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Bioengineering

Cultura de células-tronco pluripotentes humanas em polivinil álcool-Co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes condições Xeno-livre

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

Um protocolo é apresentado para preparar polivinil álcool-co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes, que foram enxertados com e sem oligopeptídeos, para investigar o efeito da rigidez dos biomateriais na diferenciação e proliferação de células-tronco. A rigidez do hidrogel era controlada pelo tempo de reticulação.

Abstract

O efeito de sinais físicos, como a rigidez dos biomateriais de proliferação e diferenciação de células-tronco, foi investigado por vários pesquisadores. No entanto, a maioria destes investigadores utilizaram hidrogel de poliacrilamida para cultura de células-tronco em seus estudos. Portanto, seus resultados são controversos, porque esses resultados podem originar as especificidades da poliacrilamida e não do sinal físico (rigidez) dos biomateriais. Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de hidrogel, que não é baseados em poliacrilamida, onde vários tronco, células, incluindo células-tronco embrionárias humanas (ES) e humanas pluripotentes induzidas (iPS) células, podem ser cultivadas. Hidrogel com rigidez diferentes foram preparados a partir bioinert polivinil álcool-co-itacónico ácido (P-IA), com rigidez controlada pelo grau de reticulação, alterando o tempo de reticulação. O hidrogel de P-IA enxertado com e sem oligopeptídeos derivados de matriz extracelular foram investigados como uma futura plataforma para cultura de células-tronco e diferenciação. A cultura e a passagem de células tronco de líquido amniótico, células-tronco derivadas adiposo, células ES humanas e células iPS humana é descrito em detalhes aqui. O hidrogel de oligopeptídeos P-IA mostrou performances superiores, que foram induzidas por suas propriedades de rigidez. Este protocolo informa a síntese do biomaterial, sua manipulação de superfície, juntamente com controlar as propriedades de rigidez e, finalmente, seu impacto sobre o destino de células-tronco usando as condições de cultura xeno-livre. Com base em estudos recentes, tais substratos modificados podem atuar como futuras plataformas para apoiar e dirigir o destino de linha de células-tronco vários elos diferentes; e mais, regenerar e restaurar as funções do tecido ou órgão perdido.

Introduction

O destino da diferenciação de células-tronco em uma linhagem específica de células e a longo prazo proliferação de células-tronco, células especialmente humano pluripotentes induzidas (iPS) e células-tronco embrionárias humanas (ES), é conhecido por ser reguladas por inibidores, fatores de crescimento, e / ou pequenas moléculas bioativas em meios de cultura. Recentemente, as pistas físicas dos biomateriais, particularmente a rigidez dos biomateriais de cultura de células, têm sido reconhecidas para ser um importante fator para orientar o destino das células-tronco proliferação e diferenciação1,2, 3,4,5,6. Portanto, vários pesquisadores começaram a investigar o destino das células-tronco, que são cultivadas em hidrogel, na diferenciação, principalmente usando hidrogel de poliacrilamida com variação de rigidez.

A rigidez dos biomateriais pode controlar aderências focais, morfologia celular, fenótipo celular e adesão de células-tronco, especialmente em duas dimensões (2D) cultivo1,2,3,5. Mechano-detecção de biomateriais por células-tronco é geralmente controlada pela adesão focal sinalização via receptores integrinas. NMMIIA, miosina nonmuscle contratilidade IIA-dependente do citoesqueleto de actina desempenha um papel crítico no processo de mechanosensing das células-tronco em 2-D célula cultivo sistemas3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler e seus colegas desenvolveram uma noção interessante que células-tronco adultas, como as células-tronco (BMS) medula óssea cultivadas em biomateriais de cultura de células com uma rigidez semelhante ao de tecidos específicos, tendem a se diferenciar em células originadas-se tecidos específicos5. Células BMS incubadas em hidrogel de poliacrilamida macio 2-D, revestido com colágeno tipo I (com uma rigidez comparável de tecidos cerebrais) em meios de expansão foram induzidas espontaneamente para diferenciar em linhagens de neurônio precoce, Considerando que as células BMS cultivadas na Hidrogel com uma rigidez semelhante do músculo ou tecidos ósseos colágenas foram encontrados para induzir a diferenciação em linhagens iniciais de miócitos e osteoblastos, respectivamente, em hidrogel de poliacrilamida de 2-D3,5. Muitos pesquisadores têm investigado o destino de células-tronco de diferenciação cultivadas na poliacrilamida hidrogel imobilizada com colágeno tipo I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. no entanto, deve-se mencionar que alguns contraditório relatórios1,18,22,23,24 existem para a conhecida ideia sugerida por Engler et al. 5 é porque ideia5 do Engler foi desenvolvido exclusivamente em hidrogel de poliacrilamida e seus resultados têm originado de características específicas do biomaterial (poliacrilamida) e não unicamente do cue físico (rigidez) de o biomaterial. Portanto, é importante desenvolver um outro tipo de hidrogel, dos quais a rigidez pode ser controlada por reticulação do hidrogel. Para este efeito, foram desenvolvidas bioinert hidrogel, que foram preparados de polivinil álcool-co-itacónico ácido (P-IA), com uma rigidez diferente, que foi controlada pelo grau de reticulação com uma mudança reticulação tempo25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. as células-tronco podem ser cultivadas em hidrogel de P-IA nonmodified, bem como P-IA hidrogel enxertado com matrizes extracelulares (ECMs) e oligopeptídeos. Em um estudo anterior25, hematopoiéticas células estaminais humanas (hHSCs) do sangue do cordão umbilical foram cultivadas sobre P-IA hidrogel com valores de rigidez diferentes que variam de um kPa 3 módulo de armazenamento 30 kPa onde fibronectina ou um oligopeptídeos derivados fibronectina (CS1, EILDVPST) foi enxertada o hidrogel P-IA. Alta ex vivo expansão dobra de hHSCs foi observada no hidrogel P-IA enxertado com CS1 ou fibronectina, que exibido um intermediário rigidez variando de 12 kPa a 30 kPa25.

IPS de humana e células ES não podem ser cultivadas na cultura de tecidos convencionais poliestireno (TCP) pratos33,34 porque ES humano e células iPS requerem ligação específica para ECMs, tais como vitronectina ou laminina para manter sua pluripotência durante a cultura a longo prazo. Portanto, várias estruturas de oligopeptídeos-enxertados P-IA hidrogel com características de rigidez ideal foram projetadas e preparadas em formações de uma cadeia única, uma única cadeia com um segmento comum, uma cadeia dupla com um segmento comum e um tipo ramificado Cadeia de32. Oligopeptídeos sequências foram selecionadas entre domínios de integrina e glicosaminoglicano-vinculação de ECMs. O hidrogel de P-IA enxertado com oligopeptídeos derivados vitronectina com uma dupla cadeia ou segmento comum, que tem um módulo de armazenamento em aproximadamente 25 kPa, com suporte a cultura a longo prazo do ES humano e células iPS para mais de 12 passagens sob livre de xeno e química condições definidas32. O segmento comum e corrente dupla com moléculas de adesão celular sobre o hidrogel facilitaram a proliferação e células de pluripotência humana ES e iPS32. Aqui, um protocolo para a preparação de P-IA hidrogel (com um módulo de armazenamento de 10 kPa a 30 kPa, que foi medido sob condições de chuva no ar) enxertadas com e sem oligopeptídeos ou ECMs é descrito. Como a cultura e a passagem de várias células-tronco (incluindo células tronco de líquido amniótico, células-tronco derivadas adiposo, células ES humanas e células iPS de humanos) é mostrado.

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Protocol

As experiências neste estudo foram aprovadas pelos comités de ética do Hospital Landseed Formosa (IRB-13-05) e a Universidade Central Nacional. Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com os regulamentos e diretrizes governamentais e institucionais relevantes e aplicáveis durante este estudo.

1. solução e preparação de meios de comunicação

  1. Purificação do polímero
    1. Purificar o P-IA com um grupo ácido carboxílico com um grau de hidrólise de > 96,5% lavando P-IA com o etanol. Coloque 20 g de P-IA em 200 mL de etanol num copo de Erlenmeyer de 500 mL e agitar um agitador magnético para 24-30 h troca o etanol com etanol fresco cada 8-10 h.
    2. Remova P-IA o etanol por filtração usando um funil de Büchner.
    3. P-IA seco por secagem a vácuo à temperatura ambiente por 24 h.
      Nota: Recomenda-se limpar a armadilha no sistema de secagem a vácuo (com a remoção do etanol) com frequência, especialmente durante a inicial de algumas horas, porque a armadilha tende a ficar obstruídos após a remoção de uma grande quantidade de etanol a partir de P-ia
  2. Preparação da solução P-IA
    Nota: Adicione o polímero muito lentamente para o solvente (água). É recomendável levar pelo menos 15 min para adicionar o P-IA para o solvente. Se o solvente é adicionado para o polímero, o polímero não iria ser dissolvido completamente. Tenha cuidado para não gerar ebulição explosiva da solução P-IA. Use óculos de proteção durante a preparação da solução P-IA. O processo de aquecimento da solução P-IA é essencial para dissolver o P-ia cristalino É sugerido (e preferível) para preparar a solução de P-IA em uma sala experimental relativamente limpo, se possível.
    1. Dissolver o P-IA em água pura a uma concentração de peso 0,050% para o experimento de cultivo celular ou uma concentração de peso 0,50% para a medição de rheometer: por exemplo, dissolver 50 mg de P-IA em 100 mL de água pura para cultura de células e 500 mg de P-IA em 100 mL de água ionizada (DI) para as medições de rheometer.
    2. Agite a solução de P-IA por 1h na chapa quente.
      Nota: Para evitar a ebulição explosiva, não aqueça a solução acima de 95 ° C. Explosivo de ebulição da solução de polímero em alta temperatura, pode provocar queimaduras na pele. Portanto, realizar o aquecimento do P-i muito cuidadosamente e monitorar a temperatura da solução P-IA durante o aquecimento.
    3. Quando a solução de P-IA foi arrefecida à temperatura ambiente, agitar a solução de P-IA em temperatura ambiente por 48 h. solução de P-IA deixar quente na chapa quente sem aquecimento e depois deixá-lo sem agitação à temperatura de 20-24 h assegurar que as bolhas de ar Não presente na solução P-IA.
  3. Preparação da solução de reticulação
    1. Fazer a composição da reticulação solução 1.0 peso % de glutaraldeído da solução aquosa glutaraldeído 25%, peso de 20,0% Na2então4 usando 99% > pureza e 1.0% H2de peso então4. Por exemplo, para um 6 ou 12 bem, placa de cultura de células, adicionar 100 µ l de solução de glutaraldeído, 2 g de sulfato de sódio e 100 µ l de ácido sulfúrico em 10 mL de água pura.
  4. Meios de cultura de células ES/PS humano
    Nota: Uso DMEM/F12 mídia mídia 6 essencial e mídia 8 essenciais para a cultura de células.
    1. Retorno congelado 50 suplemento essencial x8 lentamente à solução durante a noite pelo degelo na geladeira a 4 ° C.
    2. Adicione uma garrafa de 50 suplemento essencial 8 X dentro de um frasco de mídia basal 8 essenciais. Separar os meios de comunicação em pequenas alíquotas (50ml cada) em tubos de centrifugação de 100 mL e, em seguida, armazenar a mídia a-20 ° C.

2. P-IA Hydrogel prato preparação

  1. Preparação de filme P-IA
    1. Injectar uma alíquota de 1 mL da solução de P-IA por um prato TCP de 35 mm e o prato em um forno de 45 ° C por 2 dias para produzir um filme P-IA de uma bancada limpa a seco.
  2. Reticulação dos pratos P-IA hidrogel
    1. Mergulhe os filmes P-IA em uma solução aquosa de reticulação para 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 e 48 h.
      Nota: ' P-IA -X' (por exemplo, P-IA-12 h) refere-se a um reticulado de hidrogel P-IA para h X (por exemplo, 12 h).
    2. Após a reticulação, enxágue o hidrogel P-IA com água pura, à temperatura ambiente e ficar com hidrogel em água pura, à temperatura ambiente em uma bancada limpa.
    3. Esterilizar o hidrogel P-IA por imersão em uma solução de etanol 75,0 volume/volume% por 1 min, enxaguar o hidrogel P-IA em água pura seis vezes e depois manter o hidrogel P-IA em água pura até utilizado para cultivo de células.
  3. Preparação de pratos de hidrogel P-IA enxertado com oligopeptídeos ou ECM
    1. Ativar o hidrogel P-IA através de imersão em 1 mL de solução aquosa contendo 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide cloridrato (EDC) e 10 mg/mL de N- Hidroxisuccinimida (NHS) para 1 h a 37 ° C ou 4 h a 4 ° C.
    2. Enxágue o hidrogel P-IA com 1 mL de fosfato tampão salino (PBS, pH 7,2) 3 vezes e mergulhe o hidrogel P-IA em uma solução de PBS contendo 1 mL de oligopeptídeos (100-1.500 µ g/mL) ou ECM (10-100 µ g/mL) por 24 h a 4 ° C.
      Nota: As sequências de oligopeptídeos e ECMs usados para cultura de células-tronco estão resumidos na tabela 1.
    3. Após a enxertia a oligopeptídeos ou ECM, lave o P-IA hidrogel com água pura 3 vezes.
      Nota: O hidrogel P-IA enxertado com Y µ g/mL de oligopeptídeos ou ECM (Z) é adiante designados P-IA -Xh -Z ouP-IA-Xh -Z-Y, onde X refere-se a tempo de reticulação (h), Y indica a concentração dos oligopeptídeos ou ECM, e Z indica uma diferente oligopeptídeos ou ECM.

3. cultura de pilha humana ES/iPS

  1. Método de passagem e de manutenção do ES humano indiferenciadas e células iPS
    1. Manter ES humanas (por exemplo, WA09 ou H9) células ou iPS humana (por exemplo, HS0077) células na Matrigel em media 8 essencial em pratos de 6cm, usando o padrão humano ES/iPS celular cultura protocolos28,32.
    2. Incubar as células humanas de ES/iPS perto confluente com dispase de 2,0 mg/mL II em mídia DMEM/F-12 a 37 ° C por 8-10 min e depois enxaguar células humanas de ES/iPS duas vezes com mídia DMEM/F12.
    3. Após a adição de 2 mL de DMEM/F-12 mídia para pratos de cultura de células ES/iPS humanas, desanexar fracamente aderentes colônias com uma espátula de célula ou pipetando.
    4. Coletar as células humanas de ES/iPS em tubos de centrifugação de 15 mL e centrifugar células humanas de ES/iPS em 160 × g por 5 min a 37 ° C.
    5. Após a centrifugação, descartar o DMEM/F12 e suspender as células humanas de ES/iPS em 1 mL de mídia E8 e então contar a densidade celular usando um contador de célula.
    6. Inocule as células ES/iPS após o ajuste de densidade adequada (1-5 x 104 células por cm2 para passagem ou como indicado) em novos pratos de cultura (P-IA hidrogel enxertado com os oligopeptídeos ou ECM).

4. Caracterização da caracterização de célula humana ES/iPS

  1. Avaliação da atividade da fosfatase alcalina (AP)
    1. Medir a atividade da fosfatase alcalina (AP) de células humanas de ES/iPS usando uma fosfatase alcalina padrão de coloração ao vivo.
  2. Immunostaining
    1. Execute imunocoloração de Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 e Oct3/4 em células hES e quadris para investigar pluripotência seguindo o protocolo convencional28,32.
    2. Adicione um volume de 0,5 mL de paraformaldeído 4% (volumétrica) em cada prato bem 24 em que as células ES/iPS humanas foram cultivadas, em posteriormente, incubam a louça por 15 min a 4 ° C para reparar as células.
    3. Aspire a solução de paraformaldeído de cada poço. Em seguida, adicionar 1 mL de PBS por bem e Aspire PBS para lavar as células. Execute o processo de lavagem 3 vezes.
    4. Permeabilize das membranas celulares, adicionando 0,5 mL de 0,3% (volume/volume) de solução de Triton X 100 em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
    5. Aspirar a solução Triton X 100 e adicionar 300 µ l de 2% (peso/volume) albumina de soro bovino (BSA) em PBS (tampão de bloqueio) em cada poço e incube por 30 min à temperatura ambiente.
    6. Retire o tampão de bloqueio por pipetagem e posteriormente, adicionar os anticorpos primários desejados (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) e Tra-1-81(1:200) com uma pipeta, ver tabela 2) em cada poço, onde 1: 200 indica que os anticorpos foram diluídos com PBS 200-fold e incubados por um dia a 4 ° C.
    7. Aspirar a solução de anticorpo primário e lavam-se as células com 300 µ l de 0,05% Tween 20 em solução de PBS 3 vezes à temperatura ambiente.
    8. Adicione 300 µ l de anticorpos secundários (1: 200, ver tabela 2), que são específicos para o principal subtipo de IgG, em solução a 2% (peso/volume) BSA em cada bem e incubar por 1h à temperatura ambiente no escuro.
    9. Lavar as células com 300 µ l de 0,05% Tween 20 em solução de PBS 3 vezes à temperatura ambiente no escuro.
    10. Analise as células coradas por microscopia de fluorescência ou microscopia confocal.
  3. Formação do corpo do embryoid
    1. Investiga a pluripotência das células humanas ES/iPS pela formação do corpo do embryoid (EB) em passagens de 10 e 20.
      Nota: Perto de 80% confluência em placas boas 6 é suficiente para a preparação de formação de EB.
    2. Enxágue ES humano ou células iPS com 2 mL de DMEM/F-12 mídia duas vezes e em seguida, mergulhe as células em 1,5 mL de mídia essencial 6.
    3. Corte perto de 80% humano ES ou iPS confluentes em aproximadamente 32 pedaços usando 200 µ l dicas. Em seguida, separe as células desde os pratos usando um raspador de célula.
    4. Colete células humanas ES/iPS e transferência em um prato de fixação ultralow 6-poços.
    5. Troca de 6 mídia essencial pipetagem mídias antigas e adicionando mídia fresca cada 2 dias.
      Nota: Cultura de células em suspensão por 2 semanas a 37 ° C com 5% de CO2.
    6. Depois o EBs homogênea foram suspensos em meios essenciais 6, transferir EBs para cultura em pratos TCP 24-poço revestidos com gelatina de % peso 0.1 e cultura de células em mídia 6 essencial para mais uma semana.
    7. Manchar as células com anticorpos contra marcadores de células derivadas de três camadas embrionárias germline [AFP (endoderme), GFA (ectoderme), β (ectoderme) III-tubulina e SMA (mesoderme)] e avaliar as células pelo método de imunocoloração descrito acima.
  4. Formação de teratoma
    1. Investiga a pluripotência das células humanas ES/iPS por formação de teratoma em passagens de 10 e 20.
      Nota: 5 pratos de perto de 80% de confluência em placas 6 boas são suficientes para a formação de teratoma (pelo menos 3 x 106 células são necessárias para as experiências de formação de teratoma).
    2. Enxagúe as células com 2 mL DMEM/F-12 mídia duas vezes e em seguida, adicionar 1,5 mL DMEM/F-12 meios de comunicação para os pratos de cultura de células.
    3. Corte quase 80% humano ES ou iPS confluentes em cerca de 32 peças por uso de 200 µ l dicas. Em seguida, separe as células desde os pratos usando um raspador de célula.
    4. Coletar células humanas ES/iPS em um tubo de centrifugação 15 mL e centrifugar as células a 160 × g por 5 min a 37 ° C.
    5. Após a centrifugação, suspender as pelotas de célula em 100 µ l DMEM/F12 e então misture a célula pelotas com 100 µ l Matrigel (relação de volume de 1:1).
    6. Transferi a suspensão de células em uma seringa pre-cooled de-20 ° C. Injetar, no total, pelo menos 3 × 106 células por via subcutânea no masculino NOD-SCID (assentimento. CB17 -Prkda/JNarl descid) ratos (5-8 semanas).
    7. Depois de 5-8 semanas, dissecar os teratomas, corrigir com solução de paraformaldeído 4,0% (peso/volume) e em seguida armazenar a 4 ° C.
    8. Corrigir o teratoma com parafina, Fatie os teratomas parafina e manchar com hematoxilina e eosina (H & E) usando um protocolo padrão de28,32.
      Nota: Pesquisadores podem enviar tecido teratoma fixo para a empresa para corrigir os teratomas com parafina, os teratomas fatia a parafina e mancha a amostra com H & E, que normalmente é usada no departamento de patologia em hospitais.
  5. Cultura de células tronco adiposo-derivado humano (anúncios)
    1. Meios de cultura quente (DMEM contendo 1% antimicótico antibiótico e 10% fetal de soro bovino (FBS)), 0,25% de tripsina-EDTA e PBS a 37 ° C em um antes do banho de água de usar.
    2. Lave células humanas de anúncios por pipetagem 10 mL de PBS em cada prato de 6 cm de cultura onde as células são cultivadas.
    3. Adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA (0,25%) para os pratos de cultura de 6 cm e incubar a solução a 37 ° C por 5 min.
    4. Observe as células os pratos de cultura de 6 cm sob microscopia para confirmar que as células são desanexadas.
    5. Coletar as células em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicionar um volume igual de meios de cultura (DMEM contendo antibiótico antimicótico 1% e 10% FBS) no tubo de centrífuga para neutralizar o tripsina-EDTA.
    6. Centrifugar as células a 250 × g por 5 min a 37 ° C.
    7. Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante, cuidadosamente, pipetando, sem perturbar o centrifugado.
    8. Ressuspender as células nos meios de cultura e então propagar as células a densidade adequada (5-10 x 103 células por cm2 para passagem ou como indicado) em novos pratos de cultura (P-IA hidrogel enxertado com e sem oligopeptídeos e ECM).
  6. Cultura de células (AFS)-tronco amniótico humano
    1. Aquecer meios de cultivo (DMEM/MCDB 201 (2:3) contendo 20% soro fetal bovino (FBS), 5 ng/mL bFGF e 1% de antibiótico antimicótico), 0,25% de tripsina-EDTA e PBS a 37 ° C em um antes do banho de água de usar.
    2. Lave células humanas AFS por pipetagem 10 mL de PBS em cada prato de 6 cm de cultura onde as células são cultivadas.
    3. Adicionar 1 mL de solução de tripsina-EDTA (0,25%) em pratos de cultura de 6 cm e incube as celulas a 37 ° C por 5 min.
    4. Observe as células em pratos de cultura de 6 cm sob microscopia para confirmar as células são desanexadas.
    5. Coletar as células em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicionar um volume igual de meios de cultura (DMEM/MCDB 201 (2:3) contendo 20% fetal de soro bovino (FBS), 5 ng/mL bFGF e 1% de antibiótico antimicótico) no tubo de centrífuga para neutralizar o tripsina-EDTA.
    6. Centrifugar as células a 250 × g por 5 min a 37 ° C.
    7. Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante, cuidadosamente, sem perturbar o centrifugado por pipetagem.
    8. Ressuspender as células em meios de cultivo e sementes em seguida as células a densidade adequada (5-10 x 103 células por cm2 para passagem ou como indicado) em novos pratos de cultura (P-IA hidrogel enxertado com e sem oligopeptídeos e ECM).

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Representative Results

P-IA hidrogel enxertado com ECM-derivado oligopeptídeos (oligoECM) ou ECM com diferentes elasticidades foram preparados seguindo o esquema de reação, como pode ser visto na figura 1A, utilizando diferentes tipos de oligoECM (figura 1B). As elasticidades do hidrogel eram reguladas pela intensidade aplicada reticulação (tempo) (Figura 1). P-IA hidrogel enxertado com oligopeptídeos derivados vitronectina, que tem um módulo de armazenamento de 25,3 kPa (tempo de reticulação de 24 h), com suporte a cultura a longo prazo de iPS humana e células ES por mais de 10-20 passagens. Particularmente, P-IA hidrogel enxertado com um segmento comum (P-IA-24h-VN1G) ou uma cadeia dupla (P-IA-24h-VN2G) com suporte a pluripotência de iPS humana e pilhas do ES, que foram preparadas com uma concentração relativamente baixa de oligoECM (200-500 μg/mL) do que P-IA-VN1 hidrogel, que exigiu usando uma alta concentração de oligoECM (> 1000 μg/mL) para manter a pluripotência de humanos iPS e ES as células28,32.

Células ES humanas mantiveram no mouse embrionárias fibroblastos (MEFs) foram deslocados para cultura em outros pratos revestimento materiais (por exemplo, Synthemax II) revestido sintetizado e P-IA-24 h-VN1 hidrogel pratos (Figura 2)28. Células ES humanas cultivadas em revestimento comercialmente disponível pratos foram encontrados para diferenciar mais facilmente, especialmente na periferia das colônias (Figura 2a e 2C), Considerando que as células ES humanas poderiam manter sua pluripotência em P-IA-24 h-VN1-1000 hidrogel pratos porque as células diferenciadas não podiam ser observadas a morfologia de células ES humanas na P-IA-24h-VN1-1000 hidrogel pratos (Figura 2b e 2d)28.

A pluripotência de ES humano (Figura 3A) e iPS (Figura 3B) células cultivadas na P-IA - 24 h hidrogel enxertado com oligoECM (P-IA-24 h-VN1-1000, P-IA-24 h-VN1G-1000, P-IA-24 h-VN2C), bem como convencional vitronectina recombinante ( rVitronectin)-revestido de pratos, foi avaliada com base na expressão de proteínas de fabricante pluripotentes (Oct3/4, Sox2 e Nanog) depois que as células foram cultivadas em cada prato em condições xeno-livre usando mídia essencial 8 para 10 passagens32. Estas proteínas de pluripotência manifestaram-se satisfatoriamente em iPS humana e ES células cultivadas P-IA hidrogel enxertado com oligoECM, assim como pratos rVitronectin revestido em condições xeno-livre.

Avaliação da capacidade de diferenciação em células derivadas de três camadas germinativas em vitro (EB formação) e na vivo (formação de teratoma) é essencial para verificar a pluripotência de ES humano e células iPS após cultivo em sintético biomateriais. Portanto, as células ES humanas (Figura 4) e células iPS humana (Figura 5) foram cultivadas em pratos de hidrogel P-IA-oligoECM e recombinantes pratos vitronectina-revestido para 10 passagens e posteriormente, as células foram cultivados em suspensão para formar EBs. O EBs mais foram cultivadas sobre gelatina-revestido pratos por algumas semanas observar a capacidade das células para espalhar no pratos (Figura 4A e 5A figura)32. ES humanas diferenciadas (Figura 4B) e células iPS (Figura 5B) foram immunostained para proteínas derivadas de três camadas germinativas: alfa-fetoproteína (AFP, endoderme), actina de músculo liso (SMA, mesoderme) e proteína ácida fibrilar glial (GFAP ectoderme)32. Tanto iPS humana e células ES foram encontradas para se diferenciar em células derivadas de todas as três camadas germinativas, indicando outra verificação da pluripotência de iPS humana e células ES, mesmo depois de cultivo na P-IA hidrogel enxertado com oligoECM em xeno-livre condições para o longo prazo (passagem > 10 passagens).

A capacidade de diferenciação de células ES humanas nas células originou-se de três camadas germinativas na vivo (ensaio de formação de teratoma) também foi avaliada. Células ES humanas, que foram cultivadas na P-IA-VN1-1000 (figura 6A) e P-IA-VN2C-1000 (Figura 6B) em condições de cultura xeno-livre de 10 passagens, foram injetadas por via subcutânea de ratos SCID NOD32. Os teratomas foram isolados de ratos, e cortes de tecido de teratoma foram fixados e corados com H & E (figura 6A e 6B)32. Os teratomas exibido a existência de células provenientes de todas as três camadas germinativas: (ectoderma, mesoderma (cartilagem, figura 6A(c) e 6B(c)) e endoderma (epitélio intestinal, figura 6A(b) e 6B(b)) neuroepithelium, figura 6A(d); epithelium retinal do pigment, Figura 6B(d)). Estes resultados sugerem que as células ES humanas cultivadas na P-IA-24h-VN1-1000 e P-IA-24h-VN2C-1000 em condições xeno-livre para 10 passagens podem diferenciarem em células originárias de três camadas germinativas, indicando que sua pluripotência é mantida vivo.

Células humanas AFS também foram cultivadas em não modificado P-IA hidrogel hidrogel P-IA-oligoECM e pratos TCP em meios de expansão. A Figura 7 mostra as morfologias de células humanas de AFS cultivadas após quatro dias de cultura em P-i a e P-IA-oligoECM pratos de hidrogel com elasticidades (E') de 12.2 (reticulação tempo = 6 h), 18.3 (tempo de reticulação = 12 h), 25,3 (reticulação tempo = 24 h) e 30,4 kPa (tempo de reticulação = 48 h) usar uma concentração de oligoECM de 0 a 50 μg/mL, bem como TCP pratos com média de 3-12 de rigidez30.

Células humanas AFS não podem proliferar em pratos de hidrogel P-IA com ou sem oligoECM quando a rigidez de hidrogel a P-IA era menos do que 11 kPa (PV - 2h, PV-2h-Y, PV - 4h e PV-4h-Y), enquanto que células humanas AFS podem proliferar com ou sem oligoECM quando E' era maior do que 12 kPa, com exceção os pratos de hidrogel P-IA - 6 h e PV-IA-6 h-COL1. P-IA - 6h e P-IA-6h-COL1 parecem não ser favorável para a cultura de células humanas de AFS porque os biomateriais de cultura celular macio travar o de progressão do ciclo celular30.

Os resultados acima sugerem que pratos de hidrogel P-IA são um material ideal para o cultivo de células-tronco longo prazo e mantêm a pluripotência das células estaminais através da selecção de oligoECM e rigidez específica, bem como a concentração ideal de reação de oligoECM (densidade de superfície de oligoECM).

Figure 1
Figura 1: preparação do hidrogel P-IA enxertado com oligoECM ou ECM. (A) esquema da reação para P-IA hidrogel enxertado com ECM e oligopeptídeos ECM-derivado (oligoECM)29. Copyright 2015. Adaptado com permissão de The Royal Society of Chemistry. (B) Design e sequência de oligopeptídeos enxertados na P-IA hidrogel. Oligopeptídeos de cadeia única (P-IA-BSP, P-IA-VN1 e HBP1-P-IA), única cadeia oligopeptídeos com um segmento comum (P-IA-VN1G), e correntes duas (P-IA-VN2C e HBP2C-P-IA) e ECM (P-IA-ECM) foram enxertados na P-IA hidrogel32. Adaptado sob uma licença Creative Commons Attribution. (C) rigidez de P-IA hidrogel preparado por diferentes períodos de reticulação29. Copyright 2015. Adaptado com permissão de The Royal Society of Chemistry. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: comparação de células ES humanas culturas na P-IA-24h-VN1 hidrogel e revestimento comercialmente disponíveis pratos. Morfologia de células ES humanas (WA09) cultivados em pratos de revestimento comercialmente disponíveis (a, b) e P-IA-24 h-VN1-1000 (c, d) pratos na passagem 1 quando células ES humanas foram passou do cultivo de fibroblastos embrionários do rato (MEFs) em cultivo em pratos de revestimento comercialmente disponível ou PVA-24h-VN1-1000 pratos. Setas vermelhas mostram células ES humanas diferenciadas. As barras de escala indicam 50 µm (a, b) e 100 µm (c, d)28. Adaptado sob uma licença Creative Commons Attribution. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: caracterização da pluripotência humana ES e iPS células na P-IA hidrogel enxertado com desenhos diferentes oligopeptídeos. (A) expressão de proteínas de pluripotência Nanog (vermelho), Sox2 (verde) e Oct3/4 (verde) em células humanas ES (H9) analisados por imunocoloração com dupla coloração com Hoechest33342 para nuclear rotulagem (azul) após cultivo em (uma) P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000 e (c) hidrogel P-IA-24 h-VN2C-1000 e em (d) vitronectina recombinante (rVitronectin)-revestido pratos sob condições xeno-livre de 10 passagens. (B) expressão de proteínas de pluripotência Nanog (vermelho), Sox2 (verde) e Oct3/4 (verde) em células iPS de humanos analisado por imunocoloração com dupla coloração com Hoechest33342 para nuclear rotulagem (azul) após cultivo em (uma) P-IA-24 h-VN1-1000 hidrogel, hidrogel (b), P-IA-24 h-VN2C-1000 e (c) vitronectina recombinante (rVitronectin)-hidrogel revestido pratos sob condições xeno-livre para 10 passagens32. As barras de escala indicam 50 µm. adaptado sob uma licença Creative Commons Attribution. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: caracterização da capacidade de diferenciação de ES humana células na P-IA hidrogel enxertado com desenhos diferentes oligopeptídeos. (A) morfologia de células de EBs diferenciada de células humanas de ES (H9) após cultivo em (uma) P-IA-24 h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000 e (c) hidrogel P-IA-24 h-VN2C-1000 e (d) recombinante vitronectina (rVitronectin)-revestido pratos sob condições xeno-livre de 10 passagens. As barras de escala indicam 100 µm. (B) a expressão de uma proteína ectoderme (GFAP, vermelho), proteína de mesoderme (SMA, verde) e proteína endoderme (AFP, verde) em células humanas de ES (H9) avaliada por imunocoloração com coloração dupla com Hoechest33342 para nuclear rotulagem (azul) após cultivo P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000 e hidrogel P-IA-24h-VN2C-1000 e vitronectina recombinante (rVitronectin)-revestido pratos sob condições xeno-livre para 10 passagens32. As barras de escala indicam 50 µm. adaptado sob uma licença Creative Commons Attribution. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: caracterização da capacidade de diferenciação de iPS humana células na P-IA hidrogel enxertado com desenhos diferentes oligopeptídeos. (A) morfologia de células de EBs diferenciada de células iPS de humanos (HPS0077) após cultivo em (uma) P-IA-24 h-VN1-1000 hidrogel hidrogel (b), P-IA-24 h-VN2C-1000 e (c) vitronectina recombinante (rVitronectin)- pratos revestidos sob condições xeno-livre de 10 passagens. As barras de escala indicam 100 µm. (B) a expressão de uma proteína ectoderme (GFAP, vermelho), proteína de mesoderme (SMA, verde) e proteína endoderme (AFP, verde) em células iPS humana (HPS0077), analisado por imunocoloração com coloração dupla com Hoechest33342 para nuclear rotulagem (azul) após cultivo em (uma) P-IA-24 h-VN1-1000 hidrogel hidrogel (b), P-IA-24 h-VN2C-1000 e (c) vitronectina recombinante (rVitronectin)-revestido pratos sob condições xeno-livre para 10 passagens32. As barras de escala indicam 50 µm. adaptado sob uma licença Creative Commons Attribution. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Caracterização da capacidade de diferenciação de ES humano (H9) células em vivo após cultivo em hidrogel IA-VN1-24 h-P e P-IA-24 h-VN2C. () (uma) foto de um teratoma por injeção com ES humana células após cultivo em P-IA-24 h-VN1-1000 hidrogel sob as condições de cultura celular xeno-livre após 10 passagens. Tecidos, incluindo o epitélio intestinal (b) (endoderme), (c) da cartilagem (mesoderme) e (d) neuroepithelium (ectoderme) pode ser observado. (B) (uma) foto de um teratoma por injeção com ES humana células após cultivo em P-IA-24 h-VN2C-1000 hidrogel sob as condições de cultura celular xeno-livre após 10 passagens. Tecidos, incluindo o epitélio intestinal (b) (endoderme), (c) da cartilagem (mesoderme) e (d) epithelium retinal do pigment (ectoderme) podem ser observados32. As barras de escala indicam 100 µm. adaptado sob uma licença Creative Commons Attribution. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: morfologia de células humanas de AFS cultivadas sobre pratos TCP e pratos de hidrogel P-IA imobilizados com ou sem oligopeptídeos ECM-derivado após 4 dias de cultura. (A) morfologia de células humanas de AFS em pratos TCP. (B) morfologia do AFS humana células na P-IA - 6 h e P-IA-6 h -Z pratos de hidrogel (P-IA - 6 h, P-IA-6 h-COL1-50, P-IA-6 h-FN1-50, P-IA-6 h-VN1-50, P-IA-6 h-HBP1-50 e P-IA-6 h-cRGD-50). (C) morfologia de hAFCs em P-IA - 12 h e P-IA-12 h -Z hidrogel pratos (P-IA - 12 h, P-IA-12 h-COL1-50, P-IA-12 h-FN1-50, P-IA-12 h-VN1-50, P-IA-12 h-HBP1-50 e P-IA-12 h-cRGD-50). (D) morfologia do AFS humana células na P-IA - 24 h e P-IA-24 h -Z pratos de hidrogel (P-IA - 24 h, P-IA-24h-COL1-50, P-IA-24h-FN1-50, P-IA-24 h-VN1-50, P-IA-24 h-HBP1-50 e P-IA-24 h-cRGD-50). (E) morfologia do AFS humana células na P-IA - 48 h e P-IA-48 h -Z pratos de hidrogel (P-IA - 48 h, P-IA-48h-COL1-50, P-IA-48h-FN1-50, P-IA-48 h-VN1-50, P-IA-48 h-HBP1-50 e P-IA-48 h-cRGD-50). As barras de escala indicam 100 μm30. Copyright 2017. Adaptado com permissão de The Royal Society of Chemistry. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome do Material / equipamento Abreviatura
GTPGPQGIAGQRGVV COL1
GACRGDCLGA RGD cíclica (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectina rVN
Fibronectina FN

Tabela 1: ECM-derivado oligopeptídeos sequências e ECM utilizado neste estudo.

Anticorpos Concentração (taxa de diluição)
NANOG 1: 200
SSEA4 1: 200
OCT3/4 1: 200
Sox2 1: 200
Actina de músculo liso 1: 200
(Α-SMA) 1: 200
AFP 1: 200
GFAP 1: 200
Alexa Fluor 555 – conjugados anti-rato cabra 1: 200

Tabela 2: Anticorpos usados para immunostaining neste estudo.

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Discussion

P-IA-oligoECM e P-IA-ECM hidrogel com rigidez diferentes foram desenvolvidos para a expansão a longo prazo do ES humano e células iPS, mantendo sua pluripotência para mais de dez passagens em condições xeno-livre, bem como para a cultura de células humanas de AFS, células de anúncios, e células-tronco hematopoiéticas25,28,32. P-IA hidrogel imobilizada com oligoECM é um excelente candidato para materiais de cultivo celular para investigar o efeito de materiais de cultura celular sobre o destino de diferenciação e proliferação de vários tipos de células-tronco, bem como as células primárias e células cancerosas.

Solução de P-IA deve ser transparente, quando a solução de P-IA é lançada sobre os pratos. O tempo de reticulação decide a intensidade de reticulação de hidrogel P-IA. 24 h reticulação de hidrogel P-IA produz hidrogel ideal para cultura de células humana ES/iPS. Qualquer oligopeptídeos e ECMs podem ser enxertados em hidrogel de P-IA usando este protocolo, onde os oligopeptídeos e ECMs têm grupos amino livres25,28,29,30,31, 32. a densidade da superfície dos oligopeptídeos ou ECMs pode ser detectada através de medições de espectroscopia (XPS) x-ray Spectroscopy, embora XPS não pode apresentar um valor absoluto da densidade da superfície, mas a existência dos oligopeptídeos ou ECMs pode ser seguramente analisados.

P-IA hidrogel com e sem oligopeptídeos enxertados ou ECMs pode ser preparado, que tem o módulo de armazenamento de 3-30 kPa, dependendo do tempo de reticulação. É bastante difícil de preparar hidrogel P-IA ter menos módulo de armazenamento do que 3-kPa e módulo de armazenamento maior do que 30 kPa25,28,29,30,31,32. Esta é a limitação do presente método de preparação de hidrogel de reticulação química de hidrogel P-IA. No entanto, o presente protocolo oferece uma outra opção do hidrogel ter elasticidade diferente, que pode apoiar a cultura de células primárias, células cancerosas ou células-tronco incluindo ES humano e células iPS, mas não é feita de poliacrilamida. Especialmente, ES humano e células iPS não podem proliferar em hidrogel de poliacrilamida, mas podem proliferar em hidrogel P-IA como mostrado na Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5e Figura 6. Na verdade, o P-IA-24h-VN1 hidrogel apoiada ES célula cultura humana melhor do que pratos revestimento comercialmente disponível (Figura 2). Portanto, P-IA hidrogel é preferíveis para a cultura do ES humano e células iPS.

Seria interessante investigar a elasticidade ideal do hidrogel onde ES humano e células iPS são diferenciadas em linhagens específicas de células como cardiomyocytes35, pigmento da retina epitélio36, β células6e TH + células6 para o desenvolvimento futuro da medicina regenerativa.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi parcialmente apoiada pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan sob concessão números 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 e 104-2221-E-008-107-MY3. Esta pesquisa foi também apoiada pelo projecto Hospital Landseed de Taiwan (NCU-LSH-105-A-001). Um subsídio para investigação científica (número 15K 06591) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia do Japão também é reconhecido. R. Higuchi gostaria de reconhecer para o programa de parceria científica internacional (ISPP-0062) Vice reitoria de pós-graduação e pesquisa, King Saud University, Riyadh 11451, Reino da Arábia Saudita.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

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References

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Bioengenharia questão 132 hidrogel induzida por células-tronco pluripotentes células-tronco embrionárias elasticidade cultura celular oligopeptídeos modificação da superfície nanosegment
Cultura de células-tronco pluripotentes humanas em polivinil álcool-Co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes condições Xeno-livre
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Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., … More

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

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