Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Культура человека плюрипотентных стволовых клеток на поливинилового спирта Co Итаконовая кислоты гидрогели с различной жесткости Xeno свободных условиях

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

Протокол представлен подготовить поливинилового спирта co Итаконовая кислоты гидрогели с различной жесткости, которые были привиты с и без Олигопептиды, исследовать эффект жесткости биоматериалов на дифференциацию и распространение Стволовые клетки. Жесткость гидрогели контролировался сшивки времени.

Abstract

Исследовано влияние физических сигналов, таких как жесткость биоматериалов на распространение и дифференцирования стволовых клеток, несколько исследователей. Однако большинство этих исследователей использовали Полиакриламидные гидрогели для стволовых клеток культуры в их исследованиях. Таким образом их результаты неоднозначны, поскольку эти результаты могут исходить от конкретных характеристик полиакриламида, а не из физической cue (жесткость) биоматериалов. Здесь мы описываем протокол для подготовки гидрогели, которые не основаны на полиакриламида, где различные стволовых клеток, включая клетки человеческих эмбриональных стволовых (ES) и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток, может быть культивировали. Гидрогели с различной жесткости были подготовлены биоинертный поливинилового спирта co Итаконовая кислоты (P-IA), с жесткостью, контролируется степень сшивки, изменяя время сшивки. P-IA гидрогели, привитый с и без Олигопептиды, производный от внеклеточного матрикса были исследованы как будущей платформы для стволовых клеток культуры и дифференциации. Культура и прохождение амниотической жидкости стволовых клеток, жировой производные стволовых клеток, клеток человека ES и клетки человека iPS это подробно описано здесь. Пальмитоила P-IA гидрогели показали Улучшенный спектакли, которые были вызваны их свойства жесткости. Этот протокол сообщает синтез биоматериала, их поверхности манипуляции, а также контролировать жесткость свойства и, наконец, их влияние на судьбу стволовых клеток с использованием условий xeno свободной культуры. Основываясь на последних исследованиях, такое изменение подложки могут выступать в качестве будущих платформ поддержки и направлять судьбу различных стволовых клеток линии для различных связей; и далее, регенерации и восстановления функции утраченных органа или ткани.

Introduction

Судьба дифференцировку стволовых клеток в конкретной линии клеток и долгосрочного распространения стволовых клеток, особенно человеческое индуцированных плюрипотентных (iPS) клетки и клетки человеческих эмбриональных стволовых (ES), как известно, регулироваться ингибиторы, факторы роста, и / или мелких биоактивных молекул в культуре средств массовой информации. Недавно физические сигналы биоматериалов, особенно жесткость биоматериалов культуры клеток, были признаны важным фактором руководящих судьба клеточной пролиферации и дифференцировки1,2, 3,4,5,6. Таким образом некоторые исследователи начали расследовать судьбу стволовых клеток, которые выращиваются на гидрогели, на дифференциации, главным образом с помощью Полиакриламидные гидрогели с разной жесткости.

Жесткость биоматериалов могут управлять фокуса спайки, морфологию клеток, клеток фенотипа и адгезии стволовых клеток, особенно в двумерные (2-D) выращивания1,2,3,5. Механо зондирования биоматериалов, стволовые клетки обычно контролируется фокуса адгезии сигнализации через Интегрин рецепторов. NMMIIA, nonmuscle миозин МИС зависимых сократительную способность Цитоскелет актина играет решающую роль в процессе mechanosensing стволовых клеток в клетки 2-D культивирования систем3,4,5, 7,8,9,10,11.

Энглер и его коллеги разработали интересный понятие, что взрослые стволовые клетки, таких как клетки костного стволовых (BMS), культивируемых на культуры клеток биоматериалов с аналогичными жесткость, конкретных тканей, склонны дифференцироваться в клетки, происходит от конкретные ткани5. BMS клетки инкубировали на 2-D мягкой Полиакриламидные гидрогели, покрытые коллаген типа I (с жесткость сравнима с тканей мозга) в расширении СМИ спонтанно склоняли дифференцироваться в начале нейрон линий, в то время как БМС клетки культивировали на гидрогели с жесткостью, похож на мышцы или коллагеновых костных тканей были найдены побудить дифференцировке в начале миоцитов и остеобластов, соответственно, на 2-D Полиакриламидные гидрогели3,5. Многие исследователи провели расследование судьбы дифференцировки стволовых клеток культивированный на Полиакриламидные гидрогели, прикол с коллагеном типа12,13,14,,1516 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Однако, следует отметить, что некоторые противоречивые доклады1,18,22,,2324 существуют хорошо известные идеи, предложенные Энглер и др. 5 это потому что Энглер идея5 была разработана исключительно на Полиакриламидные гидрогели и их результаты, возникла из специфических характеристик биоматериала (Полиакриламид), а не только от физической кий (жесткость) биоматериал. Таким образом важно разработать другой тип гидрогеля, из которых жесткость может управляться сшивки гидрогелей. Для этой цели были разработаны биоинертный гидрогели, которые были подготовлены из поливинилового спирта co Итаконовая кислоты (P-IA) с различными жесткость, который контролировался степени сшивки с меняющейся сшивки время25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. Стволовые клетки можно выращивать на nonmodified P-IA гидрогели, а также P-IA гидрогели, привитый с внеклеточной матрицы (ECMs) и олигопептиды. В предыдущем исследовании25гемопоэтических стволовых клеток человека (hHSCs) из пуповинной крови выращивали на P-IA гидрогели с различными жесткость значения от 3 кПа до 30 кПа модуль хранения где фибронектин или пальмитоила, производный от P-IA гидрогели был привитым фибронектина (CS1, EILDVPST). Высокая ex vivo раз расширение hHSCs наблюдалось в P-IA гидрогели, привитый с CS1 или фибронектин, которого отображаются промежуточные жесткость, начиная от 12 кПа до 30 кПа25.

Человека iPS и клетки ES не может культивироваться на обычных культуры ткани из полистирола (TCP) блюда33,34 потому что человека ES и ИПК клетки требуют конкретной привязки к ECMs, например vitronectin или Ламинин поддерживать их плюрипотентности в ходе долгосрочного культуры. Таким образом несколько структур пальмитоила привитые P-IA гидрогелей с оптимальной жесткости характеристиками были разработаны и подготовлен в формирования единой цепи, единую цепь с совместного сегмента, двойная цепь с совместного сегмента и типа разветвленных цепь32. Пальмитоила последовательности были отобраны из Интегрин и Глюкозаминогликан связывания доменов ECMs. P-IA гидрогели, привитый с vitronectin производные Олигопептиды с двойной цепи или совместного сегмента, которые имеют модуль хранения примерно 25 кПа, поддерживает долгосрочные культуры человека ES и ИПК клетки для более чем 12 отрывков под xeno свободно и химических определенных условиях32. Совместный сегмент и двойной цепи с молекулы адгезии клеток на гидрогели способствовали распространению и плюрипотентности человека ES и iPS клетки32. Здесь протокол для подготовки P-IA гидрогели (с хранения модуль из 10 кПа до 30 кПа, который измерялся в влажных условиях в воздухе) привиты с и без Олигопептиды или ECMs описан. Показано, как культура и проход несколько стволовых клеток (включая амниотической жидкости стволовые клетки, жировой, полученных стволовые клетки, человеческие клетки ES и клетки человека iPS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты в этом исследовании были утверждены комитетов по этике госпиталя Landseed Тайвань (СИБ-13-05) и Национальный центральный университет. Все эксперименты проводились в соответствии с все соответствующие и применимые правительственные и институциональные руководящие принципы и правила в ходе этого исследования.

1. решение и подготовка СМИ

  1. Полимерные очистки
    1. Очистить P-ИА с группой карбоновые кислоты с степенью гидролиза > 96.5% путем промывания P-ИА с этанолом. 20 g P-IA в 200 мл этанола в 500 мл стакан конической и агитировать на магнитной мешалкой для 24-30 ч. Обмен этанола с свежими этанола каждые 8-10 ч.
    2. Удалите P-ИА от этанола, фильтрации с использованием воронка Бюхнера.
    3. Сухой P-IA, Вакуумная сушка при комнатной температуре в течение 24 ч.
      Примечание: Рекомендуется очистить ловушку в системе вакуумной сушки (путем удаления этанола) часто, особенно во время нескольких часов, потому что ловушки, как правило, засоряются после удаления большого количества этанола от P-НМА.
  2. Подготовка решения, P-IA
    Примечание: Добавьте полимера очень медленно в растворителя (вода). Это рекомендуется принимать по крайней мере 15 минут для добавления P-IA в растворитель. Если в полимер добавляется растворитель, полимер будет не растворяется полностью. Будьте осторожны, чтобы не создавать взрывного вскипания P-IA решения. Используйте защитные очки во время приготовления раствора P-ИА. Процесс нагрева P-IA решения необходимо распустить кристаллический P-IA. Это было предложено (и желательно) подготовить решение P-IA в комнате относительно чистым экспериментальной, если это возможно.
    1. Распустить P-IA в чистой воде до 0,050 вес % концентрации для эксперимента культивирования клеток или вес 0,50% концентрации для измерения Реометр: например, распустить 50 мг в 100 мл чистой воды для культуры клеток и 500 мг в 100 мл де P-ИА P-ИА Ионизированная вода (ди) для измерения Реометр.
    2. Агитируйте P-ИА решение за 1 час на горячей плите.
      Примечание: Чтобы избежать взрывного вскипания, не нагревайте решение более 95 ° C. Взрывного вскипания раствора полимера при высокой температуре может привести к ожогу кожи. Таким образом выполнить Отопление P-IA очень тщательно и контролировать температуру раствора P-IA во время нагрева.
    3. После того, как решение P-IA охлаждался при комнатной температуре, агитировать P-ИА решение при комнатной температуре за 48 ч. отпуск горячий раствор P-IA на горячей плите без нагрева, а затем оставить его без психомоторное возбуждение при комнатной температуре 20-24 ч для обеспечения того, чтобы пузырьки воздуха не представляют в растворе P-ИА.
  3. Приготовление раствора сшивки
    1. Сделать состав глютаральдегид % веса решения 1.0 сшивки от глютаральдегид 25% водный раствор, 20,0 Вес Na2так4 с помощью 99% > чистоты и 1.0 так вес % H24. Например для 6 или 12 хорошо пластины культуры клеток, 100 мкл раствора глютаральдегид, 2 г, натрия сульфат и 100 мкл серной кислоты в 10 мл чистой воды.
  4. Средства массовой информации культуры клеток человека ES/PS
    Примечание: Использование DMEM/F12 СМИ, основных 6 СМИ, основных 8 для клеточной культуры.
    1. Возвратить, заморожены 50 X 8 и необходимым дополнением медленно решения на ночь оттаивания в холодильнике 4 ° C.
    2. Добавьте одну бутылку 50 X 8 Основные дополнения в одну бутылку основных 8 базальной средств массовой информации. Разделить на небольшие аликвоты (по 50 мл) в 100 мл центрифугирования трубы СМИ, а затем хранить при температуре от-20 ° C.

2. P-IA гидрогеля блюдо подготовка

  1. Подготовка фильма P-IA
    1. Придать Алиготе 1 мл раствора P-IA 35 мм TCP блюдо и сухой блюдо в духовке 45 ° C на 2 дня производить P-IA фильм в чистой скамейке.
  2. Сшивки блюд гидрогеля P-IA
    1. P-IA фильмов окунуться в водный сшивки решение для 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 и 48 ч.
      Примечание: ' P-IA -X» (например, P-IA-12 h) относится к P-IA высокоструктурированные Гидрогель для X h (например, 12 ч).
    2. После сшивки промыть P-IA гидрогели с чистой водой при температуре и затем сохранить гидрогели в чистой воде при температуре окружающего воздуха в чистой скамейке.
    3. Стерилизовать P-IA гидрогели путем погружения в растворе этанола 75,0 volume/volume% за 1 мин, промыть P-IA гидрогели в чистой воде шесть раз и затем сохранить P-IA гидрогели в чистой воде до тех пор, пока используется для выращивания клеток.
  3. Приготовление блюд гидрогеля P-IA, привитый с пальмитоила или ECM
    1. Активировать P-IA гидрогели через погружение в 1 мл водного раствора содержит-(3-Dimethylaminopropyl) 10 мг/мл N-N'- ethylcarbodiimide гидрохлорид (EDC) и 10 мг/мл N- оксисукцинимидного (NHS) за 1 ч при 37 ° C или 4 h при 4 ° C.
    2. Промыть P-IA гидрогели с 1 мл раствора фосфатного буфера физраствора (PBS, рН 7,2) 3 раза и погружать P-IA гидрогели в PBS раствора, содержащего 1 мл пальмитоила (100-1500 мкг/мл) или ECM (10-100 мкг/мл) в течение 24 ч при 4 ° C.
      Примечание: В таблице 1приводятся пальмитоила последовательности и ECMs, используемых для стволовых клеток культуры.
    3. После прививки пальмитоила или ECM, вымойте P-IA гидрогели с чистой водой 3 раза.
      Примечание: P-IA гидрогели, привитый с Y мкг/мл пальмитоила или ECM (Z) далее именуемые как P-IA -Xh -Z илиP-IA-Xh -Z-Y, где X относится к времени сшивки (h), Y означает концентрацию пальмитоила или ECM, и Z указывает различные пальмитоила или ECM.

3. человека ES/iPS клеточной культуры

  1. Способ проезда и поддержание недифференцированные человека ES и клетки iPS
    1. Поддерживать человека ES (например, WA09 или H9) клетки или человека iPS (например, HS0077) клетки на Matrigel в средствах массовой информации основных 8 в 6 см блюда с использованием стандартных человека ES/iPS клетки культуры протоколы28,32.
    2. Инкубировать вблизи притока человеческие клетки ES/iPS с 2,0 мг/мл dispase II в среде DMEM/F-12 СМИ при 37 ° C 8-10 мин и затем промойте человеческие клетки ES/iPS дважды с DMEM/F12 средствами массовой информации.
    3. После добавление 2 мл DMEM/F-12 СМИ для человека блюда культуры клеток ES/iPS, отсоединить слабо адэрентных колоний, с помощью скребка ячейки или закупорить.
    4. Собрать человеческие клетки ES/iPS в 15 мл пробирок центрифугирования и центрифуги человеческие клетки ES/iPS в 160 g × 5 минут при 37 ° C.
    5. После центрифугирования отбросить DMEM/F12 и приостановить человеческих клеток ES/iPS в 1 мл E8 СМИ, а затем рассчитывать плотность ячеек, используя счетчик соматических клеток.
    6. Прививать клетки ES/iPS после соответствующей плотности регулировки (1-5 х 104 клетки на2 см для пассированый или как указано) в новой культуры блюда (P-IA гидрогели, привитый с пальмитоила или ECM).

4. характеристика характеристики клеток человека ES/iPS

  1. Оценка активности щелочной фосфатазы (AP)
    1. Измерьте активность щелочной фосфатазы (AP) человеческих клеток ES/iPS, используя стандартный щелочной фосфатазы живой пятнать.
  2. Иммуноокрашивания
    1. Выполните иммуноокрашивания Tra-1-81, SSEA-Sox2, и 4 Oct3/4 на ГЭС и бедра клетки расследовать плюрипотентности после обычного протокола28,32.
    2. Добавьте 0,5 мл объем параформальдегида 4% (объем/объем) в каждом 24 хорошо блюдо, в котором человеческие клетки ES/iPS были культивировали, впоследствии, и инкубировать и блюда для 15 мин при температуре 4 ° C исправить клетки.
    3. Аспирационная параформальдегида решение от каждой скважины. Затем добавить 1 мл PBS на колодец и аспирационная PBS для полоскания клетки. Выполните процесс промывки 3 раза.
    4. Разрушения мембран клеток путем добавления 0,5 мл 0,3% (объем/объем) решение Тритон-X 100 в PBS для 30 мин при комнатной температуре.
    5. Аспирационная решение Тритон-X 100 и 300 мкл 2% (вес/объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS (блокирующий буфер) в каждой скважине и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
    6. Удалить блокирующий буфер, дозирование и впоследствии добавить желаемый первичных антител (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) и Tra-1-81(1:200), пипетки, см. таблицу 2) в каждой скважине, где 1: 200 означает, разводили антитела с PBS 200-fold и инкубируют на один день на 4 ° C.
    7. Аспирационная раствор первичных антител и мыть ячейки с 300 мкл 0,05% 20 анимации в PBS решения 3 раза при комнатной температуре.
    8. Добавить 300 мкл вторичных антител (1: 200, см. таблицу 2), которые являются специфическими для первичного подтип IgG, 2% (вес/объем) BSA раствора в каждый хорошо и инкубировать 1 час при комнатной температуре в темноте.
    9. Вымыть клетки с 300 мкл 0,05% 20 анимации в PBS решения 3 раза при комнатной температуре в темноте.
    10. Анализируйте окрашенных клеток по микроскопии флуоресцирования или confocal микроскопии.
  3. Формирование embryoid тела
    1. Исследовать плюрипотентности человеческих клеток ES/iPS, формирование embryoid тело (EB) на 10 и 20.
      Примечание: Около 80% слияния в 6-ну плиты достаточно для подготовки формирования EB.
    2. Промойте человека ES или клетки iPS с 2 мл DMEM/F-12 СМИ дважды, а затем погрузить клетки в 1,5 мл 6 основных средств массовой информации.
    3. Нарежьте около 80% вырожденная ES или iPS клетки человека приблизительно 32 200 мкл советы. Далее отсоедините клетки из блюд с помощью скребка ячейки.
    4. Соберите человеческие клетки ES/iPS и передачи в блюдо 6-ну сверхнизких вложений.
    5. Обмен основных 6 СМИ, закупорить старые средства массовой информации и добавляя свежий СМИ каждые 2 дня.
      Примечание: Культура клеток в суспензии на 2 недели с 5% CO2при 37 ° C.
    6. После EBs содержанием однородно были приостановлены в 6 основных средств массовой информации, передача EBs для культуры на 24-ну TCP блюда с 0,1% желатина вес покрытием и культура клетки в 6 основных СМИ для дополнительной недели.
    7. Запятнать клетки с антителами против маркеры клетки, полученные из трех слоев эмбриональных микрофлорой [AFP (эндодермы), GFA (эктодермы), β III-тубулина (эктодермы) и SMA (мезодермы)] и оценивать клетки иммуноокрашивания методом, описанным выше.
  4. Формирование тератома
    1. Исследовать плюрипотентности человеческих клеток ES/iPS, тератома формирования на 10 и 20.
      Примечание: 5 блюда около 80% слияния в 6-ну пластины для формирования тератома достаточно (по крайней мере 3 х 106 клеток являются необходимыми для формирования экспериментов тератома).
    2. Промойте клетки с 2 мл DMEM/F-12 СМИ дважды, а затем добавить 1,5 мл DMEM/F-12 СМИ к блюдам культуры клеток.
    3. Нарезать почти 80% вырожденная ES или iPS клетки человека приблизительно 32 с помощью 200 мкл советы. Далее отсоедините клетки из блюд с помощью скребка ячейки.
    4. Собрать человеческие клетки ES/iPS в трубу 15 мл центрифугирования и центрифуги клетки на 160 g × 5 минут при 37 ° C.
    5. После центрифугирования, приостановить клетки окатышей в 100 мкл DMEM/F12, а затем смесь ячейки гранулы с 100 мкл Matrigel (тома 1:1 коэффициент).
    6. Передача суспензию клеток в предварительно охлажденным шприц-20 ° C. Привнести, в общей сложности, по крайней мере 3 × 106 клеток подкожно в мужской NOD-ТКИД (Нод. CB17 -Prkda/JNarlТКИД) мышах (5-8 недель).
    7. После 5-8 недель вскрыть тератомы, исправить раствором параформальдегида 4,0% (вес/объем) и затем хранить при 4 ° C.
    8. Исправить тератома с парафином, нарежьте парафин врезанных тератомы и пятна с гематоксилином и эозином (H & E) с использованием стандартного протокола28,32.
      Примечание: Исследователи могут направить фиксированной тератома ткани компании исправить с парафином, ломтик, парафин врезанных тератомы, тератомы и выведение образца с H & E, который обычно используется в отделении патологии в больницах.
  5. Культура клеток человека жировой основе стволовых (ADS)
    1. Теплой культуре СМИ (DMEM, содержащей 1% противогрибковое антибиотик и 10% плода бычьим сывороточным (ФБС)), 0,25% трипсина ЭДТА, и PBS до 37 ° C в воде баня до использования.
    2. Вымойте клетки человека объявления дозирования 10 мл PBS в каждом 6-см культуры блюдо, где культивируемых клеток.
    3. Добавить 1 мл раствора (0,25%) трипсина ЭДТА в блюда-6см культуры и инкубировать решение при 37 ° C за 5 мин.
    4. Наблюдать за клетки в 6 см культуры блюда под микроскопии для подтверждения, что клетки отсоединены.
    5. Собрать клетки в 15 мл пластиковых пробирок и добавить равное количество культуры СМИ (DMEM, содержащие противогрибковое антибиотик 1% и 10% FBS) в пластиковых пробирок для нейтрализации трипсина ЭДТА.
    6. Центрифуга клетки на 250 g × 5 минут при 37 ° C.
    7. После центрифугирования отбросить супернатант тщательно закупорить, не нарушая Пелле ячейки.
    8. Ресуспензируйте клетки в культуре средств массовой информации и затем семян клетки на соответствующей плотности (5-10 x 103 клеток / см2 для пассированый или как указано) в новой культуры блюда (P-IA гидрогели, привитый с и без Олигопептиды и ECM).
  6. Человека амниотической жидкости Стволовые клеточной культуры (AFS)
    1. Теплый культивирования СМИ (DMEM/MCDB 201 (2:3) содержащий 20% плода бычьим сывороточным (ФБС), bFGF 5 нг/мл и 1% противогрибковое антибиотик), 0,25% трипсина ЭДТА, и PBS до 37 ° C в воде баня до использования.
    2. Вымойте клетки человека АСПО, дозирования 10 мл PBS в каждом 6-см культуры блюдо, где выращиваются клетки.
    3. Добавить 1 мл раствора (0,25%) трипсина ЭДТА в 6-см культуры блюда и инкубации клеток при 37 ° C за 5 мин.
    4. Наблюдать, что отдельные ячейки на 6 см культуры блюда под микроскопии для подтверждения клетки.
    5. Собрать клетки в 15 мл пластиковых пробирок и добавить равный объем культуры средств массовой информации (DMEM/MCDB 201 (2:3) содержащий 20% плода бычьим сывороточным (ФБС), bFGF 5 нг/мл и 1% противогрибковое антибиотик) в пластиковых пробирок для нейтрализации трипсина ЭДТА.
    6. Центрифуга клетки на 250 g × 5 минут при 37 ° C.
    7. После центрифугирования отказаться от супернатант тщательно, не нарушая клетки Пелле, закупорить.
    8. Ресуспензируйте клетки в средствах массовой информации культивирования и затем семян клетки на соответствующей плотности (5-10 x 103 клеток / см2 для пассированый или как указано) в новой культуры блюда (P-IA гидрогели, привитый с и без пальмитоила и ECM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P-IA гидрогели привитый с ECM-производные пальмитоила (oligoECM) или ECM с различными эластичности были подготовлены, следуя схеме реакции, как показано на рисунке 1A, с использованием различных видов oligoECM (рис. 1B). Эластичности гидрогели регулируются прикладной сшивки интенсивности (время) (рис. 1 c). P-IA гидрогели, привитый с vitronectin производные Олигопептиды, который имеет модуль хранения 25.3 кПа (24 h сшивки время), поддерживает долгосрочные культуры человека iPS и клетки ES для более 10-20 проходов. В частности P-IA гидрогели привитый с совместного сегмента (P-IA-24h-VN1G) или двойной цепи (P-IA-24h-VN2G) поддерживаются плюрипотентности человека iPS и ES клеток, которые были подготовлены с относительно низкой концентрации oligoECM (200-500 мкг/мл), чем P-IA-VN1 гидрогели, которая потребовала, используя высокую концентрацию oligoECM (> 1000 мкг/мл) для поддержания плюрипотентности человека iPS и ES клеток28,32.

ES клеток человека поддерживается на мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) были перенесены к культуре других синтезированных Лакокрасочные материалы (например, Synthemax II) покрытием блюда и P-IA-24h-VN1 гидрогеля блюда (рис. 2)28. Человеческие клетки ES, культивируемых на коммерчески доступных покрытие, блюда были найдены более легко дифференцировать, особенно на краю колонии (Рисунок 2a и 2 c), тогда как человеческие клетки ES может поддерживать их плюрипотентности на P-IA-24 h-VN1-1000 Гидрогель кухни потому что дифференцированных клеток может наблюдаться не от морфологии клеток человека ES P-IA-24h-VN1-1000 гидрогеля блюда (Рисунок 2b и 2d)28.

Плюрипотентности человека ES (Рисунок 3А) и iPS (рисунок 3B) клетки культивировали на P-IA - 24 h гидрогели привитый с oligoECM (P-IA-24 h-VN1-1000, P-IA-24 h-VN1G-1000, P-IA-24 h-VN2C), а также обычных рекомбинантных vitronectin ( rVitronectin)-покрытием блюда, оценивалась на основе выражения плюрипотентных чайник белков (Nanog, Sox2 и Oct3/4) после того, как клетки были культивированный на каждое блюдо в xeno свободных условиях, с использованием основных 8 СМИ для 10 проходы32. Эти белки плюрипотентности удовлетворительно были высказаны на человека iPS и ES клетки культивировали, P-IA гидрогели, привитый с oligoECM, а также с покрытием rVitronectin блюда в условиях xeno бесплатно.

Оценка способности дифференциации в клетки производным от три зародышевых в пробирке (EB образование) и в естественных условиях (тератома формирования) имеет важное значение для проверки плюрипотентности человека ES и iPS клеток после культивирования на синтетические биоматериалов. Таким образом человеческие клетки ES (Рисунок 4) и клеток человека iPS (рис. 5) выращивали на P-IA-oligoECM гидрогеля блюда и рекомбинантных vitronectin покрытием Посуда для 10 ходов и впоследствии, клетки были культивировали в подвеска в форме EBs. EBs далее выращивали на желатин покрытием блюда за несколько недель, чтобы наблюдать за способность клеток для распространения на блюда (рис. 4A и Рисунок 5A)32. Дифференцированные человека ES (рис. 4B) и клетки iPS (Рисунок 5B) были immunostained для белки, полученные от трех зародышевых: Альфа-фетопротеин (АФП, эндодермы), гладкие мышцы актина (SMA, мезодермы) и глиальных фибриллово кислой белка (СВМС эктодермы)32. Человека iPS и клетки ES были найдены дифференцироваться в клетки, полученные из всех трех зародышевых, указав другой проверки плюрипотентности человека iPS и ES клеток, даже после культивирования на P-IA гидрогели, привитый с oligoECM в xeno бесплатно условия для долгосрочной перспективе (проход > 10 ходов).

Также проводилась дифференциация способность человека ES клеток в клетки, возникла из трех зародышевых в vivo (тератома формирования assay). ES клеток человека, которые выращивали на P-IA-VN1-1000 (рис. 6A) и P-IA-VN2C-1000 (Рисунок 6B) в условиях xeno свободной культуры для 10 ходов, были вводят подкожно в Нод-ТКИД мышей32. Тератомы были изолированы от мышей, и разделах ткани тератома фиксировали и витражи с H & E (рис. 6A и 6B)32. Тератомы отображается существование возникая от всех трех зародышевых клеток: эндодермы (кишечного эпителия, Рисунок 6A(b) и 6B(b)), мезодермы (хрящ, Рисунок 6A(c) и 6B(c)) и эктодермы ( neuroepithelium, Рисунок 6A(d); пигментный эпителий сетчатки, Рисунок 6B(d)). Эти результаты показывают, что человеческие клетки ES культивированный на P-IA-24h-VN1-1000 и P-IA-24h-VN2C-1000 в xeno свободных условий для 10 проходы могут дифференцироваться в клетки, происходящих из трех зародышевых, указав, что их плюрипотентности поддерживается в VIVO.

Клетки человека АСПО были также культивировали в неизмененном P-IA гидрогеля, P-IA-oligoECM гидрогеля и TCP блюда в расширении средств массовой информации. Рисунок 7 показывает морфологии клеток человека АСПО, культивируется после четырех дней культуры в P-IA и P-IA-oligoECM блюда гидрогеля с эластичностью (E') 12.2 (сшивки время = 6 h), 18,3 (сшивки время = 12 h), 25,3 (сшивки время = 24 h) и 30,4 кПа (сшивки время = 48 h) с использованием oligoECM концентрации 0 или 50 мкг/мл, а также TCP блюда с 3-12 ГПД жёсткость30.

Клетки человека АСПО может не распространяться на P-IA гидрогеля блюда с или без oligoECM когда жесткость гидрогели P-IA был меньше, чем 11 кПа (PV - 2h, PV-2h-Y, PV - 4h и PV-4h-Y), тогда как клетки человека АСПО могут размножаться с или без oligoECM когда E' было больше, чем 12 кПа, за исключением P-IA - 6 h и PV-IA-6 h-COL1 гидрогеля блюда. P-IA - 6h и P-IA-6h-COL1 кажутся не благоприятные для культуры клеток человека АСПО потому что культура биоматериалов soft ячейки остановить прогрессирование клеточный цикл30.

Выше результаты предполагают, что P-IA гидрогеля блюда оптимальный материал для длинный срок выращивания стволовых клеток и поддержания плюрипотентности стволовых клеток, выбор конкретных жесткость и oligoECM, а оптимальную реакцию концентрация oligoECM (поверхностная плотность oligoECM).

Figure 1
Рисунок 1: подготовка гидрогели P-IA, привитый с oligoECM или ECM. (A) схема реакции для P-IA гидрогели, привитый с ECM- и ECM-производные пальмитоила (oligoECM)29. Авторское право к 2015 году. Адаптирована с разрешения Королевского общества химии. (B) дизайн и последовательность Олигопептиды, привитые на P-IA гидрогели. Олигопептиды одной цепи (P-IA-BSP, P-IA-VN1 и P-IA-HBP1), одно цепь Олигопептиды с совместного сегмента (P-IA-VN1G), и двойной цепи (P-IA-VN2C и P-IA-HBP2C) и ECM (P-IA-ECM) были привиты на P-IA гидрогели32. Адаптирована под лицензией Creative Commons Attribution. (C) жесткость P-IA гидрогели, подготовленный разные периоды сшивки29. Авторское право к 2015 году. Адаптирована с разрешения Королевского общества химии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: сравнение человеческих клеток ES культур на P-IA-24h-VN1 гидрогелей и коммерчески доступных покрытие блюда. Морфология человеческих клеток ES (WA09), культивируемых на коммерчески доступных покрытие блюда (а, б) и P-IA-24 h-VN1-1000 (c, d) блюда на проход 1, когда человеческие клетки ES перенесл от выращивания на мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) в культивирование на коммерчески доступных покрытие блюда или блюда ПВА-24h-VN1-1000. Красные стрелки показывают дифференцированных клеток человека ES. Шкала индикатора указывают 50 мкм (а, б) и 100 мкм (c, d)28. Адаптирована под лицензией Creative Commons Attribution. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: характеристика плюрипотентности человека ES и iPS клетки на P-IA гидрогели, привитый с различными пальмитоила конструкции. (A) выражение плюрипотентности белков Sox2 Nanog (красный), (зеленый) и Oct3/4 (зеленый) на клетки человека ES (H9) проанализированы иммуноокрашивания с двойной пятнать с Hoechest33342 для ядерной маркировки (синий) после культивирования на () P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000 и (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 гидрогели и (d) рекомбинантный vitronectin (rVitronectin)-покрытием блюда xeno свободных условиях для 10 ходов. (Б) выражение плюрипотентности белков Nanog (красный), Sox2 (зеленый) и Oct3/4 (зеленый) на клетки человека iPS анализируемой иммуноокрашивания с двойной пятнать с Hoechest33342 для ядерной маркировки (синий) после культивирования на () P-IA-24 h-VN1-1000 Гидрогель, гидрогеля (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 и (c) рекомбинантный vitronectin (rVitronectin)-гидрогелей покрытием блюда xeno свободных условиях для 10 проходы32. Шкала индикатора указывают 50 µm. адаптированный под Creative Commons Attribution License. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: характеристика способность человека ES дифференциация клеток на P-IA гидрогели, привитый с различными пальмитоила конструкции. (A) морфология клеток от EBs, отличаются от человеческих клеток ES (H9) после культивирования на () P-IA-24 h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000 и (c) P-IA-24 h-VN2C-1000 гидрогели и рекомбинантные (d) vitronectin (rVitronectin)-покрытием блюда xeno свободных условиях для 10 ходов. Шкала индикатора указывают 100 µm. (B) выражение эктодермы белка (СВМС, красный), мезодермы белка (SMA, зеленый) и энтодермы белка (AFP, зеленый) в клетках человека ES (H9) оценены иммуноокрашивания с двойной окрашивание с Hoechest33342 для ядерной маркировка (синий) после культивирования на P-IA-24h-VN1-1000, P-IA-24h-VN1G-1000 и гидрогели P-IA-24h-VN2C-1000 и на рекомбинатных vitronectin (rVitronectin)-покрытием блюда xeno свободных условиях для 10 проходы32. Шкала индикатора указывают 50 µm. адаптированный под Creative Commons Attribution License. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: характеристика дифференциация способности человека iPS клетки на P-IA гидрогели, привитый с различными пальмитоила конструкции. (A) морфология клеток от EBs отличается от человеческой iPS (HPS0077) клеток после культивирования () P-IA-24 h-VN1-1000 гидрогели, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 гидрогели и (c) рекомбинантный vitronectin (rVitronectin)- покрытые блюда xeno свободных условиях для 10 ходов. Шкала индикатора указывают 100 µm. (B) выражение эктодермы белка (СВМС, красный), мезодермы белка (SMA, зеленый) и энтодермы белка (AFP, зеленый) в клетках человека iPS (HPS0077), проанализированы иммуноокрашивания с двойной окрашивание с Hoechest33342 для ядерной маркировка (синий) после культивирования () P-IA-24 h-VN1-1000 гидрогели, (b) P-IA-24 h-VN2C-1000 гидрогели и (c) рекомбинантный vitronectin (rVitronectin)-покрытием блюда xeno свободных условиях для 10 проходы32. Шкала индикатора указывают 50 µm. адаптированный под Creative Commons Attribution License. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Характеристика дифференциация способности человека ES (H9) клетки в vivo после культивирования на P-IA-24 h-VN1 и P-IA-24 h-VN2C гидрогелей. (A) () картина тератома путем инъекций с человека ES клеток после культивирования на P-IA-24 h-VN1-1000 гидрогели в условиях культуры xeno свободных клеток после 10 ходов. Тканей, включая кишечного эпителия (b) (эндодермы), (c) хряща (мезодермы) и (d) neuroepithelium (эктодермы) может наблюдаться. (B) () картина тератома путем инъекций с человека ES клеток после культивирования на P-IA-24 h-VN2C-1000 гидрогели в условиях культуры xeno свободных клеток после 10 ходов. Тканей, включая кишечного эпителия (b) (эндодермы), (c) хряща (мезодермы) и (d) пигментный эпителий сетчатки (эктодермы) может наблюдаться32. Шкала индикатора указывают 100 µm. адаптированный под Creative Commons Attribution License. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: морфология клеток человека АСПО, культивируемых на TCP блюда и блюда гидрогеля P-IA, прикол с или без ECM-производные Олигопептиды после 4 дней культуры. (A) морфология клеток человека АСПО на TCP блюда. (B) морфологии человека АСПО клетки на P-IA - 6 h и P-IA-6 h -Z гидрогеля блюда (P-IA - 6 h, P-IA-6 h-COL1-50, P-IA-6 h-FN1-50, P-IA-6 h-VN1-50, P-IA-6 h-HBP1-50 и P-IA-6 h-cRGD-50). (C) морфология hAFCs P-IA - 12 h и P-IA-12 h -Z гидрогеля блюда (P-IA - 12 h, P-IA-12 h-COL1-50, P-IA-12 h-FN1-50, P-IA-12 h-VN1-50, P-IA-12 h-HBP1-50 и P-IA-12 h-cRGD-50). (D) морфологии человека АСПО клетки на P-IA - 24 h и P-IA-24 h -Z гидрогеля блюда (P-IA - 24 h, P-IA-24 h-COL1-50, P-IA-24 h-FN1-50, P-IA-24 h-VN1-50, P-IA-24 h-HBP1-50 и P-IA-24 h-cRGD-50). (E) морфологии человека АСПО клетки на P-IA - 48 h и P-IA-48 h -Z гидрогеля блюда (P-IA - 48 h, P-IA-48 h-COL1-50, P-IA-48 h-FN1-50, P-IA-48 h-VN1-50, P-IA-48 h-HBP1-50 и P-IA-48 h-cRGD-50). Шкала индикатора указывают 100 мкм30. Авторское право 2017. Адаптирована с разрешения Королевского общества химии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Имя материала / оборудование Аббревиатура
GTPGPQGIAGQRGVV COL1
GACRGDCLGA Циклические РСЗ (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Vitronectin rVN
Фибронектин FN

Таблица 1: ECM-производные пальмитоила последовательности и ECM, используемые в данном исследовании.

Антитела Концентрация (скорость растворения)
Nanog 1: 200
SSEA4 1: 200
OCT3/4 1: 200
Sox2 1: 200
Гладкие мышцы актина 1: 200
(Α-SMA) 1: 200
AFP 1: 200
СВМС 1: 200
Флуор Alexa 555 – конъюгированных коза анти мыши 1: 200

Таблица 2: Антитела, которые используются для иммуноокрашивания в этом исследовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

P-IA-oligoECM и гидрогели P-IA-ECM с различной жесткости были разработаны для долгосрочного расширения человеческих ES и клетки iPS, поддержание их плюрипотентности более десяти проходов в xeno свободных условиях, а также для культуры клеток человека АСПО, объявления клетки, и гемопоэтических стволовых клеток25,28,32. P-IA гидрогели, прикол с oligoECM являются отличным кандидатом для материалов культивирования клетки исследовать влияние материалов культуры клеток на судьбу дифференциации и распространением различных видов стволовых клеток, а также главные ячейки и раковые клетки.

P-IA раствор должен быть прозрачным, когда P-ИА решение бросили на блюда. Сшивки время решает сшивки интенсивность гидрогели P-ИА. 24 h сшивки P-IA гидрогелей производит оптимальные гидрогели для человеческой культуры клеток ES/iPS. Любые Олигопептиды и ECMs могут быть привиты на P-IA гидрогели, используя этот протокол, где Олигопептиды и ECMs имеют свободные амино группы25,28,29,,3031, 32. Поверхностная плотность Олигопептиды или ECMs могут быть обнаружены Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) измерений, хотя XPS не представляют абсолютное значение поверхностной плотности, но существование Олигопептиды или ECMs может быть безопасно проанализированы.

P-IA гидрогели с и без привитые Олигопептиды или ECMs могут быть подготовлены, которые имеют модуль хранения от 3-30 кПа, в зависимости от времени сшивки. Это довольно трудно подготовить гидрогели P-IA, имеющие менее модуль хранения чем 3 кПа и выше модуль хранения чем 30 кПа25,28,,2930,,3132. Это ограничение нынешний метод подготовки гидрогеля химической сшивки P-IA гидрогелей. Однако настоящий Протокол обеспечивает еще один вариант наличие различных эластичность, который может поддерживать культуру Главные ячейки, раковые клетки или стволовых клеток, включая человека ES и ИПК клетки, но не сделаны из Полиакриламидные гидрогели. Особенно человека ES и ИПК клетки не могут распространяться на Полиакриламидные гидрогели, но может распространяться на P-IA гидрогели, как показано на рисунке 2, рис. 3, рис 4, Рисунок 5и Рисунок 6. Действительно P-IA-24h-VN1 гидрогели поддерживает человеческой культуры клеток ES, лучше, чем коммерчески доступных покрытие блюда (рис. 2). Таким образом P-IA гидрогели являются предпочтительными для культуры человека ES и клетки iPS.

Было бы интересно расследовать оптимальной упругости гидрогелей, где человека ES и ИПК клетки дифференцируются в конкретных линий клеток, таких как кардиомиоцитов35, сетчатки пигментного эпителия36, β клетки6и ТД + клетки6 для будущего развития регенеративной медицины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Частично это исследование было поддержано Министерством науки и технологии, Тайвань под номера грантов-003 106-2119-M-008, 105-2119-M-008-006 и 104-2221-E-008-107-MY3. Это исследование также поддержали проект строительства больницы Landseed Тайвань (НКГ-LSH-105-A-001). Целевые субсидии для проведения научных исследований (номер 15K 06591) от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии также признал. A. Хигути хотели бы признать для вице ректорате международного научного партнерства (ISPP-0062) для обучения и научных исследований, Университет короля Сауда, Эр-Рияд 11451, Королевство Саудовской Аравии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

Tags

Биоинженерия выпуск 132 гидрогеля индуцированных плюрипотентных стволовых клеток эмбриональных стволовых клеток эластичность культуры клеток пальмитоила модификация поверхности nanosegment
Культура человека плюрипотентных стволовых клеток на поливинилового спирта Co Итаконовая кислоты гидрогели с различной жесткости Xeno свободных условиях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., … More

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter