Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mänskliga pluripotenta stamceller kultur på Polyvinyl alkohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels med varierande stelhet Xeno-fria villkor

Published: February 3, 2018 doi: 10.3791/57314
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 1, 1, 1, 2, 2, 5, 6, 7,8
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University
* These authors contributed equally

Summary

Ett protokoll presenteras för att förbereda polyvinyl alkohol-co-itaconic acid hydrogels med varierande stelhet, som var ympade med och utan oligopeptider, för att undersöka effekten av styvheten i biomaterial på differentiering och spridning av stamceller. Styvheten i hydrogels kontrollerades av crosslinking tiden.

Abstract

Effekten av fysiska ledtrådar, såsom styvheten i biomaterial om spridning och differentiering av stamceller, har undersökts av flera forskare. Men har de flesta av dessa utredare använt polyakrylamid hydrogeler för stamceller kultur i sina studier. Därför, deras resultat är kontroversiella eftersom dessa resultat kan härröra från polyakrylamid särdrag och inte från den fysiska cue (stelhet) av biomaterial. Här beskriver vi ett protokoll för att förbereda hydrogels, som inte bygger på polyakrylamid, där olika stamceller, celler, inklusive mänskliga embryonala stamceller (ES) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPS), kan vara odlade. Hydrogeler med varierande stelhet var beredda från bioinert polyvinyl alkohol-co-itaconic syra (P-IA), med styvhet kontrolleras av crosslinking grad av crosslinking tiden förändras. De P-IA hydrogels ympade med och utan oligopeptider härrör från extracellulär matrix undersöktes som en framtida plattform för stamceller kultur och differentiering. Kultur och passage av fostervatten vätska stamceller, adipose-derived stamceller, mänskliga ES-celler och mänskliga iPS-celler beskrivs i detalj här. Den oligopeptide P-IA hydrogels visade överlägsen föreställningar, som var induceras av deras styvhet egenskaper. Detta protokoll rapporterar syntesen av biomaterial, deras yta manipulation, tillsammans med kontrollera egenskaperna stelhet och slutligen deras inverkan på stamceller öde med hjälp av xeno-fri odlingsbetingelser. Baserat på senaste studier kan sådana modifierade substrat fungera som framtida plattformar att stödja och styra ödet för olika stamceller linje till olika kopplingar; och ytterligare, återhämta sig och återställa den förlorade organ eller vävnad.

Introduction

Ödet för stamcellers differentiering in en specifik härstamning av celler och långsiktiga spridningen av stamceller, särskilt mänskliga inducerade pluripotenta (iPS) och mänskliga embryonala stamceller (ES) celler, är känd för att regleras av hämmare, tillväxtfaktorer, och / eller små bioaktiva molekyler i kultur media. Nyligen, de fysiska ledtrådar biomaterial, särskilt styvheten i cell kultur biomaterial, har erkänts vara en viktig faktor som styr ödet för stem cell proliferation och differentiering1,det2, 3,4,5,6. Därför har flera forskare börjat utreda ödet för stamceller, som är odlade på hydrogels, på differentiering, främst använder polyakrylamid hydrogels med varierande stelhet.

Styvheten i biomaterial kan styra fokal sammanväxningar, cellmorfologi, cell fenotyp och stem celladhesion, särskilt i tvådimensionell (2D) odling1,2,3,5. Mechano-sensing biomaterial av stamceller styrs generellt av fokal vidhäftning signalering via integrin receptorer. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA-beroende kontraktilitet i cytoskeleton av aktin spelar en avgörande roll i den mechanosensing processen att stamceller i 2-D-cell odling system3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler och hans kollegor utvecklat en intressant föreställning som vuxna stamceller, såsom benmärg stamceller (BMS) odlas på cell kultur biomaterial med en liknande stelhet som specifika vävnader, tenderar att differentieras till celler härstammar från specifika vävnader5. BMS cellerna inkuberas i 2-D mjuk polyakrylamid hydrogels belagd med kollagen typ I (med en stelhet som är jämförbar med hjärnans vävnader) i expansion media förmåddes spontant att differentieras till tidig neuron utvecklingslinjerna medan BMS celler odlade på hydrogeler med en stelhet som är liknande till det av muskel- eller kollagena ben vävnader befanns inducerar differentiering in tidiga härstamningar myocyter och osteoblaster, respektive, på 2-D polyakrylamid hydrogels3,5. Många forskare har undersökt stamceller öde differentiering odlade på polyakrylamid hydrogels orörlig med kollagen typ I12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. det bör dock nämnas att vissa motstridiga rapporter1,18,22,23,24 finns för den välkända idé som föreslagits av Engler o.a. 5 detta är eftersom Englers idé5 utvecklades enbart på polyakrylamid hydrogels och deras resultat har sitt ursprung från särdrag av biomaterial (polyakrylamid) och inte enbart från den fysiska cue (stelhet) av biomaterial. Det är därför viktigt att utveckla en annan typ av hydrogel, varav styvheten kan styras av crosslinking av hydrogels. För detta ändamål framkallades bioinert hydrogels, som utarbetades från polyvinyl alkohol-co-itaconic syra (P-IA) med annorlunda styvhet, som kontrollerades av crosslinking graden med en föränderlig crosslinking tid25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. stamcellerna kan odlas på nonmodified P-IA hydrogels, liksom P-IA hydrogels ympade med extracellulära matriser (ECMs) och oligopeptider. I en tidigare studie25odlades mänskliga hematopoetiska stamceller (hHSCs) från navelsträngsblod på P-IA hydrogels med annorlunda styvhet värden sträcker sig från en 3 kPa till 30 kPa lagring modulus där Fibronektin eller en oligopeptide härrör från Fibronektin (CS1, EILDVPST) var ympade på den P-IA hydrogels. Hög ex vivo fold expansion av hHSCs observerades i den P-IA hydrogels ympade med CS1 eller Fibronektin, som visas en mellanliggande styvhet alltifrån 12 kPa till 30 kPa25.

Mänskliga iPS och ES-celler kan inte odlas på konventionella vävnadsodling polystyren (TCP) rätter33,34 eftersom mänskliga ES och iPS-celler kräver specifik bindning till ECMs, såsom Aktiebolaget Trav & galopp eller laminin att upprätthålla deras pluripotens under långsiktig kultur. Därför var flera strukturer av oligopeptide-ympade P-IA hydrogels med optimal styvhet egenskaper konstruerade och iordningställda i formationer av en enda kedja, en enda kedja med ett gemensamt segment, en dubbel kedja med ett gemensamt segment och en grenad-typ kedjan32. Oligopeptide sekvenser valdes från integrin - och glykosaminoglykan-bindning domäner för ECMs. Den P-IA hydrogels ympade med Aktiebolaget Trav & galopp-derived oligopeptider med en dubbel kedja eller gemensamma segment, som har en lagring modulus på ungefärligt 25 kPa, stöds den långsiktiga kulturen av mänskliga ES och iPS-celler för över 12 passager under xeno-fri och kemiska definierade villkor32. Den gemensamma segment och dubbel kedja med Celladhesionmolekylar på hydrogels underlättat spridningen och pluripotenta mänskliga ES och iPS celler32. Här, ett protokoll för att förbereda P-IA hydrogels (med en lagring modulus från 10 kPa till 30 kPa, som mättes under våta betingelser i luften) ympade med och utan oligopeptider eller ECMs beskrivs. Hur kultur och passage flera stamceller (inklusive amniotiska vätskan stamceller, adipose-derived stamceller, mänskliga ES-celler och mänskliga iPS-celler) visas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experimenten i denna studie godkändes av de etiska kommittéerna av Taiwan Landseed sjukhuset (IRB-13-05) och National Central University. Alla experiment genomfördes i enlighet med alla relevanta och tillämpliga statliga och institutionella riktlinjer och förordningar under denna studie.

1. lösning och Media förberedelse

  1. Polymer rening
    1. Rena P-IA med karboxylsyra grupp med en grad av hydrolys av > 96,5% genom tvättning P-IA med etanol. Placera 20 g P-IA i 200 mL etanol i en 500 mL konisk bägare och agitera på en magnetomrörare för 24-30 h. Exchange etanol med färska etanol varje 8-10 h.
    2. Ta bort P-IA från etanolen genom filtrering med hjälp av en Büchner tratt.
    3. Torka P-IA genom vakuumtorkning i rumstemperatur i 24 h.
      Obs: Det rekommenderas att rengöra fällan i vakuumtorkning systemet (genom avlägsnande av etanol) ofta, speciellt under inledande timmarna eftersom fällan tenderar att bli igensatta efter avlägsnande av en stor mängd etanol från P-IA.
  2. Beredning av P-IA
    Obs: Lägg till polymeren mycket långsamt i lösningsmedlet (vatten). Det är rekommenderat att ta minst 15 min att lägga till P-IA i lösningsmedlet. Om lösningsmedel tillsätts till polymeren, skulle polymeren inte upplösas helt. Var noga med att inte generera explosiva kokande av P-IA lösningen. Använd skyddsglasögon under beredning av P-IA. Uppvärmningen av P-IA lösningen är viktigt att lösa upp kristallin P-IA. Det är föreslagna (och bättre) att förbereda P-IA lösningen i ett relativt ren experimentell rum, om möjligt.
    1. Lös upp P-IA i rent vatten till en 0,050 vikt % koncentration för cell odling experimentet eller en 0.50 vikt % koncentration för reometer mätning: exempelvis lös 50 mg i 100 mL rent vatten för cellodling och P-IA 500 mg i 100 mL av de P-IA joniserat (DI) vatten för reometer mätningar.
    2. Agitera P-IA lösningen för 1 h på värmeplattan.
      Obs: För att undvika explosiva kokande, Värm inte lösningen över 95 ° C. Explosiva kokande av polymer lösningen vid hög temperatur kan ge brännskador på huden. Därför utför uppvärmning av P-IA mycket noggrant, och övervaka temperaturen hos P-IA lösningen under uppvärmningen.
    3. När P-IA lösningen var kyls vid omgivningstemperatur, agitera P-IA lösningen i rumstemperatur i 48 h. lämna varma P-IA lösningen på värmeplattan utan uppvärmning och sedan lämna det utan agitation i rumstemperatur i 20-24 h så att luftbubblor är inte finns i P-IA lösningen.
  3. Beredning av crosslinking
    1. Gör sammansättningen av crosslinking lösning 1,0 vikt % glutaraldehyd från 25% vattenlösning glutaraldehyd lösning, 20,0 vikt % Na2så4 med 99% > renhet och 1,0 vikt % H2så4. Till exempel för en 6 eller 12 väl cell kultur plattan, tillsätt 100 µL av glutaraldehyd lösning, 2 g natriumsulfat och 100 µL av sulfuric syra i 10 mL rent vatten.
  4. Mänskliga ES/PS cell kulturmassmedia
    Obs: Använd DMEM/F12 media, väsentliga 6 media och väsentliga 8 media för cellkulturen.
    1. Returnera fryst 50 X väsentliga 8 tillägg långsamt till lösning över natten av upptining i kylskåp 4 ° C.
    2. Lägg till en flaska 50 X väsentliga 8 tillägg i en flaska med väsentliga 8 basala media. Dela media i små portioner (50 mL) i 100 mL centrifugering rör och sedan lagra media vid-20 ° C.

2. P-IA Hydrogel maträtt förberedelse

  1. P-IA film förberedelse
    1. Injicera en 1 mL alikvot av P-IA lösningen i en 35 mm TCP maträtt, och torka skålen i en 45 ° C ugn i 2 dagar att producera en P-IA film i en ren bänk.
  2. Crosslinking av de P-IA hydrogel rätterna
    1. Sänk ner P-IA filmerna i en vattenlösning crosslinking lösning för 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 och 48 h.
      Obs: ' P-IA -X' (t.ex., P-IA-12 h) refererar till en P-IA hydrogel tvärbundna för X h (t.ex., 12 h).
    2. Efter crosslinking, skölj den P-IA hydrogels med rent vatten vid rumstemperatur och sedan hålla hydrogels i rent vatten vid rumstemperatur i en ren bänk.
    3. Sterilisera den P-IA hydrogels genom nedsänkning i en 75,0 volume/volume% etanol lösning för 1 min, skölj den P-IA hydrogels i rent vatten sex gånger, och sedan hålla den P-IA hydrogels i rent vatten tills används för cellen odling.
  3. Beredning av P-IA hydrogel rätter ympade med oligopeptide eller ECM
    1. Aktivera den P-IA hydrogels via nedsänkning i 1 mL vattenlösning innehållande 10 mg/mL N-(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide hydroklorid (EDC) och 10 mg/mL N- hydroxysuccinimide (NHS) för 1 h vid 37 ° C eller 4 h vid 4 ° C.
    2. Skölj den P-IA hydrogels med 1 mL av fosfat buffrad saltlösning (PBS, pH 7,2) 3 gånger och fördjupa den P-IA hydrogels en PBS lösning innehållande 1 mL oligopeptide (100-1 500 µg/mL) eller ECM (10-100 µg/mL) för 24 h vid 4 ° C.
      Obs: De oligopeptide sekvenser och ECMs används för stamceller kultur sammanfattas i tabell 1.
    3. Efter ympning det oligopeptide eller ECM, tvätta den P-IA hydrogels med rent vatten 3 gånger.
      Obs: De P-IA hydrogels ympade med Y µg/mL oligopeptide eller ECM (Z) är hädanefter benämnd P-IA -Xh -Z ellerP-IA-Xh -Z-Y, där X hänvisar till den crosslinking tid (h), Y anger koncentrationen av oligopeptide eller ECM, och Z anger en annan oligopeptide eller ECM.

3. mänskliga ES/iPS cellkultur

  1. Metod för passage och underhåll av odifferentierade mänskliga ES och iPS-celler
    1. Upprätthålla mänskliga ES (t.ex., WA09 eller H9) celler eller mänskliga iPS (t.ex., HS0077) celler på Matrigel i väsentliga 8 media i 6 cm rätter med standarden mänskliga ES/iPS cell kultur protokoll28,32.
    2. Inkubera nära-konfluenta mänskliga ES/iPS-celler med 2,0 mg/mL dispase II i DMEM/F-12 media vid 37 ° C i 8-10 min och skölj sedan mänskliga ES/iPS-celler två gånger med DMEM/F12 media.
    3. Efter tillsats av 2 mL DMEM/F-12 media till mänskliga ES/iPS cell kultur rätter, lossa svagt vidhäftande kolonier med en cell skrapa eller genom pipettering.
    4. Samla in de mänskliga ES/iPS-cellerna i 15 mL centrifugering rör och centrifugera mänskliga ES/iPS-celler vid 160 × g i 5 minuter vid 37 ° C.
    5. Efter centrifugering, kassera DMEM/F12 och avbryta de mänskliga ES/iPS-cellerna i 1 mL av E8 media, och sedan räkna cell densiteten med hjälp av en cell-räknare.
    6. Inokulera ES/iPS cellerna efter lämplig djurtäthet justeringen (1-5 x 104 celler per cm2 för passaging eller som indikerade) till nya kultur rätter (P-IA hydrogels ympade med oligopeptide eller ECM).

4. karakterisering av mänskliga ES/iPS Cell karakterisering

  1. Utvärdering av alkaliskt fosfatasaktiviteten (AP)
    1. Mäta alkaliskt fosfatas (AP) aktiviteten av humana ES/iPS-celler med hjälp av en standard alkaliskt fosfatas levande färgning.
  2. Immunfärgning
    1. Utföra immunfärgning av Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 och Oct3/4 på hES och höfter celler att undersöka pluripotency efter den konventionella protokoll28,32.
    2. Tillsätt en 0,5 mL volym av 4% (volym/volym) PARAFORMALDEHYD i varje 24 väl maträtt där de mänskliga ES/iPS-cellerna var odlade, och därefter Inkubera rätter för 15 minuter vid 4 ° C fixar cellerna.
    3. Aspirera PARAFORMALDEHYD lösningen från varje brunn. Sedan tillsätt 1 mL PBS per brunn och aspirera PBS för att skölja cellerna. Utföra sköljprocessen 3 gånger.
    4. Permeabilize cellmembran genom att tillsätta 0,5 mL 0,3% (volym/volym) Triton-X 100 lösning i PBS i 30 min i rumstemperatur.
    5. Aspirera Triton-X 100 lösningen och tillsätt 300 µL av 2% (vikt/volym) bovint serum albumin (BSA) i PBS (blockerande buffert) i varje brunn och inkubera i 30 min i rumstemperatur.
    6. Ta bort det blockerande buffert genom pipettering och Lägg därefter till önskad primära antikropparna (Oct3/4 (1: 200), Sox2 (1: 200), SSEA-4 (1: 200) och Tra-1-81(1:200) med pipett, se tabell 2) i varje brunn, där 1: 200 indikerar antikropparna späddes med PBS 200-fold och inkuberas för en dag vid 4 ° C.
    7. Aspirera primär antikropp lösningen och tvätta cellerna med 300 µL av 0,05% Tween-20 i PBS lösning 3 gånger vid rumstemperatur.
    8. Tillsätt 300 µL av sekundära antikroppar (1: 200, se tabell 2), som är specifika för den primära IgG subtypen, i 2-procentig (vikt/volym) BSA lösning i varje väl och inkubera i 1 h i rumstemperatur i mörkret.
    9. Tvätta cellerna med 300 µL av 0,05% Tween-20 i PBS lösning 3 gånger vid rumstemperatur i mörkret.
    10. Analysera de färgade cellerna genom fluorescensmikroskopi eller konfokalmikroskopi.
  3. Embryoid kropp bildandet
    1. Undersöka pluripotenta mänskliga ES/iPS celler genom embryoid kropp (EB) bildas på passager 10 och 20.
      Obs: Nära 80% sammanflödet i 6-väl plåtarna räcker för beredning av EB bildandet.
    2. Skölj mänskliga ES eller iPS-celler med 2 mL DMEM/F-12 media två gånger, och sedan fördjupa cellerna i 1,5 mL väsentliga 6 media.
    3. Skär nära 80% konfluenta mänskliga ES eller iPS celler i cirka 32 bitar använder 200 µL tips. Nästa, lossa cellerna från rätterna med hjälp av en cell-skrapa.
    4. Samla ihop mänskliga ES/iPS-celler och överföring till en 6-väl ultralåga fastsättning maträtt.
    5. Utbyta Essential 6 media genom pipettering gamla medier och lägga till färska media varje 2 dagar.
      Obs: Odla cellerna i suspension för 2 veckor vid 37 ° C med 5% CO2.
    6. När EBs inställdes likartad i väsentliga 6 media, överföra EBs till kultur på 24-väl TCP rätter överdragna med 0,1 vikt % gelatin och odla cellerna i väsentliga 6 media för ytterligare en vecka.
    7. Färga celler med antikroppar mot markörer för de celler som härrör från tre embryonala könsceller lager [AFP (endoderm), GFA (ektoderm), β III-Tubulin (ektoderm) och SMA (mesoderm)] och utvärdera cellerna genom immunfärgning metoden som beskrivs ovan.
  4. Teratoma bildandet
    1. Undersöka pluripotenta mänskliga ES/iPS celler genom teratoma bildas på passager 10 och 20.
      Obs: 5 rätter av nära 80% sammanflödet i 6 brunnar är tillräckliga för teratoma bildandet (minst 3 x 106 celler är nödvändiga för teratoma bildandet experiment).
    2. Skölj cellerna med 2 mL DMEM/F-12 media två gånger och sedan lägga 1,5 mL DMEM/F-12 media till cell kultur rätter.
    3. Skär nästan 80% konfluenta mänskliga ES eller iPS celler i cirka 32 bitar med hjälp av 200 µL tips. Nästa, lossa cellerna från rätterna med hjälp av en cell-skrapa.
    4. Samla in mänskliga ES/iPS-celler i en 15 mL centrifugering rör och centrifugera cellerna på 160 × g i 5 minuter vid 37 ° C.
    5. Efter centrifugering, avbryta cell pellets i 100 µL DMEM/F12 och sedan blanda cellen pellets med 100 µL Matrigel (1:1 volym-förhållande).
    6. Överföra cellsuspensionen i en-20 ° C nedkylda spruta. Injicera, sammanlagt minst 3 × 106 celler subkutant i manliga nicka-SCID (nicka. CB17 -Prkdascid/JNarl) möss (5-8 veckor).
    7. Efter 5-8 veckor, dissekera Teratom, fixa med 4,0% (vikt/volym) PARAFORMALDEHYD lösning och sedan förvaras vid 4 ° C.
    8. Fixa teratoma med paraffin, skiva de paraffin-inbäddat Teratom och fläcken med hematoxylin och eosin (H & E) använder ett standardprotokoll28,32.
      Obs: Forskare kan skicka fast teratoma vävnad till företaget att fixa Teratom med paraffin, skiva den paraffin-inbäddat Teratom, och färga provet med H & E som används vanligen vid Institutionen för patologi på sjukhus.
  5. Cellkultur mänskliga adipose-derived stem (annonser)
    1. Varma kultur media (DMEM som innehåller 1% antimycotic antibiotika och 10% fetalt bovint serum (FBS)), 0,25% av trypsin-EDTA och PBS till 37 ° C i ett vatten bad före användning.
    2. Tvätta mänskliga annonser celler genom pipettering 10 mL PBS i varje 6-cm kultur skålen där cellerna odlas.
    3. Tillsätt 1 mL av trypsin-EDTA-lösning (0,25%) i de 6 cm kultur rätterna och inkubera lösningen vid 37 ° C i 5 min.
    4. Iaktta cellerna i de 6 cm kultur rätterna under mikroskopi bekräfta att cellerna är fristående.
    5. Samla in cellerna i ett 15 mL centrifugrör och tillsätt en motsvarande volym av kultur media (DMEM som innehåller 1% antimycotic antibiotika och 10% FBS) i centrifugröret att neutralisera den trypsin-EDTA.
    6. Centrifugera cellerna vid 250 × g i 5 minuter vid 37 ° C.
    7. Efter centrifugering, Kassera supernatanten noggrant genom pipettering, utan att störa cellpelleten.
    8. Att resuspendera cellerna i kultur media, och sedan utsäde cellerna på den lämpliga djurtäthet (5-10 x 103 celler per cm2 för passaging eller som indikerade) till nya kultur rätter (P-IA hydrogels ympade med och utan oligopeptider och ECM).
  6. Mänskliga fostervatten stam (AFS) cellkultur
    1. Värma odling medier (DMEM/MCDB 201 (2:3) innehållande 20% fetalt bovint serum (FBS), 5 ng/mL bFGF och 1% antimycotic antibiotika), 0,25% av trypsin-EDTA och PBS till 37 ° C i ett vatten bad före användning.
    2. Tvätta mänskliga AFS celler genom pipettering 10 mL PBS i varje 6-cm kultur maträtt där cellerna odlas.
    3. Tillsätt 1 mL av trypsin-EDTA-lösningen (0,25%) till 6 cm kultur rätter och inkubera cellerna vid 37 ° C i 5 min.
    4. Observera att cellerna på 6 cm kultur rätter under mikroskopi bekräfta cellerna är fristående.
    5. Samla in cellerna i ett 15 mL centrifugrör och tillsätt en motsvarande volym av kultur media (DMEM/MCDB 201 (2:3) innehållande 20% fetalt bovint serum (FBS), 5 ng/mL bFGF och 1% antimycotic antibiotikum) i centrifugröret att neutralisera den trypsin-EDTA.
    6. Centrifugera cellerna vid 250 × g i 5 minuter vid 37 ° C.
    7. Efter centrifugering, Kassera supernatanten noggrant utan att störa cellpelleten genom pipettering.
    8. Att resuspendera cellerna i odling media och sedan utsäde cellerna på den lämpliga djurtäthet (5-10 x 103 celler per cm2 för passaging eller som indikerade) till nya kultur rätter (P-IA hydrogels ympade med och utan oligopeptide och ECM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P-IA hydrogels ympade med ECM-derived oligopeptide (oligoECM) eller ECM med olika elasticiteter var förberedda genom att följa reaktionsformel, som kan ses i figur 1A, använda olika typer av oligoECM (figur 1B). Elasticiteterna av hydrogels reglerades av tillämpad crosslinking intensiteten (tid) (figur 1 c). P-IA hydrogels ympade med Aktiebolaget Trav & galopp-derived oligopeptider, som har en lagring modulus 25,3 kPa (24 h crosslinking tid), stöds den långsiktiga kulturen av mänskliga iPS och ES-celler för över 10-20 stycken. Särskilt P-IA hydrogels ympade med ett gemensamt segment (P-IA-24h-VN1G) eller en dubbel kedja (P-IA-24h-VN2G) stöds pluripotenta mänskliga iPS och ES-celler, som var beredda med en relativt lägre koncentration av oligoECM (200-500 μg/mL) än P-IA-VN1 hydrogeler, som gjorde det nödvändigt med en hög koncentration av oligoECM (> 1000 μg/mL) för att upprätthålla pluripotenta mänskliga iPS och ES cells28,32.

Mänskliga ES-celler som underhålls på mus embryonala fibroblaster (MEFs) skiftades till kultur på andra syntetiserade beläggning material (t.ex., Synthemax II) belagd rätter och P-IA-24 h-VN1 hydrogel rätter (figur 2)28. Mänskliga ES-celler odlade på kommersiellt tillgängliga beläggning rätter befanns lättare skilja, särskilt vid kanten av kolonierna (figur 2a och 2 c), medan mänskliga ES-celler kunde underhålla deras pluripotency på P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogel rätter eftersom de differentierade cellerna inte kunde observeras från morfologi av mänskliga ES-celler på P-IA-24h-VN1-1000 hydrogel rätter (figur 2b och 2d)28.

Pluripotenta mänskliga ES (figur 3A) och iPS (figur 3B) celler odlade på P-IA - 24 h hydrogels ympade med oligoECM (P-IA-24 h-VN1-1000, P-IA-24 h-VN1G-1000 P-IA-24 h-VN2C), samt konventionella rekombinant Aktiebolaget Trav & galopp) rVitronectin)-belagd rätter, utvärderades baserat på uttrycket av pluripotenta maker proteiner (Nanog, Sox2 och Oct3/4) efter cellerna odlades på varje maträtt i xeno-fria förhållanden med väsentliga 8 media för 10 passager32. Dessa pluripotency proteiner uttrycktes på ett tillfredsställande sätt på mänskliga iPS och ES-celler odlade på P-IA hydrogels ympade med oligoECM samt på rVitronectin-belagda rätter i xeno-fria villkor.

Utvärdering av differentiering möjligheten in i cellerna härrör från tre groddar lager i vitro (EB bildande) och i vivo (teratoma bildande) är viktigt att kontrollera pluripotenta mänskliga ES och iPS-celler efter odling på syntetiska biomaterial. Därför mänskliga ES-celler (figur 4) och mänskliga iPS-celler (figur 5) odlades på P-IA-oligoECM hydrogel rätter och rekombinant Aktiebolaget Trav & galopp-belagd rätter för 10 passager, och därefter cellerna odlades i suspension till form EBs. EBs odlades vidare på gelatin-belagd rätter för ett par veckor att iaktta cellerna förmåga att sprida på rätter (figur 4A och figur 5A)32. Differentierade mänskliga ES (figur 4B) och iPS (figur 5B) celler var immunostained för protein som härrör från tre groddar lager: alfa-fetoprotein (AFP, endoderm), glatt muskulatur aktin (SMA, mesoderm) och glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande ektoderm)32. Både mänskliga iPS och ES-celler hittades differentieras till de celler som härrör från alla tre groddar lager, som anger en annan kontroll av pluripotenta mänskliga iPS och ES-celler, även efter odling på P-IA hydrogels ympade med oligoECM i xeno-free villkor på lång sikt (passage > 10 passager).

Differentiering förmåga mänskliga ES-celler in i cellerna som härstammar från tre groddar lager i vivo (teratoma bildandet assay) utvärderades också. Mänskliga ES-celler, som odlades på P-IA-VN1-1000 (figur 6A) och P-IA-VN2C-1000 (figur 6B) i xeno-fri odlingsbetingelser för 10 passager, skulle injiceras subkutant i NOD-SCID möss32. Teratom isolerades från möss och teratoma vävnadssnitt var fixeras och färgas med H & E (figur 6A och 6B)32. Teratom visas förekomsten av celler som härrör från alla tre groddar lager: endoderm (intestinal epitel, figur 6A(b) och 6B(b)), mesoderm (brosk, figur 6A(c) och 6B(c)) och ektoderm () neuroepithelium, figur 6A(d); pigmentepitelet, figur 6B(d)). Dessa resultat tyder på att mänsklig ES-celler odlade på P-IA-24h-VN1-1000 och P-IA-24h-VN2C-1000 i xeno-fria villkor för 10 passager kan differentieras till celler med ursprung från tre groddar lager, som anger att deras pluripotency upprätthålls i vivo.

Mänskliga AFS celler odlades också i oförändrad P-IA hydrogel, P-IA-oligoECM hydrogel och TCP rätter i expansion media. Figur 7 visar morfologier mänskliga AFS celler odlade efter fyra dagar av kultur i P-IA och P-IA-oligoECM hydrogel rätter med elasticiteter (E') av 12,2 (crosslinking tid = 6 h), 18,3 (crosslinking tid = 12 h), 25,3 (crosslinking tid = 24 h), och 30,4 kPa (crosslinking tid = 48 h) använder en oligoECM koncentration av 0 eller 50 μg/mL samt TCP rätter med 3-12 GPa stelhet30.

Mänskliga AFS celler kan inte föröka sig på P-IA hydrogel rätter med eller utan oligoECM när styvheten i den P-IA hydrogels var mindre än 11 kPa (PV - 2h, PV-2h-Y, PV - 4h och PV-4h-Y), medan mänskliga AFS celler kunde föröka sig med eller utan oligoECM när E' var större än 12 kPa, med undantag för de P-IA - 6 h och PV-IA-6 h-Kol1 hydrogel-rätterna. P-IA - 6h och P-IA-6h-Kol1 verkar inte vara gynnsamt för kulturen av mänskliga AFS celler eftersom de mjuka cell kultur biomaterial stoppa cellcykeln progression30.

Ovanstående resultat tyder på att P-IA hydrogel rätter är ett optimalt material för lång sikt stamceller odling och upprätthålla pluripotency av stamcellerna genom urval av specifika stelhet och oligoECM, samt optimal reaktion koncentrationen av oligoECM (surface täthet av oligoECM).

Figure 1
Figur 1: förberedelse av P-IA hydrogels ympade med oligoECM eller ECM. (A) systemet för reaktionen för P-IA hydrogels ympade med ECM och ECM-derived oligopeptide (oligoECM)29. Copyright 2015. Anpassad med tillstånd från The Royal Society of Chemistry. (B) Design och sekvens av oligopeptider ympade på P-IA hydrogels. Enda kedja oligopeptider (P-IA-BSP, P-IA-VN1, och P-IA-HBP1), enda kedja oligopeptider med ett gemensamt segment (P-IA-VN1G) och dubbla kedjor (P-IA-VN2C och P-IA-HBP2C) och ECM (P-IA-ECM) var ympade på P-IA hydrogels32. Anpassade under Creative Commons Attribution License. (C) stelhet av P-IA hydrogels utarbetats av olika perioder av crosslinking29. Copyright 2015. Anpassad med tillstånd från The Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: jämförelse av mänsklig ES cell kulturer på P-IA-24h-VN1 hydrogels och kommersiellt tillgängliga beläggning rätter. Morfologi av mänskliga ES-celler (WA09) odlas i kommersiellt tillgängliga beläggning (a, b) och P-IA-24 h-VN1-1000 (c, d) rätter på passage 1 när mänskliga ES-celler skiftades från odling på mus embryonala fibroblaster (MEFs) i odling på kommersiellt tillgängliga beläggning rätter eller PVA-24h-VN1-1000 rätter. Röda pilarna visar de differentierade mänskliga ES-cellerna. Skala staplarna visar 50 µm (a, b) och 100 µm (c, d)28. Anpassade under Creative Commons Attribution License. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: karakterisering av pluripotenta mänskliga ES och iPS-celler på P-IA hydrogels ympade med olika oligopeptide mönster. (A) uttryck för pluripotens proteiner Nanog (röd), Sox2 (grön) och Oct3/4 (grön) på humana ES (H9) blodkroppar analyseras av immunfärgning med dubbla färgning med Hoechest33342 för kärnkraft märkning (blå) efter odling på (en) P-IA-24h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000, och (c), P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels, och (d) rekombinant Aktiebolaget Trav & Galopp (rVitronectin)-belagda rätter xeno-fria villkor för 10 passager. (B) uttryck för pluripotens proteiner Nanog (röd), Sox2 (grön) och Oct3/4 (grön) på mänskliga iPS-celler som analyseras av immunfärgning med dubbla färgning med Hoechest33342 för kärnkraft märkning (blå) efter odling på (en) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogel, (b), P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogel och (c) rekombinant Aktiebolaget Trav & Galopp (rVitronectin)-hydrogels belagda rätter xeno-fria villkor för 10 passager32. Skala staplarna visar 50 µm. anpassas under Creative Commons Attribution License. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: karakterisering av differentiering förmåga mänskliga ES cells på P-IA hydrogels ympade med olika oligopeptide mönster. (A) morfologi av celler från EBs åtskilt från mänskliga ES (H9) celler efter odling på (en) P-IA-24 h-VN1-1000, (b) P-IA-24 h-VN1G-1000, och (c), P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels och (d) rekombinant Aktiebolaget Trav & Galopp (rVitronectin)-belagda rätter xeno-fria villkor för 10 passager. Skala staplarna visar 100 µm. (B) uttryck för en ektoderm protein (Fredsgenomförande, röd), mesoderm protein (SMA, grön) och endoderm protein (AFP, grön) i mänskliga ES (H9) celler utvärderas av immunfärgning med dubbla färgning med Hoechest33342 för kärnkraft märkning (blå) efter odling på P-IA-24h-VN1-1000 och P-IA-24h-VN1G-1000 P-IA-24h-VN2C-1000 hydrogels och på rekombinant Aktiebolaget Trav & Galopp (rVitronectin)-belagda rätter xeno-fria villkor för 10 passager32. Skala staplarna visar 50 µm. anpassas under Creative Commons Attribution License. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: karakterisering av differentiering förmåga mänskliga iPS celler på P-IA hydrogels ympade med olika oligopeptide mönster. (A) morfologi av celler från EBs åtskilt från mänskliga IPSC (HPS0077) efter odling på (en) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels, (b), P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels och (c) rekombinant Aktiebolaget Trav & Galopp (rVitronectin)- belagda rätter xeno-fria villkor för 10 passager. Skala staplarna visar 100 µm. (B) uttryck för en ektoderm protein (Fredsgenomförande, röd), mesoderm protein (SMA, grön) och endoderm protein (AFP, grön) i mänskliga iPS (HPS0077)-celler som analyseras av immunfärgning med dubbla färgning med Hoechest33342 för kärnkraft märkning (blå) efter odling på (en) P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels, (b), P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels och (c) rekombinant Aktiebolaget Trav & Galopp (rVitronectin)-belagda rätter xeno-fria villkor för 10 passager32. Skala staplarna visar 50 µm. anpassas under Creative Commons Attribution License. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Karakterisering av differentiering förmåga mänskliga ES (H9) celler i vivo efter odling på P-IA-24 h-VN1 och P-IA-24 h-VN2C hydrogels. (A) (en) bilden av en teratoma genom injektion med mänskliga ES-celler efter odling på P-IA-24 h-VN1-1000 hydrogels xeno-fri cell kultur villkor efter 10 passager. Vävnader, inklusive (b) intestinal epitel (endoderm), kan (c) brosk (mesoderm) och (d) neuroepithelium (ektoderm) observeras. (B) (en) bilden av en teratoma genom injektion med mänskliga ES-celler efter odling på P-IA-24 h-VN2C-1000 hydrogels xeno-fri cell kultur villkor efter 10 passager. Vävnader, inklusive (b) intestinal epitel (endoderm), kan (c) brosk (mesoderm) och (d) retinal pigmentepitel (ektoderm) observeras32. Skala staplarna visar 100 µm. anpassas under Creative Commons Attribution License. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: morfologi av mänskliga AFS celler odlas på TCP rätter och P-IA hydrogel rätter orörlig med eller utan ECM-derived oligopeptider efter 4 dagars kultur. (A) morfologi av mänskliga AFS celler på TCP rätter. (B) morfologi av mänskliga AFS celler på P-IA - 6 h och P-IA-6 h -Z hydrogel rätter (P-IA - 6 h, P-IA-6 h-Kol1-50, P-IA-6 h-FN1-50, P-IA-6 h-VN1-50, P-IA-6 h-HBP1-50 och P-IA-6 h-cRGD-50). (C) morfologi av hAFCs på P-IA - 12 h och P-IA-12 h -Z hydrogel rätter (P-IA - 12 h, P-IA-12 h-Kol1-50, P-IA-12 h-FN1-50, P-IA-12 h-VN1-50, P-IA-12 h-HBP1-50 och P-IA-12 h-cRGD-50). (D) morfologi av mänskliga AFS celler på P-IA - 24 h och P-IA-24 h -Z hydrogel rätter (P-IA - 24 h, P-IA-24 h-Kol1-50, P-IA-24 h-FN1-50, P-IA-24 h-VN1-50, P-IA-24 h-HBP1-50 och P-IA-24 h-cRGD-50). (E) morfologi av mänskliga AFS celler på P-IA - 48 h och P-IA-48 h -Z hydrogel rätter (P-IA - 48 h, P-IA-48 h-Kol1-50, P-IA-48 h-FN1-50, P-IA-48 h-VN1-50, P-IA-48 h-HBP1-50 och P-IA-48 h-cRGD-50). Skala staplarna visar 100 μm30. Copyright 2017. Anpassad med tillstånd från The Royal Society of Chemistry. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Namnet på Material / utrustning Förkortning
GTPGPQGIAGQRGVV KOL1
GACRGDCLGA Cyklisk RGD (cRGD)
KGGAVTGRGDSPASS FN1
EILDVPST CS1
KGGPQVTRGDVFTMP VN1
GKKQRFRHRNRKG HBP1
CGGGKKQRFRHRNRKG HBP2C
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP VN1G
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP VN2C
Aktiebolaget Trav & galopp rVN
Fibronektin FN

Tabell 1: ECM-derived oligopeptide sekvenser och ECM som används i denna studie.

Antikroppar Koncentration (spädning)
Nanog 1: 200
SSEA4 1: 200
OCT3/4 1: 200
Sox2 1: 200
Glatt muskulatur aktin 1: 200
(Α-SMA) 1: 200
AFP 1: 200
FREDSGENOMFÖRANDE 1: 200
Alexa Fluor 555 – konjugerad get antimus 1: 200

Tabell 2: Antikroppar används för immunfärgning i denna studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

P-IA-oligoECM och P-IA-ECM hydrogels med varierande stelhet utvecklades för långsiktig utbyggnad av mänskliga ES och iPS-celler att upprätthålla deras pluripotency för över tio passager i xeno-fria förhållanden, liksom för kulturen av mänskliga AFS celler, annonser celler, och hematopoetiska stamceller25,28,32. P-IA hydrogels orörlig med oligoECM är en utmärkt kandidat för cell odling material att undersöka effekten av cell kultur material på ödet för differentiering och spridning av olika typer av stamceller som primära celler och cancerceller.

P-IA lösningen ska vara transparent, när P-IA lösning är gjuten på rätterna. Crosslinking tiden beslutar crosslinking intensiteten av P-IA hydrogels. 24 h crosslinking av P-IA hydrogeler ger optimal hydrogeler för mänsklig ES/iPS cellkultur. Eventuella oligopeptider och ECMs kan ympas på P-IA hydrogels använder det här protokollet, där de oligopeptider och ECMs har fria aminogrupper25,28,29,30,31, 32. Ytors oligopeptider eller ECMs kan upptäckas med röntgen fotoelektronen spektroskopi (XPS) mätningar, även XPS inte kan uppvisa ett absolut värde av Ytors, men förekomsten av oligopeptider eller ECMs kan vara säkert analyseras.

P-IA hydrogels med och utan ympade oligopeptider eller ECMs kan förberedas, som har lagring modulus från 3-30 kPa, beroende på vilken crosslinking tid. Det är ganska svårt att förbereda P-IA hydrogeler att ha mindre lagring modulus än 3 kPa och högre lagring modulus än 30 kPa25,28,29,30,31,32. Detta är en begränsning av den nuvarande hydrogel förberedelse metoden av kemiska crosslinking av P-IA hydrogels. Detta protokoll ger dock ett annat alternativ av de hydrogeler att ha olika elasticitet, som kan stödja kulturen av primära celler, cancerceller eller stamceller inklusive mänskliga ES och iPS-celler, men är inte gjorda av polyakrylamid. Särskilt, mänskliga ES och iPS-celler kan inte föröka sig på polyakrylamid hydrogels, men kan föröka sig på P-IA hydrogels som visas i figur 2, figur 3, bild 4, bild 5och figur 6. Faktiskt stödde P-IA-24h-VN1 hydrogels mänskliga ES cellkultur bättre än kommersiellt tillgängliga beläggning rätter (figur 2). P-IA hydrogeler är därför att föredra för kultur av mänskliga ES och iPS-celler.

Det skulle vara intressant att undersöka optimal elasticitet av hydrogels där mänskliga ES och iPS-celler är differentierade i specifika härstamningar celler såsom hjärtmuskelcellerna35, retinal pigment epitel36, β celler6och TH + celler6 för framtida utveckling av regenerativ medicin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning var delvis stöds av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan under grant nummer 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 och 104-2221-E-008-107-MY3. Denna forskning stöddes också av Taiwan Landseed Hospital Project (NCU-LSH-105-A-001). Ett bidrag för vetenskaplig forskning (nummer 15K 06591) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan är också erkänt. A. Higuchi vill erkänna för den internationella vetenskapliga Partnership-Program (ISPP-0062) Vice rektoratet för forskarutbildning och forskning, King Saud University, Riyadh 11451, Saudiarabien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GTPGPQGIAGQRGVV PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: Cyclic RGD, cRGD
GACRGDCLGA PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: FN1
KGGAVTGRGDSPASS PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: CS1
EILDVPST PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1
KGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP1
GKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKG PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Oligopeptide
Abbreviation: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMP PH Japan none Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: rVN
Vitronectin Thermo Fisher scientific A14700 Specification: Extracellular matrix
Abbreviation: FN
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006 Specification: Commercially available coating material
Abbreviation: Synthemax II
Synthemax II Corning 3535 Specification: Polymer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acid Japan VAM & Poval AF-17 Specification: Chemical
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 Specification: Chemical
Na2SO4 Sigma-Aldrich 239313 Specification: Chemical
H2SO4 Sigma-Aldrich 339741 Specification: Chemical
Abbreviation: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E7750 Specification: Chemical
Abbreviation: NHS
N-hydroxysuccinimide Sigma-Aldrich 56480 Specification: Chemical
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Specification: Chemical
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Specification: Cell culture consumable
Cell scraper Corning 3008 Specification: Cell culture consumable
Dispase II Sigma-Aldrich SI-D4693 Specification: Cell culture medium
Essential 6 Thermo Fisher scientific A1516401 Specification: Cell culture medium
Essential 8 Thermo Fisher scientific A1517001 Specification: Cell culture medium
DMEM/F12 Thermo Fisher scientific 11330-032 Specification: Cell culture medium
DMEM Thermo Fisher scientific 12800-017 Specification: Cell culture medium
MCDB 201 Sigma-Aldrich M6770 Specification: ES cell
Human ES cell WiCell Research Institute, Inc.. WA09 Specification: iPS cell
Human iPS cell Riken Cell Bank HS0077 Specification: 35 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353001 Specification: 60 mm
Abbreviation: TCP
TCP dish Corning 353002 Specification: 24 well dish
24 well dish Corning 353047 Specification: Blocking agent
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A8806 Specification: Detection reagent
Alkaline phosphatase live stain Thermo Fisher scientific A14353 Specification: Detection reagent
Hematoxylin & eosin Sigma-Aldrich 1.05175 Specification: EB formation dish
6-well ultralow attachment dish Corning 3471 Specification: Coating material
gelatin Sigma-Aldrich G9391 Specification: Coating material
Matrigel Corning 354230 Specification: Mice
NOD-SCID mice National Applied Research Laboratories None Specification: Serum
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1A Specification: Antibiotic
antimycotic antibiotic Thermo Fisher scientific 15240-062 Specification: Antibody
Antibody for Nanog Invitrogen MA1-017 Specification: Antibody
Antibody for SSEA4 Abcam ab16287 Specification: Antibody
Antibody for OCT3/4 Invitrogen PA5-27438 Specification: Antibody
Antibody for Sox2 Invitrogen 48-1400 Specification: Antibody
Antibody for Smooth Muscle Actin Invitrogen PA5-19465 Specification: Antibody
Antibody for AFP Invitrogen PA5-21004 Specification: Antibody
Antibody GFAP Invitrogen MA5-15086 Specification: Antibody
Alexa Fluor 555 – conjugated Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A-21422 Specification: Antibody
Alexa Fluor 488 – conjugated Goat anti-Rabbit antibody Invitrogen A-11008 Specification: Antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493 (2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778 (2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312 (2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136 (2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647 (2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146 (2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

Tags

Bioteknik fråga 132 Hydrogel inducerade pluripotenta stamceller embryonala stamceller elasticitet cellodling oligopeptide ytmodifiering nanosegment
Mänskliga pluripotenta stamceller kultur på Polyvinyl alkohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels med varierande stelhet Xeno-fria villkor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., … More

Sung, T. C., Li, H. F., Higuchi, A., Ling, Q. D., Yang, J. S., Tseng, Y. C., Pan, C. H. P., Alarfaj, A. A., Munusamy, M. A., Kumar, S., Hsu, S. T., Murugan, K. Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions. J. Vis. Exp. (132), e57314, doi:10.3791/57314 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter