Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/57322
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

Summary

Dit protocol laat de lezer om te analyseren bile salt-geïnduceerde biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers met behulp van een veelzijdige aanpak om vast te leggen van het dynamische karakter van het bacteriële biofilms door beoordeling van de naleving, extracellulaire stof van polymere matrix vorming, en dispersie.

Abstract

Biofilm vorming is een dynamische, meertraps proces dat zich in bacteriën onder strenge milieu-omstandigheden of in tijden van stress voordoet. Voor zuurbestendige ziekteverwekkers, wordt een aanzienlijke stress-respons veroorzaakt gastro-intestinale onderweg en bij gal blootstelling, een normaal onderdeel van menselijke spijsvertering. Om te overwinnen de bactericide effecten van gal, vormen vele darmen ziekteverwekkers een biofilm hypothetische zodat overleven wanneer bij het transitovervoer door de dunne darm. Hier presenteren we methoden om te definiëren van biofilm vorming door naleving van de solid-phase assays evenals extracellulaire polymere stof (EPS) matrix detectie en visualisatie. Bovendien wordt biofilm dispersie beoordeling gepresenteerd waarmee de analyse van gebeurtenissen triggering release van bacteriën tijdens de infectie wordt nagebootst. Kristalviolet kleuring wordt gebruikt voor het detecteren van aanhangend bacteriën in een high-throughput 96-wells-plaat naleving assay. EPS-productie beoordeling wordt bepaald door twee tests, namelijk microscopie kleuring van de EPS-matrix en semi-kwantitatieve analyse met een polysaccharide fluorescently-geconjugeerde bindend lectine. Ten slotte wordt biofilm dispersie gemeten door middel van de graven van de kolonie en beplating. Positieve gegevens uit meerdere tests ondersteunen de karakterisatie van biofilms en kan worden gebruikt om het identificeren van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming in andere bacteriestammen.

Introduction

Biofilm formatie is een belangrijke bacteriële overlevingsstrategie geïnduceerde tijdens Barre milieu omstandigheden. Blootstelling aan bactericide verbindingen zoals antibiotica of veranderingen in voedingsstoffen of zuurstof beschikbaarheid induceert een gespannen staat in bacteriën die kan worden verlicht door vorming van biofilms. Een biofilm wordt gekenmerkt door bacteriële gehechtheid aan een oppervlak of andere bacteriën en wordt begeleid door de afscheiding van een matrix van de EPS-voornamelijk samengesteld uit polysacchariden1,2,3. Biofilm vorming is een dynamisch proces waarin een cascade van gebeurtenissen in de vorming van een volwassen aanhangend bacteriële Gemeenschap1,2,3 culmineert. Bacteriën produceren adhesines om vroege bijlage terwijl shifting adhesine gen expressieprofielen ter versterking van de bijlage tijdens biofilm rijping. EPS-productie komt tegelijkertijd jas de bacteriële Gemeenschap in een matrix te beschermen de cellen van de eerste stressor. Bacteriën die deel uitmaakt van de biofilm zijn traag groeiende; en als zodanig, maakt de meeste antibiotica ondoeltreffend. Bovendien, de trage groei bespaart energie tot omstandigheden veranderen om de gunst van de bacteriële groei1,2,3. Na de barre omstandigheden zijn verstreken, bacteriën verspreiden de biofilm en een planktonische levensstijl1,2,3te hervatten. Traditioneel, biofilms zijn waargenomen op oppervlakken en vertegenwoordigen een persistente klinische uitdaging als gevolg van infectie reservoirs aanwezig op katheters en in-woning apparaten1,2,3.

Biofilm vorming werd onlangs beschreven voor verschillende darmen ziekteverwekkers; bacteriën die de dunne darm of dikke darm4 infecteren. Voor Shigella soorten, infectie treedt op in de menselijke darm na een doorvoer over de meerderheid van het maag-darmkanaal. Tijdens de passage door de dunne darm, is Shigella blootgesteld aan gal; een lipide-vernederende wasmiddel uitgescheiden naar de darm te vergemakkelijken van vertering van lipiden terwijl het tegelijkertijd het doden van de meeste bacteriën5. Darmen ziekteverwekkers hebben een unieke vermogen om te weerstaan aan het bactericide effect van gal6. Onze recente analyse gebruikt in vivo-als combinaties van glucose en galzouten om aan te tonen van robuuste biofilm vorming in S. flexneri en andere soorten Shigella, pathogene Escherichia colien Salmonella4. Eerder, Salmonella enterica serovar Typhi bleek te vormen van een biofilm gal-geïnduceerde als gevolg van de unieke kolonisatie van de galblaas bij chronische infectie7,8,9, 10. Daarnaast voorafgaande onderzoek met Vibrio11en Campylobacter12 biofilm vorming in reactie op Gal aangetoond. Dus, de analyses uitgebreid de gal-geïnduceerde biofilm vorming opmerkingen bij andere ziekteverwekkers en helpen om de demonstratie van een reactie van de geconserveerde darmen pathogen op Gal. In tegenstelling tot chronische biofilms waarin bacteriële gene transcriptie is beperkt en cel senescentie kan het optreden van1,2,3, stellen wij voor dat de darmen, gal-geïnduceerde biofilm meer voorbijgaande aard is. Dit van voorbijgaande aard, virulente biofilm is hallmarked door een snelle demontage (zoals gezien in de dispersie-assay) en verbeterde virulentie genexpressie waargenomen in de biofilm bevolking4,6. 

Zoals biofilm vorming is een veelzijdige, dynamische proces en het gebruik van galzouten zoals een activerende factor alleen al recent beschreven voor meest darmen ziekteverwekkers, zijn tools en technieken gebruikt unieke en creatieve toepassingen van traditionele methoden. Dus, hier gepresenteerd zijn drie gratis strategieën te kwantificeren van enkele belangrijke kenmerken van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming, met inbegrip van bacteriële aanhankelijkheid, productie van de EPS-matrix, en de dispersie van levensvatbare bacteriën uit de biofilm. Deze technieken hebben gebruikt voornamelijk voor onderzoek met Shigella; en daarom, evaluatie van andere zuurbestendige ziekteverwekkers optimalisatie kan vereisen. Echter positieve gegevens uit alle drie tests ondersteunen identificatie van biofilms en reproduceerbare protocollen voor bile salt-geïnduceerde biofilm vorming stellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van reagentia

  1. Galzouten medium: resuspendeer ter voorbereiding al soja Bouillon (TSB) met 0,4% galzouten (gewicht/volume), 200 mg van galzouten in 50 mL gesteriliseerde met autoclaaf TSB. Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter. Maak wekelijks vers medium.
    Opmerkingen: De galzouten routinematig gebruikt is een 1:1 mengsel van natrium cholate en natrium deoxycholate van schapen en runderen gallbladders geïsoleerd. Zoals aangetoond eerder4, was de aanwezigheid van glucose nodig voor bile salt-geïnduceerde biofilm vorming. TSB heeft toegevoegd glucose ten opzichte van Luria Bertani (LB) Bouillon; en daarom was voldoende voor het opwekken van biofilm vorming in Shigella en de andere zuurbestendige pathogenen geanalyseerd. Afhankelijk van de bacteriën te analyseren, zou de concentratie van de verschillende glucose of verschillende suiker eisen nodig zijn.
  2. 0,5% w/v kristalviolet in water: los 2,5 g kristalviolet in 500 mL gedistilleerd water. Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter.
  3. Concanavalin A (ConA) geconjugeerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC): reconstrueren van de voorraad in 1 x PBS. Verdun de voorraad 10 mg geconcentreerd met 400 μL van 1 x PBS tot een uiteindelijke concentratie van 25 µg/mL, en beschermen tegen licht.
  4. PBS + Glucose: Ontbinden 0.2 g glucose in 10 mL 1 x PBS (2% w/v glucose definitief). Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter. Vers maken op de dag van gebruik.
  5. PBS + galzouten: Los op 40 mg in 10 mL 1 x PBS (0,4% w/v galzouten definitief). Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter. Vers maken op de dag van gebruik.
  6. PBS + glucose en galzouten: Los 40 mg galzouten en 0.2 g glucose in 10 mL 1 x PBS (0,4% w/v galzouten en 2% w/v glucose definitief). Filter steriliseren met behulp van een 0,22 µm filter. Vers maken op de dag van gebruik.
  7. Bereiden LB agar platen.
  8. Formaldehyde/Glutaaraldehyde fix: 810 toevoegen µL formaldehyde (stockoplossing van 37%, 3% eindconcentratie) en 125 µL Glutaaraldehyde (stockoplossing van 25%, de definitieve concentratie van 0,25%) naar 14 mL 1 x PBS. Meng en bewaren bij 4 ° C. De correctie moet koud voor correct gebruik.
    Let op: De correctie is giftig en gevaarlijk afval vereist.
  9. Antifade inbedmiddel oplossing: gebruik antifade inbedmiddel oplossing met 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) vlek te remmen photobleaching immunefluorescentie microscopie monsters terwijl fluorescently kleuring van het DNA van de bacterie.

2. voorbereiding van bacteriën

  1. Groeien overnachting culturen van de bacteriestammen te worden getest door het enten van 3 mL TSB met een enkele, goed geïsoleerde kolonie in een steriele cultuur buis. Incubeer bij 37 ° C met schudden bij 225 t/min voor overnachting incubatie (16-24 uur).
    Opmerking: Stammen moeten worden restreaked uit diepvries voorraden elke 2 tot 4 weken, en behouden op platen niet meer dan 2 weken oud.

3. solid-phase naleving Assay

Opmerking: Deze test kwantificeert aanhangend bacteriën met behulp van de methode van een 96-wells-plaat. Bacteriën worden statisch gekweekt in platte bodem platen. Wassen wordt uitgevoerd als u wilt verwijderen niet-aanhanger bacteriën en aanhangend bacteriën zijn gekleurd met crystal violet. De vlek kristalviolet peptidoglycaan bindt in de bacteriële celwand en kan worden solubilized met behulp van ethanol. Het aantal aanhangend bacteriën wordt bepaald op basis van kristalviolet retentie.

  1. Instellen twee 1,5 mL tubes. Label met TSB of TSB + galzouten (BS).
  2. Voeg 1 mL TSB of TSB + BS de respectieve buizen.
  3. Inoculeer buizen met 20 µL van overnachting cultuur (op een 1:50 verdunning).
  4. In een steriele, duidelijk, platbodem, weefselkweek behandeld 96-wells-plaat, voeg toe 130 µL per putje van niet-geënte control media aan drie putjes om te dienen als de blanco-controle. Instellen van drie controleputjes voor elk mediatype (TSB en TSB + BS) worden getest.
  5. Toevoegen van 130 µL per putje van geënte cultuur in drie putten, en herhaal tot alle experimentele omstandigheden zijn verguld in drievoud.
  6. Incubeer gedurende 4-24 uur bij 37 ° C statisch.
  7. Met behulp van een afleesapparaat, opnemen de OD600. Instellen van de controleputjes als 'leeg'. Bevestig dat het besturingselement medium is duidelijk met geen bewijs van turbiditeit. Als elke troebelheid wordt gedetecteerd, gooi het experiment. De OD-600 -waarden kunnen worden gebruikt om te normaliseren van de gegevens als er aanzienlijke verschillen in groei tussen bacteriestammen.
  8. Verwijder het kweekmedium met behulp van een vacuüm lijn door zachtjes het kantelen van de plaat en langzaam aspirating het medium aan de onderste rand van de put. Zorg ervoor dat alle het kweekmedium verzamelen zonder het verstoren van de aanhangend bacteriële bevolking gelegen op het plastic oppervlak. Als EPS-matrix werd geproduceerd tijdens de incubatietijd, zal de matrix als een witte neerslag worden gevisualiseerd. De EPS-matrix niet storen.
  9. Voorzichtig wassen de putjes eenmaal met 200 µL steriele PBS. Verwijder de PBS wassen met behulp van de vacuüm lijn.
  10. Omkeren van de plaat om te drogen. Toestaan dat een minimum van 20 minuten drogen.
    Opmerking: Omdat de biofilm moet grondig worden gedroogd alvorens de kleuring, het protocol kunnen onderbroken bij deze stap voor een paar uur of zelfs 's nachts. De toegevoegde droogtijd doet geen afbreuk aan de kleuring procedure terwijl onvolledig drogen zal invloed hebben op de kwantificering van de resultaten en de reproduceerbaarheid.
  11. Voeg 150 µL van 0,5% kristalviolet aan elk experimentele en controle ook.
  12. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  13. Was de putjes eenmaal met 400 µL van gedistilleerd water. Het toegevoegde volume helpt bij het verwijderen van residuele kristalviolet vlek uit de zijkanten van de putten. Verwijder het wassen met de vacuüm lijn.
  14. Was de putjes vijfmaal met 200 µL van gedistilleerd water. Verwijder het wassen met de vacuüm lijn.
    Opmerking: Grondig wassen is belangrijk voor kwantificering. Wanneer de lege putten blijkt uit het gedestilleerd water zijn en geen eventuele resterende kristalviolet vlek bevatten, gaat u verder met de volgende stap.
  15. Omkeren van de plaat te droog, beschermd tegen licht. Zorgen voor volledige droging van de plaat zoals hierboven vermeld.
  16. Destain de putjes met 200 µL van 95% ethanol. Incubeer de plaat op het schudapparaat gedurende 30 minuten. Voorkom verdamping, vooral bij hogere temperaturen, waarnemen zulks trede bij 4 ° C.
  17. Met behulp van een afleesapparaat, opnemen de OD540.
    Opmerking: De golflengte voor maximale extinctie van kristalviolet is in de buurt van 590 nm. De literatuur meldt een bereik van OD540 - OD5954,13,14,15,16 voor kristalviolet absorptie; dus kies een golflengte beschikbaar op basis van de afleesapparaat.

4. EPS-Matrix detectie

Opmerking: Deze gratis testen kwantificeren en visualiseren van de EPS. In beide, wordt EPS gedetecteerd met behulp van een lectine binden polysacchariden. Het eiwit fluorescently-geconjugeerde kunt kwantificering (stap 4.1) of visualisatie (stap 4.2).

  1. Semi-kwantitatieve detectie van EPS
    1. Instellen twee 1,5 mL tubes. Label met TSB of TSB + BS.
    2. Voeg 1 mL TSB of TSB + BS de respectieve buizen.
    3. Inoculeer buizen met 20 µL van overnachting cultuur (een 1:50 verdunning).
    4. In een steriele, zwart, platbodem, weefselkweek behandeld 96-wells-plaat, voeg toe 130 µL per putje van niet-geënte control media aan drie putjes om te dienen als de blanco-controle. Instellen van drie controleputjes voor elk medium type te beproeven. Breng 130 µL per putje van geënte cultuur in de putjes, en herhaal tot alle experimentele omstandigheden zijn verguld in drievoud.
    5. Incubeer gedurende 4-24 uur bij 37 ° C statisch.
    6. Het kweekmedium overbrengen in een duidelijk 96-wells-plaat met een pipet, idealiter een meerkanaalspipet. Wees voorzichtig om te verzamelen van alle het kweekmedium zonder het verstoren van de aanhangend bevolking en/of het EPS gelegen op het plastic oppervlak. Gereserveerd.
    7. De zwarte plaat gedurende 15 minuten op 200 µL per putje van de formaldehyde/Glutaaraldehyde met 1 x PBS RT vaststellen.
    8. Terwijl de aanhangend bevolking is vaststelling, evalueren het supernatant fractie uit stap 4.1.6. Met behulp van een afleesapparaat, opnemen de OD600. Instellen van de controleputjes als 'leeg'. Bevestig dat het besturingselement medium is duidelijk met geen bewijs van turbiditeit. Als elke troebelheid wordt gedetecteerd, gooi het experiment.
      1. Als alternatief kan de gehele bepaling worden uitgevoerd in een zwarte duidelijk bodemplaat. In deze omstandigheden de600 OD-waarden kunnen worden opgenomen en het kweekmedium kan vervolgens worden verwijderd voordat u doorgaat naar stap 4.1.7. De OD-waarden voor600 kunnen worden gebruikt voor het normaliseren van de gegevens in het geval er zijn belangrijke verschillen in groei tussen bacteriestammen.
    9. Verwijder de correctie en gooi in het gevaarlijk afval.
    10. Voorzichtig wassen de putjes tweemaal met 200 µL per putje van steriele PBS. Verwijder de PBS wassen met behulp van de vacuüm lijn door zachtjes het kantelen van de plaat en langzaam aspirating het wassen aan de onderste rand van de put.
    11. Voeg 150 µL per putje van 25 µg/mL ConA-FITC en incubeer gedurende 15 minuten op RT.
    12. Voorzichtig wassen tweemaal met 200 µL van PBS.
    13. Voeg 150 µL van PBS toe aan elk putje. Opnemen van de fluorescentie bij 488 nm.
  2. Confocale microscopie Visualisatie van EPS-productie en berekening van biofilm dikte
    1. Instellen twee 1,5 mL tubes. Label met TSB of TSB + BS.
    2. Voeg 1 mL TSB of TSB + BS de respectieve buizen.
    3. Inoculeer buizen met 20 µL van overnachting cultuur (op een 1:50 verdunning).
    4. Instellen een steriele 24-well-bord met 12 mm ronde glazen coverslips steriel. Voeg toe 400 µL per putje van niet-geënte control media aan drie putjes om te dienen als de blanco-controle. Instellen van drie controleputjes voor elk medium type te beproeven.
    5. Voeg toe 400 µL van geënte cultuur aan putjes in tweevoud, en herhaal tot alle experimentele omstandigheden zijn verguld.
    6. Incubeer gedurende 4-24 uur bij 37 ° C statisch.
    7. Visueel bevestigen groei in de TSB voorwaarde, groei en EPS neerslag in de TSB (wit) + BS voorwaarde, en geen groei en/of witte neerslag in steriele-controleputjes. Verwijder het supernatant.
    8. Positiebepaling voor 15 min op RT 200 µL per putje van formaldehyde/Glutaaraldehyde oplossing met 1 x PBS.
    9. Verwijder de correctie en gooi in gevaarlijke afvalstoffen.
    10. Voorzichtig wassen de putjes tweemaal met 200 µL per putje van steriele PBS. Verwijder de PBS wassen met behulp van de vacuüm lijn.
    11. Voeg 150 µL per putje van 25 µg/mL ConA-FITC en incubeer gedurende 15 minuten op RT.
    12. Voorzichtig wassen tweemaal met 200 µL per putje van PBS.
    13. Monteren met antifade inbedmiddel oplossing met DAPI.
      Opmerking: De oplossing is een oplossing van de kant en klare, glycerol gebaseerde mount met DAPI voor het behoud van het fluorescerende label terwijl gelijktijdig de kleuring van het DNA in bacteriecellen voor visualisatie als een counterstain. Volg de kit aanwijzingen en aanbevelingen voor incubatie tijden voorafgaand aan imaging van monsters. De DAPI kleuring van de procedure kan worden uitgevoerd alvorens antifade inbedmiddel oplossing die geen DAPI bevat.
    14. Evalueren door confocale microscopie. Op een confocal microscoop, stelt u de laser op 495 nm/519 nm excitatie/emissie voor FITC visualisatie. Een tweede laser ingesteld op 360 nm/460 nm excitatie/emissie te visualiseren DAPI. Zoek de biofilm door te focussen op de DAPI-kanaal. Zowel de FITC de DAPI kanalen gebruiken om de volledige dikte bepalen en instellen van de bovenste en lager imaging grenzen. Volledige dikte Z-stack beelden registreren door het vastleggen van beelden, wordt elke 0,25 µm zodra planimetrische weergave is ingesteld op de boven- en onderkant van de z-stack. Meer informatie over confocale microscopie, Raadpleeg voor publicaties door Paddock et al. 17 , 18 , 19 , 20
    15. Het reconstrueren van de 3D-beelden in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) voor het visualiseren van de volledige biofilm vorming en berekenen de biofilm dikte. De gemiddelde dikte verkregen voor S. flexneri gal-zout geïnduceerde biofilms was 14 µm4.

5. dispersie Assay

Opmerking: In deze test, de demontage van biofilm door bacteriële dispersie wordt gedetecteerd. Hier zijn volwassen biofilms zijn gevestigd en vervolgens (meestal de volgende dag), de media met PBS worden vervangen of aangevuld PBS. Het supernatant component wordt vervolgens beoordeeld om te kwantificeren van het aantal bacteriën die hebben losgekoppeld van de biofilm.

  1. Instellen twee 1,5 mL tubes. Label met TSB of TSB + BS.
  2. Voeg 1 mL TSB of TSB + BS de respectieve buizen.
  3. Inoculeer buizen met 20 µL van overnachting cultuur (op een 1:50 verdunning).
  4. In een steriele, duidelijk, platbodem, weefselkweek behandeld 96-wells-plaat, voeg toe 130 µL per putje van niet-geënte control media aan drie putjes om te dienen als de blanco-controle. Instellen van drie controleputjes voor elk mediatype te beproeven.
  5. 130 µL per putje van geënte cultuur toevoegen aan drie putten, en herhaal tot alle experimentele omstandigheden zijn verguld in drievoud.
  6. Incubeer de plaat voor 4-24 uur bij 37 ° C statisch.
  7. Voordat u verdergaat, warm de PBS, PBS + glucose, PBS galzouten, en PBS + galzouten + glucose tot 37 ° C. Deze reagentia vers dagelijks voor te bereiden.
  8. Met behulp van een afleesapparaat, opnemen de OD600. Instellen van de controleputjes als 'leeg'. Bevestig dat het medium is duidelijk met geen bewijs van turbiditeit. Als elke troebelheid wordt gedetecteerd, gooi het experiment. De OD-600 -waarden kunnen worden gebruikt om te normaliseren van de gegevens als er aanzienlijke verschillen in groei tussen bacteriestammen.
  9. Verwijder het kweekmedium via een vacuüm-lijn. Zorg ervoor dat alle het kweekmedium verzamelen zonder het verstoren van de aanhangend bevolking gelegen op het plastic oppervlak.
  10. Voorzichtig wassen de putjes tweemaal met 200 µL per putje van steriele PBS. Verwijder de PBS wassen met behulp van de vacuüm lijn.
  11. Vervang de wash met 130 µL per putje van de volgende handelingen uit in elk drie putten: PBS, PBS + glucose, PBS galzouten, en PBS + galzouten + glucose. Deze reagentia moeten voorverwarmde tot 37 ° C.
  12. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  13. Verwijder voorzichtig de plaat van de 37 ° C incubator. Het supernatant overbrengen in een frisse, steriele 96-wells-plaat.
  14. Met behulp van een 96-wells-plaat of verdunning-blok, 10-fold bereiden (1:10) seriële verdunningen van het supernatant in steriele PBS.
    Opmerking: De verdunningsreeks moeten variëren van onverdunde tot 10-6 afhankelijk van de bacteriële stam te beproeven. Proefprojecten kunnen worden uitgevoerd om te bepalen van de optimale verdunningsreeks.
  15. 5 µL van elke verdunning op LB agar met behulp van een meerkanaalspipet plaat met steunkleuren. Incubeer bij 37 ° C's nachts. Telling kolonies op de volgende dag en de account voor de verdunningsfactor bij het bepalen van de herstel kolonievormende eenheden (kve). Als u wilt berekenen de percentage dispersie ten opzichte van de 1 x PBS-controle (ingesteld op 100%), verdeel het herstel CFU van elke behandeling voorwaarde door de terugwinning CFU uit de 1 x PBS controlemonster.
    Opmerking: Routine media platen voor de bacteriële stam van belang kunnen ook worden gebruikt. Shigella kan bijvoorbeeld worden verguld op Congo red platen. Zorgen dat de platen zijn droog voor geschikte plek-plating technieken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In Figuur 1, wordt biofilm vorming veroorzaakt in de meeste van de zes darmen ziekteverwekkers geteste volgende groei in media met galzouten. Een aanzienlijke toename van de aanhangend bacteriën nadat galzouten blootstelling wordt waargenomen in bijna alle stammen getest. De uitzondering is de enteroaggregative E. coli (EGA); nochtans, merken op de geïnduceerde observatie van de Δaaf mutant4. De resultaten wijzen erop dat de naleving van de aanvullende mechanismen worden veroorzaakt door blootstelling van de galzouten in EGA-bij gebrek aan naleving van de aggregative fimbria ik (AAF / ik)21. Conclusies trekken uit deze gegevensset, uitzetten van de OD-waarden voor elke stam en media type540 getest. De waarden van elke stam in de controle op de gegevensdragers te vergelijken (-BS) ten opzichte van de media die galzouten zal bepalen als de galzouten aanzienlijk biofilm vorming induceren. Vergelijkingen tussen bacteriestammen en/of mutanten kunnen ook worden uitgevoerd voor verdere karakterisering analyses.

De ConA-FITC-beoordeling van EPS wordt gepresenteerd in Figuur 2. Figuur 2A vertegenwoordigt de semi-kwantitatieve beoordeling van EPS-productie waarin ConA-FITC wordt gebruikt om de biofilms vlek. De ConA bindt aan de polysacharide in de EPS-matrix en het bedrag gehandhaafd wordt gedetecteerd door een fluorescerende afleesapparaat. Presenteren van de gegevens, de gemiddelde fluorescentie-eenheden voor elke voorwaarde uitzetten en vergelijken de biofilm-inducerende voorwaarden voor de negatieve controle. Bovendien kunnen vergelijkingen tussen bacteriestammen of mutanten worden uitgevoerd. Het is cruciaal voor het analyseren van een media-only, negatieve controle om te bepalen van het bedrag van de achtergrond ConA-FITC-fluorescentie die voor de plaat optreedt. De TSB voorwaarde was niet significant verschillend van de controle op de gegevensdragers, terwijl de fluorescentie lezingen aanzienlijk verhoogde volgende galzouten blootstelling. De gegevens bevestigen dat de EPS-productie is een indicatie van biofilm vorming en treedt niet op bij gebrek aan galzouten bij S. flexneri. De beelden van bile salt-geïnduceerde biofilms in S. flexneri is vertegenwoordigd in figuur 2B. ConA-FITC wordt gebruikt om de vlek polysacchariden in de EPS-matrix, terwijl een DAPI-counterstain wordt gebruikt voor het visualiseren van de bacteriën door de kleuring van het DNA. Voor bacteriën niet blootgesteld aan galzouten (negatieve controle), wordt alleen de DAPI ontdekt. Met name, is de dichtheid van bacteriën veel lager dan in de galzouten voorwaarde. Een duidelijke achtergrond op de FITC-kanaal wordt verkregen om aan te geven van het gebrek aan productie van de EPS. Zoals verwacht, aantonen de gegevens dat EPS-productie is gecorreleerd met biofilm vorming1,2,3 na galzouten blootstelling. De ConA - kleuring controle in de gal zout-behandelde steekproeven die aantonen van de specificiteit van de FITC-fluorescentie. Voor deze beelden, 1 x PBS werd gebruikt in plaats van ConA-FITC en de DAPI counterstain werd gehandhaafd. Beeldvorming kan worden uitgevoerd met een confocal microscoop te beoordelen van de dikte van biofilms met de EPS-positieve monsters4.

Bacteriële dispersie van biofilms in Figuur 3 wordt gedetecteerd door drachtige gevestigde biofilms in PBS of aangevuld PBS. Fysiologisch, Gal is geabsorbeerd in de dunne darm in het verkeer en slechts 5% van de Gal voert de dubbele punt5. Zoals Shigella de Colon epitheel binnenvalt, we veronderstellen dat reabsorptie van Gal is een belangrijk signaal voor de biofilm dispersie. In deze figuur, dispersie treedt op in biofilms blootgesteld aan PBS of PBS + glucose; echter, de dispersie in PBS + galzouten ongeacht de aanwezigheid van glucose wordt geremd. De gegevens tonen aan dat de verwijdering van galzouten is noodzakelijk en voldoende zijn voor het opwekken van dispersie van S. flexneri van biofilms bile salt-geïnduceerde4. U wilt de gegevens uitzetten, kunnen ofwel de herstelde CFU van de bacteriën of de relatieve procent naar het besturingselement (zoals hier) worden uitgezet.

Figure 1
Figuur 1: galzouten induceren biofilm vorming in de darmen pathogenen. 18 h biofilms werden geteeld op Weefselkweek behandeld 96-wells-platen in of TSB of TSB + 0,4% galzouten media en bevlekt met 0,5% crystal violet. Kwantitatieve waarden van ethanol solubilisatie van de vlek kristalviolet werden vastgesteld door spectrofotometrie bij OD540. Galzouten blootstelling aanzienlijk verhoogd biofilm vorming in Shigella flexneri, S. dysenteriae, enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhi en S. enterica serovar Typhimurium. Statistische significantie werd bepaald door de student T-test voor elke stam vergelijken de galzouten behandeling de mediabeheer. De standaardfout van het gemiddelde (SEM) wordt vertegenwoordigd door de foutbalken. Alle p-waarden zijn < 0,0001. Gegevens zijn uit een (n = 3) vertegenwoordiger experiment, met een volledige set van gegevens die in een eerdere publicatie4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Bile salt-geïnduceerde biofilm formatie wordt gekenmerkt door de productie van een EPS-matrix die is gedetecteerd met FITC-label Concanavalin A. (A) steriel zwart, 96-wells-plaat waren bezaaid met S. flexneri op een 1:50 verdunning in TSB of TSB + galzouten en geteeld voor 18 h. Biofilms werden vastgesteld, voorzichtig gewassen, en gebeitst met ConA-FITC. Het bedrag van de ingehouden Concanavalin-A FITC werd bepaald door een fluorescerende afleesapparaat. De waarden die zijn uitgezet, tonen EPS kwantificering na groei van S. flexneri gegroeid in TSB of TSB-bevattende galzouten. Significantie werd bepaald door one-way ANOVA en p -waarden zijn < 0,01. De SEM wordt vertegenwoordigd door de foutbalken. Gegevens zijn uit een (n = 3) vertegenwoordiger experiment, met een volledige set van gegevens die in een eerdere publicatie4. (B) microscopie beelden van een biofilm Shigella bile salt-geïnduceerde. Steriele coverslips waren bezaaid met S. flexneri op een 1:50 verdunning in TSB of TSB + galzouten en geteeld voor 18u. De coverslips werden vervolgens vast en gekleurd met ConA-FITC en/of counterstained met DAPI. ConA-FITC was alleen gedetecteerd in de galzouten toestand als gevolg van de aanwezigheid van de EPS-matrix. Een dekglaasje aan gekleurd alleen met DAPI in de TSB + galzouten behandeling werd gebruikt om aan te tonen van minimale achtergrond fluorescentie voor de FITC-instelling op de confocal microscoop. Images voor elk kanaal golflengte en een samengestelde overlay worden voorzien voor alle omstandigheden van de behandeling. Schaal staven geven 10 µm. gegevens zijn uit een (n = 3) vertegenwoordiger experiment, met een volledige set van gegevens die in een eerdere publicatie4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: analyse van bacteriële dispersie van bile salt-geïnduceerde biofilms. 18 h bile salt-geïnduceerde Shigella flexneri biofilms werden blootgesteld aan PBS of PBS aangevuld met glucose, galzouten, of een combinatie van glucose en galzouten. De bovendrijvende substantie werd vervolgens serieel verdund en vergulde op agar platen bij het inventariseren van de kolonievormende eenheden (CFUs), die de biofilm verspreid. Het aantal bacteriën hersteld was uitgezet ten opzichte van de PBS-controle. Bacteriën verspreid ten opzichte van de biofilm in de PBS of PBS + glucose voorwaarden, maar de aanwezigheid van galzouten was voldoende voor de remming van bacteriële dispersie van de biofilm. Gegevens zijn uit een (n = 3) vertegenwoordiger experiment, met een volledige set van gegevens die in een eerdere publicatie4. Ter referentie, werden 100-fold meer bacteriën routinematig teruggevorderd van de PBS controle behandeling (ongeveer 7 x 107 CFU) in vergelijking met de PBS + galzouten behandeling (ongeveer 7 x 105 CFU). Significantie werd bepaald door one-way ANOVA en p -waarden zijn < 0,0001. De SEM wordt vertegenwoordigd door de foutbalken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analyse van biofilm vorming is uitdagend vanwege de dynamische aard van biofilms en de variabiliteit tussen de stammen, materialen, laboratoria en testen. Hier zijn verschillende strategieën om te bepalen van biofilm vorming in de darmen ziekteverwekkers na galzouten blootstelling met experimentele inzicht geboden ter bevordering van de reproduceerbaarheid gepresenteerd. Er zijn aanvullende overwegingen om de reproduceerbaarheid. Eerst en vooral, is het raadzaam voor het uitvoeren van ten minste drie onafhankelijke experimenten elk met technische triplicates ter bevestiging van waarnemingen en statistische significantie als gevolg van de variatie die kan optreden. Ten tweede, is het gebruik van positieve en negatieve controles onontbeerlijk om de reproduceerbaarheid van de test. Het is sterk aanbevolen om het gebruikt van de wild type-stam als positieve controle bij het evalueren van mutanten voor biofilm vorming. Bovendien, zoals genen die belangrijk voor de vorming van de biofilm zijn worden geïdentificeerd (bijvoorbeeld Zie Vibrio22, Salmonella7en E. coli23,24,25), het gebruik van biofilm mutanten als negatieve controles zullen valideren de reproduceerbaarheid van de test. Ten derde, de bovenstaande methoden zijn gebaseerd op gericht onderzoek met Shigella en S. flexneri, in het bijzonder. Aanpassingen van de protocollen mogelijk afhankelijk van de groei-eisen voor elke darmen pathogen geëvalueerd. Ten vierde, de testen meten een bacteriële stress-respons; en daarom is het essentieel om mee te werken op de juiste manier onderhouden bacteriën uit bevroren voorraden (-80 ° C) of opslag platen gedurende niet meer dan twee weken in de koelkast (maximaal 4 ° C). Het is belangrijk op te merken dat sommige bacteriën die met inbegrip van de darmen ziekteverwekkers in het geslacht Yersinia zijn psychrotrophs die bij temperaturen dicht bij 0 ° C26 groeien kunnen. Aangezien de opslag gekoelde temperatuurflexibel kunt wijzigen van de bacteriële fysiologie en eventueel leiden tot genotypische of fenotypische verschuivingen27,28,29, het sterk aanbevolen is om het bereiden van aliquots van het voorraadculturen bij-80 ° C voor routinematige inoculatie in starterculturen. Bovendien vereist werken met klinische isolaten meer frequente restreaks uit-80 ° C voorraden zoals genetische verschuivingen snel waargenomen zijn wanneer het transitioning een klinisch afkomstige bacteriële stam in het laboratorium instellen van30,31 . Met name werken met Shigella isoleert, stammen snel aanpassen en fenotype verschuivingen optreden vaak32,33. Het is aanbevolen om restreak bacteriën uit diepvries voorraden zodra een maand, en restreak de voorraad om de twee weken plaat.

Een andere belangrijke factor om de reproduceerbaarheid is verse bereiding van de galzouten media te beperken van de variabiliteit van de bepaling. Galzouten media ouder dan 1 week beïnvloed negatief het robuuste fenotype waargenomen met verse media voorbereiding. Bovendien, afhankelijk van het pathogene agens en het soort blootstelling te worden geanalyseerd (dunne darm ten opzichte van de dikke darm), verschillende bronnen en mengsels van galzouten kunnen nodig zijn. Bijvoorbeeld individuele galzouten, geconjugeerd en-geconjugeerd bronnen, of ruwe gal extracten die extra gal onderdelen bevatten zoals cholesterol en bilirubine mogelijk gebruikt5,6. Shigella analyses hebben gericht op bacteriële aanpassing naar de host tijdens het transport van de dunne darm voorafgaand aan de infectie in de dikke darm. Daarom is het gebruik van een mengsel van cholate en deoxycholate bootst voorwaarden van de dunne darm5,6,34. Ook met betrekking tot de dispersie assay (sectie 5), is het bepaald dat de reagentia PBS-aangevuld worden vers dagelijks gemaakt en vooraf opgewarmd tot 37 ° C voorafgaand aan assay. Toen reagentia ouder dan een paar dagen werden gebruikt, reproduceerbaarheid van de test ernstig in gevaar was. Het was ook van cruciaal belang vooraf deze reagentia tot 37 ° C warm zoals dispersie zich niet voor gemakkelijk bij kamertemperatuur reagentia. Tenslotte, dispersie methoden voor de beoordeling van de titer van de volledige opsomming van de biofilm kunnen gebruikt worden, waaronder ultrasoonapparaat35,36 of enzymatische spijsvertering37. De aanpak van de dispersie bepaling was gericht op de beoordeling van het effect van gal zout reabsorptie als Shigella transits van de terminal ileum en in de dikke darm. De analyse was gebaseerd op de hypothese dat het verlies van galzouten dispersie van de voorbijgaande biofilm mogelijk maken zou en dat Shigella moet verspreiden de biofilm voorafgaand aan infectie veroorzaakt in het Colon epitheel4,5 . Aandoeningen zoals ultrasoonapparaat en enzymatische spijsvertering vertegenwoordigen totale release van microbiële massa van de biofilm, terwijl de hier gepresenteerde strategie de ileum om de overgang van de dikke darm emuleert te vangen een fysiologische fenotype voor Shigella. Afhankelijk van de gewenste experimentele omstandigheden, kunnen de aanvullende methoden voor analyse of biofilm opsomming van de dispersie worden verlangd.

De tests zijn ontworpen om matig hoge-doorvoer met het gebruik van 96-wells-platen om testen van meerdere bacteriestammen en/of voorwaarden. Teneinde verdere reproduceerbaarheid van biofilm vorming, werden platbodem, 96-wells-platen die Weefselkweek behandeld waren gebruikt. Om technische redenen meten niet plaat lezers absorptie of fluorescentie in ronde bodem platen nauwkeurig. Bovendien, niet gestreken platen aangeboden variabele naleving profielen in Shigella, oftewel een avenue van lopend onderzoek. De tests kunnen worden geschaald naar grotere goed formaten proportioneel, maar de wijzigingen van het protocol die experimentele efficiëntie verminderen kunnen zal vereisen. Bijvoorbeeld, moet de media cultuur worden overgezet naar cuvettes opnemen van de OD-waarden voor600 met een spectrofotometer. Bovendien, de kristalviolet gebeitste biofilm kan worden geschraapt stap na een incubatie van 30-60 min in de 95% ethanol destain en de inhoud kunnen worden overgebracht naar een cuvet voor spectrofotometer lezingen op OD540. Wees voorzichtig wanneer de inhoud van de biofilm in elk putje sloop te vermijden spatten, en we hebben ontdekt dat sloop gemakkelijker na een incubatie van 60 min.

Analyse met Shigella, Salmonella, en pathogene E. coli4 aangetoond een herhaalde observatie dat biofilm vorming in een versnelde tijdschaal (binnen 24u) voor zuurbestendige ziekteverwekkers blootgesteld aan galzouten optreedt. In tegenstelling tot andere bacteriën die vereisen van 48 tot 72 h te observeren biofilm vorming onder normale omstandigheden, begint bile salt-geïnduceerde darmen biofilm zo spoedig 4 h met de naleving van de eerste fase. Vervolgens, EPS-matrix vorming is duidelijk door de 6 h en rijping plaatsvindt door 24 h. Zo mogelijk het fenotype van de naleving op 24 h te robuust te ontcijferen van de rol van de naleving van de verschillende factoren bij de vorming van biofilms. Uitvoeren van vroege analyses, zorgt bijvoorbeeld zo spoedig 4 h, voor identificatie van factoren belangrijk zijn in de vroege biofilm formatie die anders zouden worden gemist op een later tijdstip. Tot slot, en zoals hierboven vermeld in het protocol stappen, is bile salt-geïnduceerde biofilm formatie voor Shigella niet aangetroffen bij gebrek aan glucose4. Aangezien de EPS-matrix voornamelijk uit polysacchariden bestaat en een cruciale stap in de biofilm formatie voor de meeste bacteriën38 is, is de aanwezigheid van glucose of andere suiker in de media het waarschijnlijk belangrijk te observeren biofilm vorming. Afhankelijk van de bacteriële ziekteverwekker geanalyseerd, kunnen verschillende basis media formuleringen worden verlangd.

Biofilm vorming is een meerdere lagen proces dat vaak voorkomt in een open systeem waar nutriënten flux en vloeiende bewegingen gemakkelijk optreden van1,2,3. De methoden worden begrensd door de gesloten cultuur en statische groei eisen; echter inschakelen de methoden beoordeling van biofilm vorming in het laboratorium-omgeving. Bij de identificatie van het fenotype van de biofilm, verdere experimenten met behulp van vloeibare cellen of continu cultuur strategieën39,40,41 kan extra mechanistische inzicht verschaffen fysiologische of klinische betekenis van de biofilm vorming. Voor de identificatie van de EPS-matrix, de protocollen gebruiken de polysaccharide-bindend lectine ConA. ConA bindt α-D-glucosyl of sterically-nauw verwante residuen42. Verschillende lectines kunnen worden verlangd afhankelijk van type van EPS geproduceerd voor verschillende geslachten of soorten. Een alternatieve strategie te identificeren van EPS-productie is de Spectrometrie van de massa, die beide verificatie bieden zal dat EPS wordt geproduceerd en bepalen van de samenstelling van de EPS-matrix43,44. Bovendien kan het gebruik van de DAPI counterstain leiden tot significante helderheid, gezien het aantal bacteriën in de biofilm of het vóórkomen van extracellulaire DNA die vaak aanwezig is in de EPS-matrix45,46.

Er zijn alternatieven voor de bovenstaande methoden beschreven in de literatuur. De solid-phase bindende bepaling is bijvoorbeeld gemeld voor gebruik in andere ziekteverwekkers (bijvoorbeeld verwijzingen4,25,47,48,49). Er zijn wijzigingen in het protocol tussen publicaties; en daarom zijn de strategieën gepresenteerde een gemakkelijk-aan-repliceren-indeling. Het is belangrijk op te merken dat de protocollen opgeven droging biofilms voorafgaand aan (stap 3.10) kleuring, terwijl sommige groepen verkiezen om op te lossen van biofilms. De twee verschillende benaderingen kunnen vertegenwoordigen verschillende pathogeen-specifieke strategieën. Bovendien, door het opstellen van de vlek kristalviolet in water, werd een consistente biofilm vorming fenotype ontdekt. Andere groepen kunnen ethanol solubilize kristalviolet; waarvoor Shigella, geleid tot destabilization van biofilms en reproduceerbaarheid in gevaar gebracht. We zijn momenteel onderzoek naar de factoren die mogelijk de biofilm Shigella oplosbaarin ethanol. Een ander voorbeeld is de kwantificering van de EPS-productie door ConA kleuring. Een 96-wells-plaat fluorescerende detectiemethode (stap 4.1) is bedoeld om te bepalen van semi-kwantitatieve waarden als gevolg van de hoeveelheid FITC-geconjugeerd ConA binding aan de biofilm. Om onze kennis is de methode de eerste keer dat deze strategie heeft gemeld. EPS-detectie via microscopisch onderzoek in de literatuur wordt geaccepteerd en zorgt voor een verschillende, maar gratis, strategie om te visualiseren van EPS. De semi-kwantitatieve fluorescentie detectie gecombineerd met de confocal microscopische detectie van EPS zeker versterkt de gegevens, met name gezien de beperkingen van de DAPI counterstain procedure in de analyse van de microscopie hierboven beschreven. In totaal is een belangrijke kracht in de reeks van tests die hier beschreven dat elke techniek is een aanvulling op een andere aanpak om te leiden tot een dynamische beoordeling van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming in de darmen ziekteverwekkers.

Zoals galzouten en virulente biofilms zijn opgenomen in het paradigma van darmen bacteriële pathogenese, verwacht wordt dat deze methoden worden gebruikt voor het valideren van modellen, rollen van specifieke genen te identificeren identificeren van genen van onbekende functie en bieden algemene karakterisering van klinische stammen. Deze veelzijdige aanpak maakt het mogelijk de identificatie van genen belangrijk in een aspect van biofilm formatie die kan worden verloren keer de volwassen biofilm is gevestigd, daarom waardoor identificatie van de gespecialiseerde functies van elke bacteriële component van de biofilm. Bovendien, zoals blijkt uit het feit dat pathogen aanpassing binnen de menselijke darm een snel voorkomende fenomeen is, is de rol van biofilm bile salt-geïnduceerde vorming een voorbeeld van een nieuw gewaardeerd, geconserveerde en kritische verschijnsel dat zich in voordoet Shigella infectie evenals extra darmen ziekteverwekkers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

Acknowledgments

Wij danken Rachael B. Chanin en Alejandro Llanos-Chea voor technische bijstand. Wij danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski en Bobby Cherayil voor de spanningen in deze studie gebruikt. Dit werk werd gesteund door het nationale Instituut van allergie en besmettelijke ziekten Grant K22AI104755 (C.S.F.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One 655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. delaL., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), 992-6, 998-1002, 1004 (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-4, 646, 648 (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis? Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , Elsevier Science. (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
  48. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Tags

Immunologie en infecties probleem 135 de vorming van de Biofilm darmen ziekteverwekkers Shigella gal galzouten EPS-matrix dispersie
Bile Salt-geïnduceerde Biofilm vorming in de darmen pathogenen: technieken voor de identificatie en kwantificering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, K. P., Faherty, C. S.… More

Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter