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Bioengineering

Culture de cellules souches pluripotentes humaines sur Polyvinyl alcool-Co-itaconique acides Hydrogels avec raideur variable dans des Conditions sans Xeno

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole est présenté afin de préparer le polyvinyliques alcool-co-itaconique acides hydrogels avec raideur variable, qui ont été greffés avec et sans les oligopeptides, pour étudier l’effet de la rigidité des biomatériaux sur la différenciation et la prolifération des cellules souches. La rigidité des hydrogels était contrôlée par le temps de réticulation.

Abstract

L’effet d’indices physiques, comme la rigidité des biomatériaux sur la prolifération et la différenciation des cellules souches, a été étudié par plusieurs chercheurs. Toutefois, la plupart de ces chercheurs ont utilisé des hydrogels de polyacrylamide pour culture de cellules souches dans leurs études. Par conséquent, leurs résultats sont controversés car ces résultats pourraient provenir de la spécificité de la polyacrylamide et non à partir de la file d’attente physique (rigidité) des biomatériaux. Nous décrivons ici un protocole pour la préparation des hydrogels, qui ne reposent pas sur polyacrylamide, où les différentes souches, les cellules dont les cellules souches embryonnaires humaines (ES) et humaines pluripotentes induites des cellules souches (iPS), peuvent être cultivées. Hydrogels avec raideur variable ont été préparés à partir bioinert, polyvinyl alcool-co-itaconique acide (P-IA), avec raideur, contrôlé par le degré de réticulation en changeant de temps de réticulation. Les hydrogels de P-IA greffées avec et sans les oligopeptides provenant de la matrice extracellulaire a été étudiées comme une future plate-forme de la culture de cellules souches et différenciation. La culture et le passage de cellules de tige fluides amniotique, adipeux dérivées de cellules souches, les cellules ES humaines et cellules iPS humaines est décrit en détail ici. Les hydrogels oligopeptide P-IA ont montré des performances supérieures, qui ont été induits par leurs propriétés de rigidité. Ce protocole indique la synthèse de ce biomatériau, manipulation de leur surface, ainsi que de contrôler les propriétés de rigidité et enfin, leur impact sur les cellules souches sort en utilisant des conditions de culture libre xeno. Se fondant sur des études récentes, ces substrats mis à jour le peuvent agir comme des futures plateformes pour soutenir et diriger le destin de diverses cellules souches ligne à liaisons différentes ; et encore, de se régénérer et de restaurer les fonctions de l’organe perdu ou un tissu.

Introduction

Le sort de la différenciation des cellules souches dans une lignée spécifique des cellules et la prolifération à long terme des cellules souches, cellules surtout humaines pluripotentes induites (iPS) et les cellules souches embryonnaires humaines (ES), est connu pour être régulée par des inhibiteurs, facteurs de croissance, et / ou de petites molécules bioactives dans les milieux de culture. Récemment, les repères physiques des biomatériaux, particulièrement la rigidité des biomatériaux de culture cellulaire, ont été reconnues comme un facteur important, guider le destin des cellules souches la prolifération et la différenciation1,2, 3,4,5,6. Par conséquent, plusieurs chercheurs ont commencé à enquêter sur le sort des cellules souches, qui sont cultivées sur des hydrogels, sur la différenciation, principalement à l’aide de polyacrylamide hydrogels avec raideur variable.

La rigidité des biomatériaux peut contrôler des adhérences focales, la morphologie cellulaire, phénotype cellulaire et l’adhérence de cellules souches, en particulier dans la culture à deux dimensions (2d)1,2,3,5. Mécano-détection des biomatériaux par les cellules souches est généralement contrôlée par adhérence focale signalisation via intégrines. NMMIIA, myosine non musculaire contractilité IIA-dépendante du cytosquelette d’actine joue un rôle essentiel dans le processus de mechanosensing des cellules souches en 2-D cell culture systèmes3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler et ses collègues ont développé une notion intéressante que les cellules souches adultes, comme la moelle osseuse des cellules de tige (BMS) cultivées sur les biomatériaux de culture cellulaire avec une rigidité similaire à celle des tissus spécifiques, ont tendance à se différencier en cellules provenaient de 5de tissus spécifiques. BMS cellules incubées sur polyacrylamide doux 2D hydrogels recouverts de collagène de type I (avec une rigidité comparable à celle des tissus cérébraux) dans les médias d’expansion ont été spontanément induites à se différencier en premières lignées de neurone, tandis que BMS cellules cultivées sur hydrogels avec une rigidité similaire à celle des tissus musculaires ou osseux collagénique trouvées pour induire la différenciation en premières lignées des myocytes et les ostéoblastes, respectivement, du 2D polyacrylamide hydrogels3,5. Plusieurs chercheurs ont étudié le devenir de cellules souches de la différenciation cultivés sur polyacrylamide hydrogels immobilisées avec le collagène de type I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Toutefois, il convient de mentionner que certains contradictoires rapports1,18,22,23,24 existent pour la célèbre idée suggérée par Engler et al. 5 c’est parce qu’idée5 de Engler a été développé uniquement sur polyacrylamide hydrogels et leurs résultats provenir des caractéristiques particulières de ce biomatériau (polyacrylamide) et pas uniquement à partir de la file d’attente physique (rigidité) de ce biomatériau. Par conséquent, il est important de développer un autre type d’hydrogel, dont la rigidité peut être contrôlée par réticulation de l’hydrogel. À cette fin, les hydrogels bioinert ont été développés, qui ont été préparés de polyvinyle alcool-co-itaconique acide (P-IA) avec une rigidité différente, qui était contrôlée par le degré de réticulation avec une évolution réticulation temps25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. les cellules souches peuvent être cultivées sur ici P-IA hydrogels, ainsi que P-IA hydrogels greffés avec des matrices extracellulaires (ECMs) et oligopeptides. Dans une précédente étude25des cellules souches hématopoïétiques humaines (hHSCs) du sang de cordon ombilical ont été cultivés sur P-IA hydrogels avec des valeurs de rigidité différente allant d’un 3 kPa à 30 kPa module de stockage où la fibronectine ou un oligopeptide dérivé la fibronectine (CS1, EILDVPST) a été greffée sur les hydrogels P-IA. Haute ex vivo expansion pli de hHSCs a été observée chez les hydrogels P-IA greffées avec CS1 ou la fibronectine, qui affiche une rigidité intermédiaire allant de 12 kPa à 30 kPa25.

IPS humaines et cellules d’ES ne peut pas être cultivées sur culture de tissus classiques polystyrène (TCP) plats33,34 parce que ES humains et cellules iPS nécessitent une fixation spécifique aux SEGDA, tels que la vitronectine ou laminine pour maintenir leur pluripotence au cours de la culture à long terme. Par conséquent, plusieurs structures d’oligopeptide-greffés P-IA hydrogels présentant des caractéristiques de rigidité optimale ont été conçus et préparés dans les formations d’une seule chaîne, une chaîne unique avec un segment commun, une double chaîne avec un segment commun et un type ramifié 32de chaîne. Oligopeptide séquences ont été sélectionnés dans les domaines de liaison intégrine et glycosaminoglycanes d’ECMs. Les hydrogels P-IA greffés avec les oligopeptides dérivés de vitronectine avec une double chaîne ou un segment commun, d’un indice de stockage à environ 25 kPa, prise en charge de la culture à long terme de ES humains et de cellules iPS pour plus de 12 passages sous xeno-libre et chimique 32de conditions définies. Le segment mixte et double chaîne de molécules d’adhérence cellulaire sur les hydrogels a facilité la prolifération et la pluripotence des humains ES et iPS cellules32. Ici, un protocole pour la préparation des hydrogels P-IA (avec un module de stockage de 10 kPa à 30 kPa, ce qui a été mesurée dans des conditions humides dans l’air) greffées avec et sans les oligopeptides ou ECMs est décrite. Comment la culture et le passage de plusieurs cellules souches (y compris les cellules souches fluides amniotiques, adipeux dérivées de cellules souches, les cellules ES humaines et cellules iPS humaines) s’affiche.

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Protocol

Les expériences dans cette étude ont été approuvées par les comités d’éthique de l’hôpital de Landseed de Taiwan (IRB-13-05) et l’Université nationale centrale. Toutes les expériences ont été menées conformément aux règlements et lignes directrices gouvernementales et institutionnelles pertinentes et applicables au cours de cette étude.

1. solution et préparation des médias

  1. Purification de polymère
    1. Purifier P-IA avec groupe acide carboxylique avec un degré d’hydrolyse de > 96,5 % de P-IA de lavage avec de l’éthanol. Placer 20 g de P-IA dans 200 mL d’éthanol dans un bécher conique de 500 mL et agiter sur un agitateur magnétique pendant 24 à 30 h. échange l’éthanol avec de l’éthanol fraîche tous les 8-10 h.
    2. Supprimer P-IA de l’éthanol par filtration à l’aide d’un entonnoir Büchner.
    3. P-IA sec de séchage sous vide à température ambiante pendant 24h.
      Remarque : Il est recommandé de nettoyer le piège dans le système de séchage sous vide (par l’élimination de l’éthanol) fréquemment, surtout lors de la première quelques heures, parce que le piège a tendance à s’obstruer après la suppression d’une grande quantité d’éthanol à partir de P-IA.
  2. Préparation de la solution de P-IA
    NOTE : Ajouter le polymère très lentement dans le solvant (eau). Il est recommandé de prendre au moins 15 min ajouter le P-IA dans le solvant. Si le solvant est ajouté dans le polymère, le polymère ne serait pas complètement dissoute. Veillez à ne pas générer de bouillonnement explosif de la solution de P-IA. Porter des lunettes de protection lors de la préparation de la solution de P-IA. Le processus de chauffage de la solution de P-IA est essentiel pour dissoudre cristalline P-IA. Il est suggéré (et préférable) pour préparer la solution de P-IA dans une pièce expérimentale relativement propre, si possible.
    1. Dissoudre le P-IA dans l’eau pure à une concentration de poids 0,050 % pour l’expérience de culture de cellules ou une concentration de poids 0,50 % pour la mesure de rhéomètre : par exemple, dissoudre 50 mg de P-IA dans 100 mL d’eau pure pour la culture cellulaire et 500 mg de P-IA dans 100 mL de eau ionisée (DI) pour les mesures de rhéomètre.
    2. Agiter la solution de P-IA pendant 1 h sur la plaque chauffante.
      Remarque : Pour éviter l’ébullition explosif, ne pas chauffer la solution plus de 95 ° C. Ébullition explosive de la solution de polymère à haute température peut générer des brûlures de la peau. Par conséquent, effectuer le chauffage de P-i a très soigneusement et surveiller la température de la solution de P-IA lors du chauffage.
    3. Après que la solution de P-IA a été refroidie à température ambiante, agiter la solution de P-IA à température ambiante pendant 48 h. congé de solution chaude de P-IA sur le réchaud sans chauffage et ensuite le laisser sans agitation à température ambiante pendant 20 à 24 heures pour que les bulles d’air soient non présent dans la solution de P-IA.
  3. Préparation de la solution de réticulation
    1. Rendre la composition de la glutaraldéhyde réticulation solution 1.0 poids % de solution de glutaraldéhyde aqueuse à 25 %, 20.0 % Na2de poids donc4 à l’aide de 99 % > poids pureté et 1.0 % H2SO4. Par exemple, pour 6 ou 12 bien la plaque de culture cellulaire, ajouter 100 µL de solution de glutaraldéhyde, 2 g de sulfate de sodium et 100 µL de l’acide sulfurique dans 10 mL d’eau pure.
  4. Milieux de culture humaine ES/PS cellulaire
    Remarque : Utilisation DMEM/F12 médias médias 6 essentiels et des médias 8 essentiels pour la culture cellulaire.
    1. Renvoyer surgelés 50 X 8 Essential supplement lentement à la solution du jour au lendemain par décongeler dans le réfrigérateur à 4 ° C.
    2. Ajouter une bouteille de 50 X 8 essentiels complément en un flacon de milieu de base 8 essentiels. Séparer les médias en petites parties aliquotes (50 mL chacune) dans des tubes de centrifugation de 100 mL, puis stocker les médias à-20 ° C.

2. P-IA Hydrogel plat préparation

  1. Préparation du film P-IA
    1. Injecter une portion de 1 mL de la solution de P-IA dans un plat TCP de 35 mm et sécher le plat dans un four à 45 ° C pendant 2 jours pour produire un film P-IA dans un banc propre.
  2. Réticulation des plats hydrogel P-IA
    1. Plonger les films P-IA dans une solution aqueuse de réticulation pour 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 et 48 h.
      NOTE : ' P-IA -X' (p. ex., P-IA-12 h) se réfère à un P-IA hydrogel réticulé pour X h (p. ex., 12 h).
    2. Après réticulation, rincer les hydrogels P-IA avec de l’eau pure à la température ambiante et ensuite garder hydrogels dans l’eau pure à la température ambiante dans un banc propre.
    3. Stériliser les hydrogels P-IA par immersion dans une solution d’éthanol 75,0 volume/volume% pendant 1 min, rincez les hydrogels P-IA dans l’eau pure six fois et puis garder les hydrogels P-IA dans l’eau pure jusqu'à ce que les employés pour la culture cellulaire.
  3. Préparation de plats d’hydrogel P-IA greffée avec oligopeptide ou ECM
    1. Activer les hydrogels P-IA par immersion dans 1 mL d’une solution aqueuse contenant 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide chlorhydrate (EDC) et 10 mg/mL, N- hydroxysuccinimide (NHS) pendant 1 h à 37 ° C ou 4 h à 4 ° C.
    2. Rincer les hydrogels P-IA avec 1 mL de phosphate buffered saline (PBS, pH 7,2) 3 fois et y plonger les hydrogels P-IA dans une solution de PBS contenant 1 mL d’oligopeptide (100-1 500 µg/mL) ou ECM (10 à 100 µg/mL) pendant 24 h à 4 ° C.
      Remarque : Les séquences d’oligopeptide et SEGDA utilisés pour la culture de cellules souches est résumées dans le tableau 1.
    3. Après la greffe l’oligopeptide ou ECM, laver les hydrogels P-IA avec de l’eau pure 3 fois.
      Remarque : Les hydrogels P-IA greffés Y µg/ml d’oligopeptide ou ECM (Z) sont ci-après dénommés P-IA -Xh -Z ouX-IA-Ph -Z-Y, où X désigne le temps de réticulation (h), Y indique la concentration de l’oligopeptide ou ECM, et Z indique un oligopeptide différent ou ECM.

3. Culture de cellules d’ES/iPS humain

  1. Méthode de passage et d’entretien des ES humaines indifférenciées et des cellules iPS
    1. Maintenir ES humaine (par exemple, WA09 ou H9) cellules ou iPS humaine (p. ex., HS0077) cellules sur Matrigel essentiel 8 médias dans des plats de 6 cm à l’aide de standard humain ES/iPS cell culture protocoles28,32.
    2. Incuber près-anastomosé humain ES/CSPI avec a 2,0 mg/mL II en milieu DMEM/F-12 à 37 ° C pendant 8 à 10 min, puis rincer les cellules humaines d’ES/iPS deux fois avec les médias DMEM/F12.
    3. Après l’ajout de 2 mL de DMEM/F-12 médias humains récipients de culture de cellules d’ES/iPS, détacher faiblement adhérentes colonies au moyen d’un grattoir de cellules ou de pipetage.
    4. Recueillir les cellules d’ES/iPS humaines dans des tubes de centrifugation de 15 mL et centrifuger des cellules d’ES/iPS humaines à 160 × g pendant 5 min à 37 ° C.
    5. Après centrifugation, ignorer le DMEM/F12 et suspendre les cellules d’ES/iPS humaines dans 1 mL de E8 média et puis compter la densité des cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
    6. Ensemencer les cellules ES/iPS après le réglage de la densité appropriée (1-5 x 104 cellules / cm2 pour passage ou comme indiqué) à nouveau Pétri (P-IA hydrogels greffées avec l’oligopeptide ou ECM).

4. caractérisation de caractérisation de cellules ES humaines/iPS

  1. Évaluation de l’activité de la phosphatase alcaline (PA)
    1. Mesurer l’activité de la phosphatase alcaline (PA) de cellules d’ES/iPS humaines utilisant un marquage direct de phosphatase alcaline standard.
  2. Immunomarquage
    1. Effectuer immunostaining des Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 et Oct3/4 cellules hES et les hanches pour étudier la pluripotence suivant le protocole classique28,32.
    2. Ajouter un volume de 0,5 mL de paraformaldéhyde à 4 % (volume/volume) dans chaque plat bien 24 dans lequel les cellules d’ES/iPS humaines ont été cultivées et par la suite, incuber les plats pendant 15 min à 4 ° C pour fixer les cellules.
    3. Aspirer la solution de paraformaldéhyde dans chaque puits. Ensuite, ajouter 1 mL de PBS / puits et aspirer PBS pour rincer les cellules. Effectuer le processus de rinçage 3 fois.
    4. Permeabilize des membranes cellulaires en ajoutant 0,5 mL de 0,3 % (volume/volume) solution de Triton X 100 en PBS pendant 30 min à température ambiante.
    5. Aspirer la solution de Triton X 100 ajouter 300 µL de 2 % (poids/volume) d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS (tampon de blocage) dans chaque puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
    6. Retirer le tampon de blocage en pipettant également et ajouter par la suite, les anticorps primaires désirés (Oct3/4 (1 : 200), Sox2 (1 : 200), SSEA-4 (1 : 200) et Tra-1-81(1:200) la pipette, voient tableau 2) dans chaque puits, où 1 : 200 indique les anticorps ont été dilués avec du PBS 200-fold et incubé pendant une journée à 4 ° C.
    7. Aspirer la solution de l’anticorps primaire et laver les cellules avec 300 µL de 0,05 % Tween 20 dans une solution de PBS 3 fois à température ambiante.
    8. Ajouter 300 µL d’anticorps secondaires (1 : 200, voir tableau 2), qui sont spécifiques au sous-type IgG primaire, dans une solution BSA 2 % (poids/volume) dans chaque bien et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité.
    9. Laver les cellules avec 300 µL de 0,05 % Tween 20 dans une solution de PBS 3 fois à température de la pièce dans l’obscurité.
    10. Analyser les cellules colorées en microscopie à fluorescence ou en microscopie confocale.
  3. Formation de corps embryoïdes
    1. Étudier la pluripotence des cellules d’ES/iPS humaines par la formation de corps embryoïdes (EB) à passages 10 et 20.
      Remarque : Près de 80 % confluent en plaques 6 puits est suffisante pour l’établissement de formation de l’EB.
    2. Rincez ES humaines ou cellules iPS avec 2 mL de DMEM/F-12 médias deux fois et puis plonger les cellules dans 1,5 mL d’essentiel 6 médias.
    3. Dépecée près de 80 % humain ES ou iPS confluentes à environ 32 utilisation 200 µL conseils. Ensuite, détachez les cellules de la vaisselle à l’aide d’un grattoir de cellules.
    4. Recueillir des cellules d’ES/iPS humaines et le transfert dans un plat de fixation ultra basse 6 puits.
    5. Échangez des 6 médias essentiels de pipetage anciens médias et en ajoutant les supports neufs tous les 2 jours.
      Remarque : La Culture des cellules en suspension pendant 2 semaines à 37 ° C avec 5 % de CO2.
    6. Après l’EBs étaient suspendues homogène dans les médias 6 essentiels, transfert EBs à la culture sur la vaisselle TCP 24 puits recouverts de 0,1 poids % de gélatine et la culture des cellules essentielles 6 médias pendant une semaine supplémentaire.
    7. Colorer les cellules avec des anticorps dirigés contre les marqueurs des cellules dérivées de trois couches de cellules germinales embryonnaires [AFP (endoderme), GFA (ectoderme), β tubuline-III (ectoderme) et SMA (mésoderme)] et d’évaluer les cellules par la méthode immunostaining décrite ci-dessus.
  4. Formation de tératome
    1. Étudier la pluripotence des cellules d’ES/iPS humaines par la formation de tératome à passages 10 et 20.
      Remarque : 5 plats de près de 80 % de confluence en plaques 6 puits sont suffisantes pour la formation de tératome (au moins 3 x 106 cellules sont nécessaires pour les expériences de formation de tératome).
    2. Rincer les cellules avec 2 mL DMEM/F-12 médias deux fois et puis ajouter 1,5 mL DMEM/F-12 supports pour les récipients de culture cellulaire.
    3. Dépecée presque 80 % humain ES ou iPS confluentes à environ 32 par utilisation de 200 µL conseils. Ensuite, détachez les cellules de la vaisselle à l’aide d’un grattoir de cellules.
    4. Recueillir des cellules d’ES/iPS humaines dans un tube de centrifugation de 15 mL et centrifuger les cellules à 160 × g pendant 5 min à 37 ° C.
    5. Après centrifugation, suspendre les granules cellulaires dans 100 µL DMEM/F12 et puis mélanger la cellule pastilles avec 100µl Matrigel (ratio 1:1 volume).
    6. Transférer la suspension cellulaire dans une seringue de refroidissement préalable de-20 ° C. Injecter, au total, au moins 3 × 106 cellules par voie sous-cutanée dans mâle NOD-SCID (clin de œil. CB17 -PrkdaDICS/JNarl) souris (5-8 semaines).
    7. Après 5 à 8 semaines, disséquer les tératomes, difficulté avec la solution de paraformaldéhyde de 4,0 % (poids/volume) et ensuite stocker à 4 ° C.
    8. Fixer le tératome avec paraffine, tranchez les tératomes de paraffine et coloration à l’hématoxyline et éosine (H & E) en utilisant un protocole standard28,32.
      Remarque : Les chercheurs peuvent envoyer tératome fixe tissu à la société et de fixer les tératomes avec paraffine, tranche la paraffine tératomes, détachant l’échantillon avec H & E, qui est généralement utilisée dans le département de pathologie à l’hôpital.
  5. Culture de cellules souches humaines dérivées adipeux (annonces)
    1. Milieux de culture chaude (DMEM contenant 1 % antimycosiques antibiotique et 10 % bovin sérum fœtal (SVF)), 0,25 % de trypsine-EDTA et PBS à 37 ° C dans une eau bain à avant utilisation.
    2. Laver les cellules humaines de ADS de pipetage à 10 mL de PBS dans chaque boîte de Pétri 6 cm où les cellules sont cultivées.
    3. Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA (0,25 %) dans les récipients de culture de 6 cm et incuber la solution à 37 ° C pendant 5 min.
    4. Observer les cellules dans les récipients de culture de 6 cm sous microscope afin de confirmer que les cellules sont détachent.
    5. Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajouter un volume égal de milieux de culture (DMEM contenant des antibiotiques antimycosiques 1 % et 10 % SVF) dans le tube à centrifuger pour neutraliser la trypsine-EDTA.
    6. Centrifuger les cellules à 250 × g pendant 5 min à 37 ° C.
    7. Après centrifugation, jeter le surnageant soigneusement en pipettant également, sans déranger le culot cellulaire.
    8. Remettre en suspension les cellules dans les milieux de culture et des graines puis les cellules à la densité appropriée (5-10 x 103 cellules / cm2 pour passage ou comme indiqué) à nouveau Pétri (P-IA hydrogels greffées avec et sans les oligopeptides et ECM).
  6. Le liquide amniotique humain proviennent de culture cellulaire (AFS)
    1. Réchauffer des supports de culture (DMEM/CMPD 201 (2:3) contenant 20 % sérum fœtal (SVF), 5 ng/mL bFGF et antibiotiques antimycosiques 1 %), 0,25 % de trypsine-EDTA et PBS à 37 ° C dans une eau bain à avant utilisation.
    2. Laver les cellules humaines AFS de pipetage 10 mL de PBS dans chaque boîte de Pétri 6 cm où les cellules sont cultivées.
    3. Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA (0,25 %) dans les récipients de culture de 6 cm et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min.
    4. Observer les cellules sur 6 cm Pétri sous microscope afin de confirmer les cellules sont détachent.
    5. Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et ajouter un volume égal de milieux de culture (DMEM/CMPD 201 (2:3) contenant sérum bovin fœtal (SVF) 20 %, 5 ng/mL bFGF et antibiotiques antimycosiques 1 %) dans le tube à centrifuger pour neutraliser la trypsine-EDTA.
    6. Centrifuger les cellules à 250 × g pendant 5 min à 37 ° C.
    7. Après centrifugation, jeter le surnageant soigneusement sans déranger le culot cellulaire par pipetage.
    8. Remettre en suspension les cellules dans les médias de la culture et des graines puis les cellules à la densité appropriée (5-10 x 103 cellules / cm2 pour passage ou comme indiqué) à nouveau Pétri (P-IA hydrogels greffées avec ou sans oligopeptide et ECM).

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Representative Results

P-IA hydrogels greffés avec oligopeptide dérivé ECM (oligoECM) ou ECM avec des élasticités différentes ont été préparés en suivant le schéma réactionnel, comme on le voit à la Figure 1 a, à l’aide de différents types d’oligoECM (Figure 1 b). Les élasticités de l’hydrogel étaient régies par l’intensité de la réticulation appliquée (temps) (Figure 1). P-IA hydrogels greffées avec oligopeptides dérivés de vitronectine, qui présente un module de stockage de 25,3 kPa (temps de réticulation de 24h), prise en charge de la culture à long terme des iPS humaines et de cellules ES pour plus de 10 à 20 passages. En particulier, P-IA hydrogels greffée avec un segment commun (P-IA-24h-VN1G) ou une double chaîne (P-IA-24h-VN2G) prise en charge de la pluripotence des iPS humaines et de cellules d’ES, qui ont été préparés avec une concentration relativement faible d’oligoECM (200-500 μg/mL) que P-IA-VN1 hydrogels, qui nécessitait à l’aide d’une forte concentration d’oligoECM (> 1000 μg/mL) pour maintenir la pluripotence des homme iPS et ES cellules28,32.

Les cellules ES humaines maintient sur souris embryonnaires fibroblastes (MEFs) ont été déplacés à la culture sur d’autres plats de matériaux (p. ex., Synthemax II) de revêtement enduit synthétisées et P-IA-24h-VN1 hydrogel plats (Figure 2)28. Cellules ES humaines cultivées sur revêtement disponible dans le commerce des plats ont été trouvés pour différencier plus facilement, surtout au bord des colonies (Figure 2 a et 2C), tandis que les cellules ES humaines pourraient maintenir leur pluripotence sur P-IA-24h-VN1-1000 hydrogel plats parce que les cellules différenciées n’a pas peuvent être observés de la morphologie des cellules ES humaines sur P-IA-24h-VN1-1000 hydrogel plats (Figure 2 b et 2d)28.

La pluripotence des ES humaine (Figure 3 a) et de cellules iPS (Figure 3 b) cultivées sur P-IA - 24h hydrogels greffée avec oligoECM (P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000, P-IA-24h-VN2C), ainsi que les classiques vitronectine recombinante ( rVitronectin)-enduit plats, a été évaluée en fonction l’expression des protéines de maker pluripotentes (Nanog, Sox2 et Oct3/4) après que les cellules ont été cultivés sur chaque plat dans des conditions de xeno-sans support 8 essentiels pour 10 passages32. Ces protéines de pluripotence exprimaient satisfaisante sur iPS humaines et ES cellules cultivées sur P-IA hydrogels greffées avec oligoECM, ainsi que sur les plats rVitronectin-enduit dans des conditions sans xeno.

Évaluation de la capacité de différenciation dans les cellules dérivées de trois couches de germe in vitro (EB formation) et in vivo (formation de tératome) est indispensable pour vérifier la pluripotence des ES humains et de cellules iPS après culture sur synthétique biomatériaux. Par conséquent, les cellules ES humaines (Figure 4) et cellules iPS humaines (Figure 5) ont été cultivés sur P-IA-oligoECM hydrogel plats et recombinantes enduit de vitronectine plats pour 10 passages et par la suite, les cellules ont été cultivées en suspension pour former EBs. L’EBs étaient encore cultivés sur enduit de gélatine plats pendant quelques semaines observer la capacité des cellules à se répandre sur les plats (Figure 4 a et 5 a Figure)32. ES humain différenciée (Figure 4 b) et des cellules iPS (Figure 5 b) ont été immunomarquées de protéines provenant de trois couches de germe : alpha-foetoprotéine (AFP, endoderme), actine muscle lisse (SMA, mésoderme) et protéine fibrillaire acide gliale (GFAP ectoderme)32. Les iPS humain et les cellules ES trouvées à se différencier en cellules provenant de chacune des trois couches germe, ce qui indique une autre vérification de la pluripotence des iPS humaines et de cellules d’ES, même après culture sur P-IA hydrogels greffées avec oligoECM en xeno-free conditions pour le long terme (passage > 10 passages).

La capacité de différenciation des cellules ES humaines dans les cellules provenaient de trois couches de germe en vivo (tératome formation test) a également été évaluée. Les cellules ES humaines, qui ont été cultivés sur P-IA-VN1-1000 (Figure 6 a) et P-IA-VN2C-1000 (Figure 6 b) dans des conditions de culture libre xeno pour 10 passages, ont été injectées par voie sous-cutanée dans de souris SCID-NOD32. Les tératomes ont été isolés chez les souris, et des sections de tissu tératome étaient fixes et colorées avec H & E (Figure 6 a et 6 b)32. Les tératomes affichent l’existence de cellules provenant de chacune des trois couches germinales : (ectoderme, mésoderme (cartilage, Figure 6 a(c) et 6B(c)) et endoderme (épithélium intestinal, Figure 6 a(b) et 6B(b)) neuroépithélium, Figure 6 a(d) ; épithélium pigmentaire rétinien, Figure 6 b(d)). Ces résultats suggèrent que les cellules ES humaines cultivées sur P-IA-24h-VN1-1000 et P-IA-24h-VN2C-1000 dans des conditions sans xeno pour 10 passages peut se différencient en cellules originaires de trois couches de germe, ce qui indique que leur pluripotence est maintenue vivo.

Les cellules humaines AFS ont été cultivés aussi non modifié P-IA hydrogel, P-IA-oligoECM hydrogel et plats TCP dans les médias de l’expansion. La figure 7 illustre les morphologies des cellules humaines de AFS cultivées après quatre jours de culture en IV-P et P-IA-oligoECM hydrogel plats avec des élasticités (E') de 12,2 (temps de réticulation = 6 h), 18,3 (temps de réticulation = 12 h), 25,3 (temps de réticulation = 24 h) et 30,4 kPa (temps de réticulation = 48 h) en utilisant une concentration d’oligoECM de 0 ou 50 μg/mL ainsi que TCP plats avec 3-12 GPa de rigidité30.

Les cellules humaines AFS ne pourraient pas proliférer sur la vaisselle d’hydrogel P-IA avec ou sans oligoECM lorsque la rigidité des P-IA hydrogels était de moins de 11 kPa (PV - 2h, PV-2h-Y, PV - 4h et 4h-PV-Y), alors que les cellules humaines AFS pourraient proliférer avec ou sans oligoECM quand E' était supérieur à 12 kPa, à l’exception de la vaisselle d’hydrogel H-IA - 6 p et PV-IA-6 h-COL1. P-IA - 6h et P-IA-6h-COL1 ne semblent ne pas être favorable pour la culture de cellules humaines de AFS parce que les biomatériaux de culture cellulaire doux stopper la progression de cycle cellulaire30.

Ces résultats suggèrent que les plats hydrogel P-IA constituent un matériau optimal pour la culture de cellules souches long terme et maintiennent la pluripotence des cellules souches par sélection de rigidité spécifique et oligoECM, ainsi que la concentration optimale de réaction d’oligoECM (masse surfacique d’oligoECM).

Figure 1
Figure 1 : préparation des hydrogels P-IA greffées avec oligoECM ou ECM. (A) schéma de la réaction pour P-IA hydrogels greffées avec ECM et oligopeptide dérivé ECM (oligoECM)29. Copyright 2015. Adapté avec la permission de la Royal Society of Chemistry. (B) Design et la séquence des oligopeptides greffés sur P-IA hydrogels. Seule chaîne oligopeptides (P-IA-BSP, VN1-IA-P et P-IA-HBP1), unique oligopeptides de chaîne avec un segment commun (P-IA-VN1G), et deux chaînes (P-IA-VN2C et P-IA-HBP2C) et ECM (P-IA-ECM) se sont greffés sur P-IA hydrogels32. Adapté sous une licence Creative Commons. (C) hydrogels de rigidité du P-IV préparés par différentes périodes de réticulation29. Copyright 2015. Adapté avec la permission de la Royal Society of Chemistry. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : comparaison des cellules ES humaines cultures sur P-IA-24h-VN1 hydrogels et plats de revêtement commercialement disponible. Morphologie des cellules ES humaines (WA09) cultivé sur revêtement disponible dans le commerce de plats (a, b) et P-IA-24h-VN1-1000 (c, d) au passage 1 lorsque les cellules ES humaines sont transférées à la culture sur fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) dans culture en plats de revêtement disponible dans le commerce ou PVA-24h-VN1-1000 plats. Flèches rouges montrent les cellules différenciées de ES humaines. Les barres d’échelle indiquent 50 µm (a, b) et 100 µm (c et d),28. Adapté sous une licence Creative Commons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : caractérisation de la pluripotence des humains ES et iPS cellules sur P-IA hydrogels greffés avec des conceptions différentes oligopeptide. (A) Expression de protéines pluripotence Sox2 Nanog (rouge), (vert) et Oct3/4 (vert) sur les cellules humaines d’ES (H9) analysés par immunomarquage avec double coloration avec Hoechest33342 pour le marquage nucléaire (bleu) après mise en culture sur (un) P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24h-VN1G-1000 et (c), P-IA-24h-VN2C-1000 hydrogels et sur la vitronectine recombinante (d) (rVitronectin)-enduit plats dans des conditions sans xeno pour 10 passages. (B) Expression de protéines de pluripotence Nanog (rouge), Sox2 (vert) et Oct3/4 (vert) sur les cellules iPS humaines analysés par immunomarquage avec double coloration avec Hoechest33342 pour le marquage nucléaire (bleu) après mise en culture sur (a) P-IA-24h-VN1-1000 hydrogel, hydrogel (b), P-IA-24h-VN2C-1000 et (c) recombinante vitronectine (rVitronectin)-hydrogels enduit plats dans des conditions sans xeno pour 10 passages32. Les barres d’échelle indiquent 50 µm. adapté sous une licence Creative Commons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : caractérisation de la capacité de différenciation des ES humain cellules sur P-IA hydrogels greffés avec des conceptions différentes oligopeptide. (A) la morphologie des cellules de l’EBs de différencier les cellules ES (H9) humaines après culture sur (a) P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24h-VN1G-1000 et (c), P-IA-24h-VN2C-1000 hydrogels et recombinant (d) la vitronectine (rVitronectin)-enduit plats dans des conditions sans xeno pour 10 passages. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. (B) l’Expression d’une protéine de l’ectoderme (GFAP, rouge), les protéines mésoderme (SMA, vert) et protéine endoderme (AFP, vert) dans les cellules humaines d’ES (H9) évalué par immunomarquage avec double coloration avec Hoechest33342 pour nucléaire étiquetage (bleu) après mise en culture sur P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000 et P-IA-24h-VN2C-1000 hydrogels et sur la vitronectine recombinante (rVitronectin)-enduit plats dans des conditions sans xeno pour 10 passages32. Les barres d’échelle indiquent 50 µm. adapté sous une licence Creative Commons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : caractérisation de la capacité de différenciation des iPS humain cellules sur P-IA hydrogels greffés avec des conceptions différentes oligopeptide. (A) la morphologie des cellules de l’EBs différenciés de cellules iPS humaines (HPS0077) après la mise en culture sur (a) P-IA-24h-VN1-1000 hydrogels et (b), P-IA-24h-VN2C-1000 hydrogels vitronectine recombinante (c) (rVitronectin)- plats enrobés dans des conditions sans xeno pour 10 passages. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. (B) l’Expression d’une protéine de l’ectoderme (GFAP, rouge), les protéines mésoderme (SMA, vert) et protéine endoderme (AFP, vert) dans les cellules iPS humaines (HPS0077) analysés par immunomarquage avec double coloration avec Hoechest33342 pour nucléaire étiquetage (bleu) après mise en culture sur (a) P-IA-24h-VN1-1000 hydrogels et (b), P-IA-24h-VN2C-1000 hydrogels vitronectine recombinante (c) (rVitronectin)-enduit plats dans des conditions sans xeno pour 10 passages32. Les barres d’échelle indiquent 50 µm. adapté sous une licence Creative Commons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Caractérisation de la capacité de différenciation des ES humaine (H9) cellules in vivo après mise en culture sur des hydrogels P-IA-24h-VN1 et P-IA-24h-VN2C. (A) (une) photo d’un tératome par injection avec ES humain cellules après mise en culture sur P-IA-24h-VN1-1000 hydrogels dans des conditions de culture cellulaire xeno-libre après 10 passages. Les tissus dont l’épithélium intestinal (b) (endoderme), (c) cartilage (mésoderme) et (d) le neuroépithélium (ectoderme) peut être observé. (B) (une) photo d’un tératome par injection avec ES humain cellules après mise en culture sur P-IA-24h-VN2C-1000 hydrogels dans des conditions de culture cellulaire xeno-libre après 10 passages. Les tissus dont l’épithélium intestinal (b) (endoderme), (c) cartilage (mésoderme) et (d) l’épithélium pigmentaire rétinien (ectoderme) peut être observé à32. Les barres d’échelle indiquent 100 µm. adapté sous une licence Creative Commons. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : morphologie des cellules AFS humaines cultivées sur des plats TCP et immobilisés avec ou sans dérivés ECM oligopeptides après 4 jours de culture des plats de hydrogel P-IA. (A) la morphologie des cellules humaines de AFS sur la vaisselle TCP. (B) la morphologie de la SRAPA humain cellules sur P-IA - 6 h et P-IA-6 h -Z hydrogel plats (P-IA - 6 h, P-IA-6 h-COL1-50, P-IA-6 h-FN1-50, P-IA-6 h-VN1-50, P-IA-6 h-HBP1-50 et P-IA-6 h-cRGD-50). (C) la morphologie des hAFCs sur P-IA - 12 h et P-IA-12 h -Z hydrogel plats (P-IA - 12 h, P-IA-12 h-COL1-50, P-IA-12 h-FN1-50, P-IA-12 h-VN1-50, P-IA-12 h-HBP1-50 et P-IA-12 h-cRGD-50). (D) la morphologie de la SRAPA humain cellules sur P-IA - 24 h et P-IA-24 h -Z hydrogel plats (P-IA - 24 h, P-IA-24h-COL1-50, P-IA-24h-FN1-50, P-IA-24h-VN1-50, P-IA-24h-HBP1-50 et P-IA-24h-cRGD-50). Morphologie (E) de la SRAPA humain cellules sur P-IA - 48 h et P-IA-48 h -Z hydrogel plats (P-IA - 48 h, P-IA-48 h-COL1-50, P-IA-48 h-FN1-50, P-IA-48 h-VN1-50, P-IA-48 h-HBP1-50 et P-IA-48 h-cRGD-50). Les barres d’échelle indiquent 100 μm30. Copyright 2017. Adapté avec la permission de la Royal Society of Chemistry. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Nom de matériel / équipement Abréviation
GTPGPQGIAGQRGVV COL1
GACRGDCLGA RGD cyclique (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectine rVN
Fibronectine FN

Tableau 1 : Séquences dérivées ECM oligopeptide et ECM utilisée dans cette étude.

Anticorps Concentration (taux de dilution)
Nanog 1 : 200
SSEA4 1 : 200
OCT3/4 1 : 200
Sox2 1 : 200
Actine Muscle lisse 1 : 200
(Α-SMA) 1 : 200
AFP 1 : 200
GFAP 1 : 200
Alexa Fluor 555 – conjugués Goat anti-Mouse 1 : 200

Tableau 2 : Anticorps utilisés pour immunostaining dans cette étude.

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Discussion

P-IA-oligoECM et P-IA-ECM hydrogels avec raideur variable ont été développées pour l’expansion à long terme de ES humain et CSPi conservant leur pluripotence pour plus de dix passages dans des conditions sans xeno, ainsi que pour la culture de cellules humaines de l’AFS, cellules d’annonces, et les cellules souches hématopoïétiques25,28,32. P-IA hydrogels immobilisées avec oligoECM sont un excellent candidat pour les matériaux de culture cellulaire pour étudier l’effet des matières de culture cellulaire sur le sort de la différenciation et la prolifération de divers types de cellules souches comme cellules primaires et cellules cancéreuses.

P-IA solution devrait être transparente, lorsque la solution de P-IA est castée sur la vaisselle. Le temps de réticulation décide de l’intensité de la réticulation des hydrogels P-IA. 24h de réticulation des hydrogels P-IA produit des hydrogels optimales pour la culture de cellules humaine ES/iPS. Les oligopeptides et ECMs peuvent être greffés sur P-IA hydrogels utilisant ce protocole, où les oligopeptides et ECMs ont des groupes aminés libres25,28,29,30,31, 32. la masse surfacique des oligopeptides ou SEGDA peut être détectée par des mesures de spectroscopie (XPS) de photoélectrons de rayons x, bien que XPS ne peut présenter une valeur absolue de la masse surfacique, mais l’existence des oligopeptides ou ECM peut être en toute sécurité analysé.

P-IA hydrogels avec et sans les oligopeptides greffées ou SEGDA peuvent être préparés, qui ont le module de stockage de 3 à 30 kPa, fonction du temps de réticulation. Il est plutôt difficile de préparer des hydrogels P-IA ayant moins module de rangement à 3 kPa et de module de stockage que 30 kPa25,28,29,30,31,32. Il s’agit de la limitation de la présente méthode de préparation d’hydrogel de réticulation chimique des hydrogels P-IA. Toutefois, le présent protocole offre une autre option des hydrogels ayant une élasticité différente, qui peut prendre en charge de la culture de cellules primaires, cellules cancéreuses ou cellules souches notamment ES humains et cellules iPS, mais n’est pas faite de polyacrylamide. En particulier, ES humains et cellules iPS ne peuvent proliférer sur polyacrylamide hydrogels, mais peuvent proliférer sur P-IA hydrogels tel qu’illustré dans la Figure 2, Figure 3, Figure 4, Figure 5et Figure 6. P-IA-24h-VN1 hydrogels soutenait, en effet, culture cellulaire humaine ES mieux que les plats disponibles dans le commerce de revêtement (Figure 2). Par conséquent, P-IA hydrogels sont préférables pour la culture de ES humains et de cellules iPS.

Il serait intéressant d’étudier l’élasticité optimale des hydrogels où ES humain et les cellules iPS sont différenciés en lignées spécifiques des cellules comme les cardiomyocytes35, de l’épithélium pigmentaire rétinien36, de cellules β6et TH + cellules6 pour le développement futur de la médecine régénérative.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été partiellement prises en charge par le ministère de la Science et technologie, Taiwan sous concession numéros 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 et 104-2221-E-008-107-MY3. Cette recherche a été également pris en charge par le projet de l’hôpital de Landseed de Taiwan (NCU-LSH-105-A-001). Une subvention pour la recherche scientifique (numéro 15K 06591) depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie du Japon est également reconnue. A. Higuchi aimerait remercier pour le programme de partenariat scientifique International (ISPP-0062) Vice Rectorat pour les études supérieures et postdoctorales, Université du Roi Saoud, Riyadh 11451, Royaume d’Arabie saoudite.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

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References

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Bio-ingénierie numéro 132 Hydrogel induite par cellule souche pluripotente cellule souche embryonnaire élasticité culture cellulaire oligopeptide modification de surface nanosegment
Culture de cellules souches pluripotentes humaines sur Polyvinyl alcool-Co-itaconique acides Hydrogels avec raideur variable dans des Conditions sans Xeno
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Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

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