए आवश्यक है biomaterials. इसलिए, मानव ES कोशिकाओं (चित्रा 4) और मानव आईपीएस कोशिकाओं (चित्रा 5) पी-IA-oligoECM hydrogel व्यंजन और संयोजक vitronectin-10 मार्ग के लिए लेपित व्यंजन पर खेती की गई थी, और बाद में, कोशिकाओं निलंबन में संस्कृति थे फार्म ebs. EBs आगे कुछ हफ्तों के लिए जिलेटिन पर लेपित बर्तन की खेती के लिए कोशिकाओं की क्षमता का निरीक्षण करने के लिए व्यंजन पर फैल रहे थे (चित्र 4a और चित्रा धारा 5)३२। विभेदित मानव ES (फिगर 4B) और आईपीएस (फिगर 5B) कोशिकाएँ तीन रोगाणु परतों से प्राप्त प्रोटीन के लिए immunostained थीं: अल्फा-भ्रूणप्रोटीन (एएफपी, अन्तः), चिकनी मांसपेशी actin (SMA, त्वक), और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP , बाह्यत्वक)३२। दोनों मानव आईपीएस और es कोशिकाओं को सभी तीन रोगाणु परतों से व्युत्पंन कोशिकाओं में अंतर पाया गया, मानव आईपीएस और ES कोशिकाओं के pluripotency का एक और सत्यापन का संकेत है, यहां तक कि पी-IA पर खेती hydrogels oligoECM के साथ भ्रष्टाचार के बाद एक्सो में मुक्त लंबी अवधि के लिए शर्तें (मार्ग > 10 मार्ग) ।

vivo में तीन रोगाणु परतों से उत्पंन कोशिकाओं में मानव ES कोशिकाओं के भेदभाव की क्षमता (टेराटोमा गठन परख) भी मूल्यांकन किया गया । मानव ES कोशिकाओं, जो पी-ia-VN1-1000 (चित्रा 6A) और पी-ia-VN2C-१००० (चित्रा घमण्ड) पर एक्सो-10 मार्ग के लिए मुक्त संस्कृति शर्तों में खेती की गई थी, को मंजूरी-SCID चूहों३२में चमड़े के नीचे इंजेक्शन थे । teratomas चूहों से अलग थे, और टेराटोमा ऊतक वर्गों तय किया गया और एच एंड ई के साथ दाग (चित्रा 6A और घमण्ड)३२. teratomas सभी तीन रोगाणु परतों से उत्पन्न कोशिकाओं के अस्तित्व को प्रदर्शित: अन्तः (आंतों उपकला, चित्रा 6A(बी) और घमण्ड (बी)), त्वक (उपास्थि, चित्रा 6A(सी) और घमण्ड (ग)), और बाह्यत्वक ( neuroepithelium, चित्रा 6A(d); रेटिना वर्णक उपकला, चित्रा घमण्ड(डी)). ये परिणाम सुझाव है कि मानव ES कोशिकाओं p-ia-24-VN1-1000 और पी-ia-24-VN2C-१००० में एक्सो-मुक्त शर्तों 10 मार्ग के लिए तीन रोगाणु परतों से उत्पंन कोशिकाओं में अंतर कर सकते है पर संस्कृति, यह दर्शाता है कि उनके pluripotency में बनाए रखा है vivo.

मानव एएफएस कोशिकाओं को भी संशोधित p-ia hydrogel, p-ia-oligoECM hydrogel, और विस्तार मीडिया में टीसीपी व्यंजन में संस्कृति थे । चित्रा 7 से पता चलता है मानव एएफएस कोशिकाओं के morphologies में संस्कृति के चार दिनों के बाद खेती पी-ia और पी-ia-oligoECM hydrogel व्यंजन के साथ लोच (E ') १२.२ (crosslinking समय = 6 एच), १८.३ (crosslinking समय = 12 ज), २५.३ (crosslinking समय = 24 ज), और ३०.४ केपीए (crosslinking समय = ४८ ज) 0 या ५० μg/एमएल के एक oligoECM एकाग्रता का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से कठोरता के 3-12 GPa के साथ टीसीपी व्यंजन30।

मानव एएफएस कोशिकाओं को पी-ia hydrogel व्यंजन के साथ या बिना oligoECM पर पैदा नहीं कर सका जब पी-ia hydrogels की कठोरता 11 केपीए से कम थी (पीवी-2h, पीवी-2h-y, pv-4h, और pv-4h-y), जबकि मानव एएफएस कोशिकाओं के साथ या पैदा के बिना oligoECM सकता है जब E ' 12 केपीए से अधिक था, P-ia-6h और PV-ia-6h-COL1 hydrogel व्यंजन के अपवाद के साथ । पी-ia-6h और पी-ia-6h-COL1 मानव एएफएस कोशिकाओं की संस्कृति के लिए अनुकूल नहीं लग रहे क्योंकि सॉफ्ट सेल कल्चर के कारण यह कोशिका चक्रीय प्रगति में३०से अधिक का माल रोक पाता है ।

उपरोक्त परिणामों का सुझाव है कि पी-IA hydrogel व्यंजन दीर्घकालिक स्टेम सेल की खेती के लिए एक इष्टतम सामग्री है और विशिष्ट कठोरता और oligoECM के चयन के द्वारा स्टेम कोशिकाओं के pluripotency बनाए रखने के साथ ही इष्टतम प्रतिक्रिया oligoECM की एकाग्रता (oligoECM की सतह घनत्व) ।

Figure 1
चित्रा 1: पी-IA hydrogels oligoECM या ECM के साथ भ्रष्टाचार की तैयारी । (क) पी के लिए प्रतिक्रिया की योजना-IA hydrogels ECM और ECM के साथ भ्रष्टाचार-व्युत्पंन oligopeptide (oligoECM)29। कॉपीराइट २०१५ । रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ अनुकूलित । (ख) डिजाइन और oligopeptides के अनुक्रम P-IA hydrogels पर भ्रष्टाचार । सिंगल चेन oligopeptides (पी-ia-बीएसपी, पी-ia-VN1, और पी-ia-HBP1), एक संयुक्त खंड के साथ एकल श्रृंखला oligopeptides (पी-ia-VN1G), और दोहरी जंजीरों (पी-ia-VN2C और पी-ia-HBP2C) और ECM (पी-ia-ECM) पी-ia hydrogels३२पर भ्रष्टाचार किया गया । एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण लाइसेंस के तहत अनुकूलित । (ग) पी-IA की कठोरता crosslinking29के विभिंन अवधियों द्वारा तैयार hydrogels । कॉपीराइट २०१५ । रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पी-IA-24-VN1 hydrogels और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोटिंग व्यंजन पर मानव ES सेल संस्कृतियों की तुलना. मानव ES कोशिकाओं की आकृति विज्ञान (WA09) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोटिंग व्यंजन (a,पर खेती ख) और पी-IA-24-VN1-1000 (सी, डी) मार्ग 1 पर व्यंजन जब मानव ES कोशिकाओं की खेती से माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) में स्थानांतरित कर दिया गया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोटिंग व्यंजन या PVA-24-VN1-1000 व्यंजन पर खेती । लाल तीर विभेदित मानव ES कोशिकाओं को दिखाते हैं । स्केल पट्टियां इंगित करता है ५० µm (a, b) और १०० µm (c, d)28। एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण लाइसेंस के तहत अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: पी-आइए hydrogels पर मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं के pluripotency के लक्षण वर्णन विभिंन oligopeptide डिजाइन के साथ भ्रष्टाचार । (क) pluripotency प्रोटीन्स की अभिव्यक्ति Nanog (red), Sox2 (हरा), और Oct3/मानव ES (H9) पर 4 (हरा) कोशिकाओं immunostaining द्वारा परमाणु लेबलिंग के लिए Hoechest33342 के साथ दोहरी धुंधला के साथ विश्लेषण (नीला) पर संवर्धन के बाद (ए) P-IA-24-VN1-1000, (b) p-ia-24-VN1G-१०००, और (c) p-IA-24-VN2C-१००० hydrogels, और (d) संयोजक vitronectin (rVitronectin)-10 अंश के लिए एक्सो-फ़्री शर्तों के अंतर्गत लेपित व्यंजन । (ख) pluripotency प्रोटीन्स Nanog (red) की अभिव्यक्ति, Sox2 (हरा), और Oct3/4 (ग्रीन) मानव आईपीएस कोशिकाओं पर परमाणु लेबलिंग के लिए Hoechest33342 के साथ दोहरी दाग के साथ immunostaining द्वारा विश्लेषण (नीले) पर संवर्धन के बाद (एक) पी-IA-24-VN1-1000 hydrogel, (b) P-IA-24-VN2C-१००० hydrogel, और (c) संयोजक vitronectin (rVitronectin)-hydrogels के तहत लेपित व्यंजन-10 मार्ग३२के लिए एक्सो मुक्त शर्तों । स्केल सलाखों के संकेत ५० µm. एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण लाइसेंस के तहत अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: पी-IA hydrogels पर मानव ES कोशिकाओं के भेदभाव की क्षमता का लक्षण वर्णन विभिंन oligopeptide डिजाइन के साथ भ्रष्टाचार । (क) EBs से (क) P-IA-24-VN1-1000 पर संवर्धन के बाद मानव ES (H9) कोशिकाओं से विभेदित कोशिकाओं की आकृति विज्ञान, (b) p-ia-24-VN1G-१०००, और (c) p-ia-24-VN2C-१००० hydrogels, और (d) संयोजक vitronectin (rVitronectin)-10 मार्ग के लिए एक्सो मुक्त शर्तों के तहत लेपित व्यंजन । स्केल सलाखों के संकेत १०० µm. (ख) एक बाह्यत्वक प्रोटीन की अभिव्यक्ति (GFAP, लाल), त्वक प्रोटीन (SMA, ग्रीन), और अन्तः प्रोटीन (एएफपी, ग्रीन) मानव ES में (H9) कोशिकाओं immunostaining द्वारा मूल्यांकन के साथ दोहरी दाग के साथ परमाणु के लिए Hoechest33342 P-IA-24-VN1-1000 पर संवर्धन के बाद लेबलिंग (नीला), p-ia-24-VN1G-१०००, और p-ia-24-VN2C-१००० hydrogels, और पर संयोजक vitronectin (rVitronectin)-10 अंश३२के लिए एक्सो-मुक्त शर्तों के तहत लेपित व्यंजन । स्केल सलाखों के संकेत ५० µm. एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण लाइसेंस के तहत अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पी-IA hydrogels विभिंन oligopeptide डिजाइन के साथ भ्रष्टाचार पर मानव आईपीएस कोशिकाओं के भेदभाव की क्षमता का लक्षण वर्णन । (क) संवर्धन पर (a) P-IA-24-VN1-1000 hydrogels के बाद मानव आईपीएस (HPS0077) कोशिकाओं से विभेदित EBs से कोशिकाओं की आकृति विज्ञान, (b) P-IA-24-VN2C-१००० hydrogels, और (c) संयोजक vitronectin (rVitronectin)- 10 मार्ग के लिए एक्सो-मुक्त शर्तों के तहत लेपित व्यंजन । स्केल सलाखों के संकेत १०० µm. (ख) एक बाह्यत्वक प्रोटीन की अभिव्यक्ति (GFAP, लाल), त्वक प्रोटीन (SMA, ग्रीन), और अन्तः प्रोटीन (एएफपी, ग्रीन) मानव आईपीएस (HPS0077) कोशिकाओं में immunostaining द्वारा विश्लेषण के साथ दोहरी धुंधला Hoechest33342 के लिए परमाणु लेबलिंग (नीला) पर संवर्धन के बाद (a) P-IA-24-VN1-1000 hydrogels, (ख) पी-IA-24-VN2C-१००० hydrogels, और (ग) संयोजक vitronectin (rVitronectin)-10 मार्ग३२के लिए एक्सो मुक्त शर्तों के तहत लेपित व्यंजन । स्केल सलाखों के संकेत ५० µm. एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण लाइसेंस के तहत अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: p-ia-24-VN1 और p-ia-24-VN2C hydrogels पर संवर्धन के बाद vivo में मानव ES (H9) कोशिकाओं की विभेदक क्षमता का लक्षण वर्णन । (क) (क) संवर्धन के बाद पी-IA-24-VN1-1000 hydrogels पर एक्सो के बाद मानव ES कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन द्वारा एक टेराटोमा के चित्र-10 मार्ग के बाद मुक्त सेल संस्कृति की स्थिति । (ख) आंत्र उपकला (अन्तः), (ग) उपास्थि (त्वक), और (डी) neuroepithelium (बाह्यत्वक) सहित ऊतकों मनाया जा सकता है । (B) (a) संवर्धन के बाद P-IA-24-VN2C-१००० hydrogels पर टेराटोमा के बाद मानव ES कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन द्वारा एक की तस्वीर 10 अंश के बाद एक्सो-मुक्त सेल संस्कृति शर्तों के तहत । ऊतकों (ख) आंत्र उपकला (अन्तः), (सी) उपास्थि (त्वक), और (डी) रेटिना वर्णक उपकला (बाह्यत्वक) सहित३२मनाया जा सकता है । स्केल सलाखों के संकेत १०० µm. एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण लाइसेंस के तहत अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: hydrogel के साथ या बिना ECM-व्युत्पंन oligopeptides संस्कृति के 4 दिनों के बाद से मैटीरियल की गई मानव एएफएस कोशिकाओं को टीसीपी डिश और पी-आइए पर खेती की आकृतियां । (क) टीसीपी व्यंजन पर मानव एएफएस कोशिकाओं की आकृति विज्ञान । (ख) p-ia-6h और p-ia-6h-Z hydrogel व्यंजन पर मानव एएफएस कोशिकाओं की आकृति विज्ञान (p-ia-6h, p-ia-6h-COL1-50, p-ia-6h-FN1-50, p-ia-6h-VN1-50, p-ia-6h-HBP1-50, और p-ia-6h-cRGD-५०) । (ग) p-ia-12घं और p-ia-12घं-Z hydrogel व्यंजन पर hAFCs की आकृति विज्ञान (p-ia-12घं, p-ia-12घं-COL1-50, p-ia-12घं-FN1-50, p-ia-12घं-VN1-50, p-ia-12घं-HBP1-50, और p-ia-12घं-cRGD-५०) । p-ia-24 और p-ia-24-Z hydrogel व्यंजन (p-ia-24, पर मानव एएफएस कोशिकाओं की (D) आकृति विज्ञान p-ia-24-COL1-50, p-ia-24-FN1-50, p-ia-24-VN1-50, p-ia-24-HBP1-50, और p-ia-24-cRGD-५०) । (ङ) p-ia-48h और p-ia-48h-Z hydrogel व्यंजन (p-ia-48h, पर मानव एएफएस कोशिकाओं की आकृति विज्ञान, p-ia-48h-COL1-50, p-ia-48h-FN1-50, p-ia-48h-VN1-50, p-ia-48h-HBP1-50, और p-ia-48h-cRGD-५०) । स्केल सलाखों १०० माइक्रोन30संकेत मिलता है । कॉपीराइट २०१७ । रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सामग्री का नाम/ संक्षिप्त
GTPGPQGIAGQRGVV col1
GACRGDCLGA चक्रीय RGD (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST cs1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectin rvn
Fibronectin एफ

तालिका 1: ECM-व्युत्पंन oligopeptide अनुक्रम और ECM इस अध्ययन में प्रयुक्त ।

एंटीबॉडी एकाग्रता (कमजोर पड़ने की दर)
Nanog 1:200
SSEA4 1:200
OCT3 ४/ 1:200
Sox2 1:200
चिकना मांसपेशी Actin 1:200
(α-SMA) 1:200
एएफपी 1:200
GFAP 1:200
Alexa Fluor ५५५-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस 1:200

तालिका 2: इस अध्ययन में immunostaining के लिए इस्तेमाल एंटीबॉडी ।

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Discussion

पी-ia-oligoECM और पी-ia-ECM hydrogels बदलती कठोरता के साथ मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं के दीर्घकालिक विस्तार के लिए विकसित किया गया एक्सो में दस से अधिक मार्ग के लिए अपने pluripotency बनाए रखने मुक्त शर्तों, साथ ही साथ मानव एएफएस कोशिकाओं की संस्कृति के लिए, विज्ञापन कोशिकाओं, और टेम स्टेम सेल25,28,३२। पी-आइए hydrogels oligoECM के साथ मैटीरियल सेल खेती सामग्री के लिए एक उत्कृष्ट उंमीदवार है अंतर और स्टेम सेल के रूप में अच्छी तरह से प्राथमिक कोशिकाओं के विभिंन प्रकार के प्रसार के भाग्य पर सेल संस्कृति सामग्री के प्रभाव की जांच और कैंसर की कोशिकाओं ।

पी-ia समाधान व्यंजन पर डाली है, जब p-ia हल पारदर्शी होना चाहिए । crosslinking टाइम का फैसला पी-आइए hydrogels की crosslinking तीव्रता तय करता है । P-IA के 24 ज crosslinking hydrogels मानव ES/आईपीएस सेल संस्कृति के लिए इष्टतम hydrogels पैदा करता है । किसी भी oligopeptides और ECMs पी IA पर भ्रष्टाचार किया जा सकता है hydrogels इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, जहां oligopeptides और ECMs मुक्त अमीनो समूह है25,28,29,30,31, ३२. oligopeptides या ECMs की सतह का घनत्व एक्स-रे photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी (xps) माप द्वारा पता लगाया जा सकता है, यद्यपि XPS सतह घनत्व का निरपेक्ष मूल्य उपस्थित नहीं कर सकता, लेकिन oligopeptides या ECMs का अस्तित्व सुरक्षित रूप से हो सकता है विश्लेषण.

P-IA hydrogels के साथ और बिना भ्रष्टाचारी oligopeptides या ECMs तैयार किया जा सकता है, जो 3-30 केपीए से भंडारण मापांक है, crosslinking समय पर निर्भर करता है । इसके बजाय P-IA को तैयार करना कठिन है hydrogels से कम संग्रहण मापांक वाले 3 केपीए और उच्च भंडारण मापांक से 30 केपीए25,28,29,30,31,३२। यह पी-IA hydrogels के रासायनिक crosslinking की वर्तमान hydrogel तैयारी विधि की सीमा है । हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल hydrogels का एक और विकल्प प्रदान करता है अलग लोच, जो प्राथमिक कोशिकाओं की संस्कृति का समर्थन कर सकते हैं, कैंसर कोशिकाओं, या मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं सहित स्टेम कोशिकाओं, लेकिन polyacrylamide से नहीं बना रहे हैं. विशेष रूप से, मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं polyacrylamide hydrogels पर पैदा नहीं कर सकते, लेकिन पी-IA hydrogels पर पैदा के रूप में चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, और चित्रा 6में दिखाया गया है । दरअसल, पी-IA-24-VN1 hydrogels मानव ते सेल संस्कृति का समर्थन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोटिंग व्यंजन (चित्रा 2) से बेहतर है । इसलिए, P-IA hydrogels मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं की संस्कृति के लिए बेहतर कर रहे हैं ।

यह hydrogels के इष्टतम लोच की जांच जहां मानव ES और आईपीएस कोशिकाओं ऐसी cardiomyocytes३५, रेटिना वर्णक उपकला३६, β कोशिकाओं6, और गु के रूप में कोशिकाओं की विशिष्ट वंश में विभेदित कर रहे है दिलचस्प होगा + कोशिकाओं6 अपक्षयी चिकित्सा के भविष्य के विकास के लिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को आंशिक रूप से विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान के तहत अनुदान संख्या 106-2119-एम-008 -003, 105-2119-एम-008-006, और 104-2221-ए-008-107-MY3 द्वारा समर्थित किया गया था । इस शोध को ताइवान Landseed हॉस्पिटल प्रोजेक्ट (NCU-LSH-१०५-A-001) ने भी सपोर्ट किया था । जापान के शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से वैज्ञानिक अनुसंधान (नंबर 15K06591) के लिए एक अनुदान-सहायता भी स्वीकार की जाती है । ए Higuchi के लिए अंतरराष्ट्रीय वैज्ञानिक भागीदारी कार्यक्रम (ISPP-००६२) वाइस Rectorate स्नातक अध्ययन और अनुसंधान, राजा सऊद विश्वविद्यालय, रियाद ११४५१, सऊदी अरब के किंगडम के लिए स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

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References

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