Summary
Detta protokoll gör det möjligt för läsaren att analysera galla salt-inducerad biofilm bildning i enteriska patogener använder en mångfacetterad strategi för att fånga den dynamiska karaktären av bakteriell biofilm genom att bedöma följsamhet, extracellulära polymera substansen matrisen bildande, och spridning.
Abstract
Biofilm bildning är en dynamisk, flerstegs process som sker i bakterier under svåra miljöförhållanden eller tider av stress. För enteriska patogener induceras en betydande stress svar under gastrointestinal transit och vid galla exponering, en normal del av mänskliga matsmältningen. För att övervinna de bakteriedödande effekten av galla, bildar många enteriska patogener en biofilm som hypotes för att tillåta överlevnad när transiteras genom tunntarmen. Här presenterar vi metoder för att definiera biofilm bildning genom fasta fasen följsamhet analyser samt extracellulära polymera ämne (EPS) matrix upptäckt och visualisering. Dessutom presenteras biofilm dispersion bedömning för att efterlikna analys av händelser som utlöser frisättning av bakterier under infektionsprocessen. Kristallviolett färgning används för att upptäcka vidhäftande bakterier i en hög genomströmning plattan med 96 brunnar följsamhet-analys. EPS-produktion bedömning bestäms av två analyser, nämligen mikroskopi färgning av EPS-matrisen och semikvantitativ analys med en fluorescently-konjugerad polysackarid bindning lectin. Slutligen, biofilm dispersion mäts genom kolonin räknas och plätering. Positiva data från flera analyser stöder karakterisering av biofilmer och kan användas för att identifiera galla salt-inducerad biofilm bildning i andra bakteriestammar.
Introduction
Biofilm bildning är ett viktigt bakteriell överlevnadsstrategi inducerad under svåra miljöförhållanden. Exponering för bakteriedödande föreningar som antibiotika eller förändringar i näringsämne eller syre tillgänglighet inducerar ett stressat tillstånd i bakterier som kan lindras genom biofilm bildning. En biofilm kännetecknas av bakteriell fäste på en yta eller andra bakterier och åtföljs av utsöndringen av en EPS matris huvudsakligen består av polysackarider1,2,3. Biofilm bildning är en dynamisk process där en kaskad av händelser kulminerar i bildandet av en mogen vidhäftande bakteriell gemenskapen1,2,3. Bakterier producerar adhesiner för att underlätta tidig fastsättning medan skiftande adhesin gen uttryck profiler för att stärka fastsättning under biofilm mognad. Samtidigt uppstår EPS produktion till pälsen en matris bakteriell gemenskapen att skydda celler från den inledande stressfaktor. Bakterier som finns i biofilmen är långsamt växande; och som sådan gör de flesta antibiotika ineffektiva. Dessutom sparar den långsamma tillväxten energi tills förutsättningarna förändras för att gynna bakterietillväxt1,2,3. Efter de hårda villkoren har passerat, bakterier skingra biofilmen och återuppta en plankton livsstil1,2,3. Traditionellt biofilmer observeras på ytor och representerar en ihållande kliniska utmaning på grund av infektion reservoarer på katetrar och i-bostad enheter1,2,3.
Biofilm bildning beskrevs nyligen för flera enteriska patogener. bakterier som infekterar tunntarmen eller tjocktarmen4. För Shigella arterna, uppstår infektion i människors kolon efter en transitering genom majoriteten av mag-tarmkanalen. Under passagen genom tunntarmen, är Shigella utsatt för galla; ett lipid-förnedrande rengöringsmedel som utsöndras till tarmen att underlätta matsmältningen av lipider medan samtidigt dödar de flesta bakterier5. Enteriska patogener har en unik förmåga att motstå de bakteriedödande effekten av galla6. Vår senaste analys utnyttjas i vivo-gillar kombinationer av glukos och gallsalter att demonstrera robusta biofilm bildning i S. flexneri samt andra arter av Shigella, patogena Escherichia colioch Salmonella4. Tidigare, Salmonella enterica serovar Typhi visades att bilda en galla-inducerad biofilm på grund av unika koloniseringen av gallblåsan under kronisk infektion7,8,9, 10. Dessutom tidigare forskning med Vibrio11och Campylobacter12 visat biofilm bildning svar på galla. Därför analyser extended galla-inducerad biofilm bildning observationerna andra patogener och bidra till att upprätta demonstration av ett bevarat enteriska patogener svar på galla. Till skillnad från kronisk biofilmer där bakteriell gentranskription är begränsad och cellen åldras kan förekomma1,2,3, föreslår vi att den enteriska galla-inducerad biofilmen är mer övergående. Detta övergående, virulenta biofilm är tillverkas av en snabb demontering (som sett i dispersion-analysen) och förbättrad virulens genuttryck hos biofilm befolkningen4,6.
Biofilm bildning är en mångsidig, dynamisk process och användning av gallsalter som en inledande faktor har endast nyligen beskriven för mest enteriska patogener, är de verktyg och tekniker som används unika och kreativa program av traditionella metoder. Därför är presenteras här tre gratis strategier att kvantifiera flera viktiga egenskaper hos galla salt-inducerad biofilm bildning, inklusive bakteriell vidhäftning, produktion av EPS-matrisen och spridning av livskraftiga bakterier från biofilmen. Dessa tekniker har använts främst för forskning med Shigella; och utvärdering av andra enteriska patogener kan därför kräva optimering. Trots positiva data från alla tre analyser stödja identifiering av biofilmer och upprätta reproducerbara protokoll för galla salt-inducerad biofilm bildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av reagens
- Gallsalter medium: för att förbereda tryptic soy buljong (TSB) som innehåller 0,4% gallsalter (vikt/volym), Återsuspendera 200 mg av gallsalter i 50 mL Ånghärdad TSB. Filter sterilisera med 0,22 µm filter. Se färska medium varje vecka.
Anteckningar: Gallsalter som rutinmässigt används är en 1:1 blandning av natrium cholate och natriumdeoxikolat isolerade från får och nötkreatur gallbladders. Som visat tidigare4, krävdes förekomst av glukos för galla salt-inducerad biofilm bildning. TSB har lagt till glukos i förhållande till Luria-Bertani (LB) buljong; och därför var tillräcklig för att framkalla biofilm bildas i Shigella och de andra enteriska patogener som analyseras. Beroende på bakterier som ska analyseras, kan olika glukos koncentrationer eller olika socker krav behövas. - 0,5% w/v kristallviolett i vatten: Lös 2,5 g kristallviolett i 500 mL destillerat vatten. Filter sterilisera med 0,22 µm filter.
- Concanavalin A (ConA) konjugerat med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC): Bered beståndet i 1 x PBS. Späd 10 mg koncentrerad beståndet med 400 μL 1 x PBS till en slutlig koncentration av 25 µg/mL, och ljuskänsligt.
- PBS + glukos: Lös 0,2 g glukos i 10 mL 1 x PBS (2% w/v glukos slutlig). Filter sterilisera med 0,22 µm filter. Gör fräsch dag användning.
- PBS + gallsalter: Lös upp 40 mg i 10 mL 1 x PBS (0,4% w/v gallsalter slutlig). Filter sterilisera med 0,22 µm filter. Gör fräsch dag användning.
- PBS + glukos och gallsalter: Lös upp 40 mg gallsalter och 0,2 g glukos i 10 mL 1 x PBS (0,4% w/v gallsalter och 2% w/v glukos slutlig). Filter sterilisera med 0,22 µm filter. Gör fräsch dag användning.
- Förbereda LB agarplattor.
- Formaldehyd/glutaraldehyd KORRIGERA: Lägg till 810 µL formaldehyd (37% stamlösning, 3% koncentration) och 125 µL glutaraldehyd (25% stamlösning, 0,25% slutlig koncentration) till 14 mL 1 x PBS. Blanda väl och förvara vid 4 ° C. Fix bör kalla för korrekt användning.
Försiktighet: Fix är giftiga och kräver omhändertagande av farligt avfall. - AntiFade monteringsmedel lösning: Använd antifade monteringsmedel lösning innehållande 4,6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) fläcken för att hämma fotoblekning Immunofluorescerande mikroskopi prover samtidigt fluorescently färgning DNA från bakterier.
2. beredning av bakterier
- Växa över natten kulturer de bakteriestammar ska testas genom att vaccinera 3 mL TSB med en enda, väl isolerad koloni i en steril kultur tub. Inkubera vid 37 ° C under skakning på 225 rpm för natten inkubation (16-24 h).
Obs: Stammar bör vara restreaked från frysen bestånd varje 2 till 4 veckor, och underhållna på plattorna inte mer än 2 veckor gamla.
3. fasta fasen följsamhet Assay
Obs: Denna analys kvantifierar vidhäftande bakterier med en metod som plattan med 96 brunnar. Bakterier odlas statiskt i platt botten pläterar. Tvättning utförs för att ta bort icke-anhängare bakterier och vidhäftande bakterier färgas med kristallviolett. Kristallviolett fläcken binder peptidoglykan i den bakteriella cellväggen och kan vara solubilized med etanol. Antalet anhängare bakterier bestäms utifrån kristallviolett retention.
- Ställa in två 1,5 mL rör. Etikett med TSB eller TSB + gallsalter (BS).
- Tillsätt 1 mL TSB eller TSB + BS till respektive rören.
- Inokulera tuber med 20 µL av övernattning kultur (1:50 utspädning).
- I en steril, klar, flatbottnad, vävnadsodling-behandlade plattan med 96 brunnar, lägga till 130 µL per brunn av uninoculated kontroll media i tre brunnar som blankprovet. Ställa in tre kontrollbrunnar för varje medietyp (TSB och TSB + BS) ska testas.
- Lägg till 130 µL per brunn av inokulerade kultur i tre brunnar, och upprepa tills alla experimentella förhållanden är klädd i tre exemplar.
- Inkubera i 4-24 h vid 37 ° C statiskt.
- Med en spektrofotometer, registrera OD600. Ange kontrollbrunnarna som 'tomma.' Bekräfta det kontroll mediet är klart utan tecken på grumlighet. Om eventuella grumlighet upptäcks, kassera experimentet. OD600 -värdena kan användas för att normalisera data om det finns betydande skillnader i tillväxttakt mellan bakteriestammar.
- Ta bort odlingssubstratet med en vakuum linje genom att försiktigt luta plattan och aspirera långsamt mediet vid den nedre kanten av brunnen. Tänk att samla alla odlingssubstratet utan att störa den vidhäftande bakteriepopulation ligger på plastytan. Om EPS-matris producerades under inkubationstiden, kommer matrisen visualiseras som en vit fällning. Stör inte EPS matrisen.
- Försiktigt Tvätta brunnarna en gång med 200 µL sterilt PBS. Ta bort PBS tvätten med hjälp av dammsugaren.
- Vänd på plattan torka. Möjliggöra ett minimum av 20 min att torka.
Obs: Eftersom biofilmen måste torkas ordentligt innan färgning, protokollet kan vara pausad i detta steg för några timmar eller ens över natten. Den extra torktiden kommer inte att ändra färgningsproceduren medan ofullständig torkning kommer att påverka kvantifieringen av resultat och reproducerbarhet. - Tillsätt 150 µL 0,5% kristallviolett till varje experimentella och kontroll väl.
- Inkubera i 5 minuter i rumstemperatur (RT).
- Tvätta brunnarna en gång med 400 µL destillerat vatten. Den extra volymen hjälper till att avlägsna kvarvarande kristallviolett fläcken från sidorna av brunnarna. Ta bort tvätten med dammsugaren.
- Tvätta brunnarna fem gånger med 200 µL destillerat vatten. Ta bort tvätten med dammsugaren.
Obs: Grundlig tvättning är viktigt för kvantifiering. När de tomma brunnarna är framgår av destillerat vatten och inte innehåller någon kvarstående kristallviolett fläcken, fortsätta till nästa steg. - Vänd på plattan torka, skyddas från ljus. Säkerställa fullständig torkning av plattan som nämnts ovan.
- Avfärga brunnarna med 200 µL 95% etanol. Inkubera plattan på skakapparaten i 30 min. För att undvika avdunstning, särskilt vid högre temperaturer, utföra det här steget vid 4 ° C.
- Med en spektrofotometer, registrera OD540.
Obs: Våglängden för maximal absorbans kristallviolett är nära 590 nm. Litteraturen rapporterar ett intervall från OD540 - OD5954,13,14,15,16 för kristallviolett absorbansen; alltså välja en våglängd som är tillgängliga baserat på plattan läsaren.
4. EPS Matrix upptäckt
Obs: Dessa gratis analyser kvantifiera och visualisera EPS. I båda upptäcks EPS med hjälp av en lektin för att binda polysackarider. Proteinet fluorescently-konjugerad tillåter kvantifiering (steg 4.1) eller visualisering (steg 4.2).
- Halvkvantitativ detektion av EPS
- Ställa in två 1,5 mL rör. Etikett med TSB eller TSB + BS.
- Tillsätt 1 mL TSB eller TSB + BS till respektive rören.
- Inokulera tuber med 20 µL av övernattning kultur (1:50 utspädning).
- I en steril, svart, flatbottnad, vävnadsodling-behandlade plattan med 96 brunnar, lägga till 130 µL per brunn av uninoculated kontroll media i tre brunnar som blankprovet. Ställa in tre kontrollbrunnar för varje medium som ska testas. Lägga till 130 µL per brunn av inokulerade kultur i brunnarna och upprepa tills alla experimentella förhållanden är klädd i tre exemplar.
- Inkubera i 4-24 h vid 37 ° C statiskt.
- Överföra odlingssubstratet till en tydlig 96-well platta med en pipett, helst en flerkanalspipett. Vara försiktig att samla alla odlingssubstratet utan att störa den vidhäftande befolkningen eller EPS ligger på plastytan. Ställ åt sidan.
- Fixa den svarta plåten i 15 min på RT med 200 µL per brunn av den formaldehyd/glutaraldehyd i 1 x PBS.
- Medan den vidhäftande befolkningen är fastställande, utvärdera den supernatant fraktionen från steg 4.1.6. Med en spektrofotometer, registrera OD600. Ange kontrollbrunnarna som 'tomma.' Bekräfta det kontroll mediet är klart utan tecken på grumlighet. Om eventuella grumlighet upptäcks, kassera experimentet.
- Alternativt kan hela analysen utföras i en svart klart bottenplatta. Under dessa omständigheter OD600 -värdena kan registreras och odlingsmediet kan kastas därefter innan du fortsätter till steg 4.1.7. OD600 -värdena kan användas för att normalisera data i fall det finns betydande skillnader i tillväxttakt mellan bakteriestammar.
- Ta bort korrigeringsfilen och släng i farligt avfall.
- Försiktigt Tvätta brunnarna två gånger med 200 µL per brunn av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Ta bort PBS tvätten med hjälp av dammsugaren genom att försiktigt luta plattan och aspirera långsamt tvätten på den nedre kanten av brunnen.
- Tillsätt 150 µL per brunn på 25 µg/mL ConA-FITC och inkubera i 15 min på RT.
- Försiktigt tvätta två gånger med 200 µL av PBS.
- Tillsätt 150 µL av PBS till varje brunn. Spela in fluorescensen på 488 nm.
- Konfokalmikroskopi visualisering av EPS-produktion och beräkning av biofilm tjocklek
- Ställa in två 1,5 mL rör. Etikett med TSB eller TSB + BS.
- Tillsätt 1 mL TSB eller TSB + BS till respektive rören.
- Inokulera tuber med 20 µL av övernattning kultur (1:50 utspädning).
- Ställa in en steril 24-well platta med 12 mm steril runda glas coverslips. Lägga till 400 µL per brunn av uninoculated kontroll media i tre brunnar som blankprovet. Ställa in tre kontrollbrunnar för varje medium som ska testas.
- Tillsätt 400 µL av inokulerade kultur till brunnar i två exemplar, och upprepa tills alla experimentella förhållanden är klädd.
- Inkubera i 4-24 h vid 37 ° C statiskt.
- Visuellt bekräfta tillväxt i TSB skick, tillväxt och EPS fällningen (vit) i TSB + BS skick, och ingen tillväxt och/eller vit fällning i sterila kontrollbrunnar. Ta bort supernatanterna.
- Fixa i 15 min på RT med 200 µL per brunn formaldehyd/glutaraldehyd lösning i 1 x PBS.
- Ta bort korrigeringsfilen och släng i farligt avfall.
- Försiktigt Tvätta brunnarna två gånger med 200 µL per brunn av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Ta bort PBS tvätten med hjälp av dammsugaren.
- Tillsätt 150 µL per brunn på 25 µg/mL ConA-FITC och inkubera i 15 min på RT.
- Försiktigt tvätta två gånger med 200 µL per brunn PBS.
- Montera med antifade monteringsmedel lösning med DAPI.
Obs: Lösningen är en färdig, glycerol-baserade mount lösning innehållande DAPI för att bevara den fluorescerande etiketten medan samtidigt färgning DNA i bakterieceller för visualisering som en motfärg. Följ kit's anvisningar och rekommendationer för inkubationstider innan imaging prover. Den DAPI färgning procedur kan utföras innan antifade monteringsmedel lösning som inte innehåller DAPI. - Utvärdera med konfokalmikroskopi. Confocal Mikroskop, ange lasern till 495 nm/519 nm excitation/utsläpp för FITC visualisering. Ange en andra laser 360 nm/460 nm excitation/utsläpp att visualisera DAPI. Leta upp biofilmen genom att fokusera på kanalen DAPI. Använda både DAPI och FITC kanaler att bestämma full tjocklek och ange övre och lägre imaging gränser. Spela in full tjocklek Z-stack bilder genom att fånga bilder varje 0,25 µm efter inställning perimetrar till toppen och botten av z-stacken. För mer information om konfokalmikroskopi, hänvisas till publikationer av Paddock o.a. 17 , 18 , 19 , 20
- Rekonstruera 3D-bilder i ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) att visualisera den fullständiga biofilm bildningen och beräkna tjockleken biofilm. Den genomsnittliga tjockleken erhålls för S. flexneri galla-salt inducerad biofilmer var 14 µm4.
5. spridning Assay
Obs: I denna analys upptäcks disassemblyen av biofilm genom bakteriell spridning. Här mogna biofilmer är etablerade och därefter (vanligtvis nästa dag), media ersätts med PBS eller kompletteras PBS. Komponenten supernatant bedöms sedan kvantifiera antalet bakterier som har tagit från biofilmen.
- Ställa in två 1,5 mL rör. Etikett med TSB eller TSB + BS.
- Tillsätt 1 mL TSB eller TSB + BS till respektive rören.
- Inokulera tuber med 20 µL av övernattning kultur (1:50 utspädning).
- I en steril, klar, flatbottnad, vävnadsodling-behandlade plattan med 96 brunnar, lägga till 130 µL per brunn av uninoculated kontroll media i tre brunnar som blankprovet. Ställa in tre kontrollbrunnar för varje medietyp som ska testas.
- Lägga till 130 µL per brunn av inokulerade kultur i tre brunnar och upprepa tills alla experimentella förhållanden är klädd i tre exemplar.
- Inkubera plattan för 4-24 h vid 37 ° C statiskt.
- Innan du fortsätter, värma den PBS, PBS + glukos, PBS gallsalter, och PBS + gallsalter + glukos till 37 ° C. Förbereda dessa reagenser färska dagligen.
- Med en spektrofotometer, registrera OD600. Ange kontrollbrunnarna som 'tomma.' Bekräfta att mediet är klart utan tecken på grumlighet. Om eventuella grumlighet upptäcks, kassera experimentet. OD600 -värdena kan användas för att normalisera data om det finns betydande skillnader i tillväxttakt mellan bakteriestammar.
- Ta bort odlingssubstratet med en vakuum linje. Tänk att samla alla odlingssubstratet utan att störa den vidhäftande befolkningen ligger på plastytan.
- Försiktigt Tvätta brunnarna två gånger med 200 µL per brunn av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Ta bort PBS tvätten med hjälp av dammsugaren.
- Ersätta tvätten med 130 µL per brunn av följande i tre brunnar varje: PBS, PBS + glukos, PBS + gallsalter, och PBS + gallsalter + glukos. Dessa reagenser måste vara pre värms till 37 ° C.
- Inkubera plattan under 30 minuter vid 37 ° C.
- Ta försiktigt bort plattan från 37 ° C inkubatorn. Överföra supernatanterna till en fräsch, sterila plattan med 96 brunnar.
- Med 96 brunnar plattan eller utspädning block, förbereda 10-faldig (1:10) seriespädningar av supernatanten i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
Obs: Spädningsserien bör variera från outspädd till 10-6 beroende på den bakteriestam som ska testas. Pilotförsök kan utföras för att fastställa optimala utspädning. - Spot bricka 5 µL av varje utspädning på LB agar med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera vid 37 ° C över natten. Räkna kolonier nästa dag och konto för utspädningsfaktorn vid fastställandet av den återhämtning kolonibildande enheter (CFU). För att beräkna procent spridning i förhållande till 1 x PBS kontroll (inställd på 100%), dela återhämtningen CFU från varje behandling villkorar av återvinning CFU från referensprovet 1 x PBS.
Obs: Rutin media plattor för bakteriell stam av intresse kan också användas. Exempelvis kan Shigella pläteras på kongorött tallrikar. Att plattorna är torr för lämplig plats-plätering tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1induceras biofilm bildning i de flesta av sex enteriska patogener testade följande ökningen av media som innehåller gallsalter. En betydande ökning av vidhäftande bakterier efter gallsalter exponering observeras i nästan alla stammar testade. Undantaget är enteroaggregative E. coli (Euratom); dock notera inducerad observationen av Δaaf mutant4. Resultaten tyder på att ytterligare följsamhet mekanismer induceras av gallsalter exponering i Euratomfördraget i avsaknad av samlad följsamhet fimbrier jag (AAF / jag)21. Att dra slutsatser från denna datauppsättning, rita OD540 -värdena för varje stam och media typ testat. Jämföra värden från varje stam i mediakontrollen (-BS) i förhållande till media som innehåller gallsalter avgör om gallsalter betydligt framkalla biofilm bildning. Jämförelser mellan bakteriestammar och/eller mutanter kan också utföras för ytterligare karakterisering analyser.
ConA-FITC bedömningen av EPS presenteras i figur 2. Figur 2A representerar semikvantitativ bedömning av EPS-produktion där ConA-FITC används för att färga biofilmer. ConA binder till polysackarider i matrisen EPS och det belopp som behållit detekteras av en fluorescerande Plattläsare. Att presentera data, rita genomsnittliga fluorescens enheter för varje villkor och jämföra de biofilm-inducerande villkor till den negativa kontrollen. Dessutom kan jämförelser mellan bakteriestammar eller mutanter utföras. Det är viktigt att analysera en media-bara, negativ kontroll för att avgöra hur mycket av bakgrunden ConA-FITC fluorescens som uppstår för plattan. TSB villkoret var inte signifikant från mediakontroll, medan den fluorescens avläsningar avsevärt ökade följande gallsalter exponeringen. Uppgifterna bekräftar att EPS-produktionen är vägledande för biofilm bildning och uppstår inte i avsaknad av gallsalter för S. flexneri. Bilder av galla salt-inducerad biofilmer i S. flexneri representeras i figur 2B. ConA-FITC används för att färga polysackarider i matrisen EPS medan en DAPI motfärg används för att visualisera bakterierna genom färgning DNA. För bakterier som inte utsätts för gallsalter (negativ kontroll), detekteras endast DAPI. Särskilt, är tätheten av bakterier mycket lägre än i skick som gallsalter. En klar bakgrund på kanalen FITC erhålls för att indikera avsaknaden av EPS-produktion. Som väntat visar data att EPS produktion är korrelerad med biofilm bildning1,2,3 efter gallsalter exponering. Den - ConA färgning kontroll i bile salt-behandlade prover föreskrivs för att demonstrera specificiteten av FITC fluorescensen. För dessa bilder, 1 x PBS användes i stället för ConA-FITC och den DAPI motfärg underhölls. Avbildning kan utföras med en confocal Mikroskop för att bedöma tjockleken av biofilmer med EPS-positiva prover4.
Bakteriell spridning från biofilmer i figur 3 upptäcks av ruvande etablerade biofilmer i PBS eller kompletterade PBS. Fysiologiskt, galla reabsorberas i omlopp i tunntarmen och endast 5% av galla träder den kolon5. Som Shigella invaderar colonic epitel, vi hypotes som reabsorption av galla är en viktig signal för biofilm dispersion. I denna figur uppstår dispersion i biofilmer utsätts för PBS eller PBS + glukos; dock hämmas dispersion i PBS + gallsalter oavsett förekomst av glukos. Data visar att avlägsnandet av gallsalter är nödvändig och tillräcklig för att framkalla spridning av S. flexneri från galla salt-inducerad biofilmer4. Om du vill rita data, kan antingen den återvunna CFU av bakterier eller den relativa procenten till kontrollen (som visas här) ritas.
Figur 1: gallsalter inducerar biofilm bildning i enteriska patogener. 18 h biofilmer var odlas på vävnad-kultur behandlas 96 brunnar plattor antingen TSB eller TSB + 0,4% gallsalter media och färgas med 0,5% kristallviolett. Kvantitativa värden från etanol lösbarhet av kristallviolett fläcken bestämdes genom spektrofotometri vid OD540. Gallsalter exponering ökat betydligt biofilm bildning i Shigella flexneri, S. dysenteriae, enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhi och S. enterica serovar Typhimurium. Statistisk signifikans bestämdes av Students T-test för varje stam jämföra gallsalter behandling till mediakontrollen. Standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) representeras av felstaplar. Alla p-värden är < 0,0001. Data som visas är från en (n = 3) representativa experiment, med en full uppsättning av uppgifterna i en tidigare publikation4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: galla salt-inducerad biofilm bildning kännetecknas av produktionen av en EPS-matris som upptäcks med FITC-märkt Concanavalin A. (A) steril svart, plattan med 96 brunnar var seedad med S. flexneri 1:50 utspädning i TSB eller TSB + gallsalter och vuxit för 18 h. biofilmer var fast, försiktigt tvättas, och färgade med ConA-FITC. Den balanserade Concanavalin-A FITC fastställdes av en fluorescerande Plattläsare. De värden som ritas visar EPS kvantifiering efter tillväxten av S. flexneri odlas i TSB eller TSB-innehåller gallsalter. Betydelse bestämdes genom envägs ANOVA och p -värden är < 0,01. SEM representeras av felstaplar. Data som visas är från en (n = 3) representativa experiment, med en full uppsättning av uppgifterna i en tidigare publikation4. (B) mikroskopi bilder från en galla salt-inducerad Shigella biofilm. Sterila coverslips var seedad med S. flexneri 1:50 utspädning TSB eller TSB + gallsalter och odlas för 18 h. Coverslips var därefter fast och fläckade ConA-FITC eller counterstained med DAPI. ConA-FITC upptäcktes endast i gallsalter villkora på grund av förekomsten av EPS-matrisen. Ett täckglas som färgas endast med DAPI i TSB + gallsalter behandling användes för att påvisa minimal bakgrund fluorescens för inställningen FITC på confocal mikroskopet. Bilder för varje våglängd kanal och en sammansatt överlägg tillhandahålls för alla behandling villkor. Skala staplarna visar 10 µm. Data som visas är från en (n = 3) representativa experiment, med en full uppsättning av uppgifterna i en tidigare publikation4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analys av bakteriell spridning från galla salt-inducerad biofilmer. 18 h galla salt-inducerad Shigella flexneri biofilmer utsattes för PBS eller PBS kompletteras med glukos, gallsalter eller en kombination av glukos och gallsalter. Supernatanten var därefter seriellt spädas och ströks på agarplattor att räkna upp de kolonibildande enheter (CFUs) som spridda biofilmen. Antalet bakterier som återhämtade sig var plottas i förhållande till den PBS-kontrollen. Bakterier sprids från biofilmen i PBS eller PBS + glukos villkor, men förekomsten av gallsalter var tillräcklig för att hämma bakteriell spridning från biofilmen. Data som visas är från en (n = 3) representativa experiment, med en full uppsättning av uppgifterna i en tidigare publikation4. För referens återfanns rutinmässigt 100 gånger fler bakterier från PBS kontroll behandling (ca 7 x 107 CFU) jämfört med på PBS + gallsalter behandling (ca 7 x 105 CFU). Betydelse bestämdes genom envägs ANOVA och p -värden är < 0,0001. SEM representeras av felstaplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analys av biofilm bildning är utmanande på grund av den dynamiska karaktären av biofilmer och variabiliteten mellan stammar, material, laboratorier och testmetoder. Här presenteras flera strategier för att fastställa biofilm bildning i enteriska patogener efter gallsalter exponering med experimentella insikt för att främja reproducerbarhet. Det finns ytterligare överväganden att säkerställa reproducerbarhet. Först och främst rekommenderar vi utför minst tre oberoende experiment med tekniska exemplar att bekräfta observationer och statistisk signifikans på grund av den variation som kan uppstå. Andra, användning av positiva och negativa kontroller är avgörande för att säkerställa reproducerbarhet i analysen. Det rekommenderas starkt att använda vildtyp påfrestningen som en positiv kontroll när du utvärderar mutanter för biofilm bildning. Dessutom, såsom gener som är viktiga för biofilm bildning identifieras (se exempelvis Vibrio22, Salmonella7och E. coli23,24,25), användning av biofilm mutanter som negativa kontroller kommer att validera reproducerbarheten för analysen. Det tredje är ovanstående metoder baserade på fokuserad forskning med Shigella och S. flexneri, i synnerhet. Justeringar till protokollen kan krävas beroende på tillväxt kraven i varje enteriska patogener som utvärderas. Det fjärde mäta analyserna en bakteriell stress svar; och därför är det viktigt att arbeta med korrekt underhållna bakterier från fryst lager (-80 ° C) eller lagring plattorna förvaras under kylning (högst 4 ° C) under högst två veckor. Det är viktigt att notera att vissa bakterier inklusive de enteriska patogenerna i släktet Yersinia är psychrotrophs som kan växa vid temperaturer nära 0 ° C26. Eftersom förvaring i kylskåpstemperatur kan ändra bakteriell fysiologi och möjligen resultera i genotypiska eller fenotypiska förändringar27,28,29, det rekommenderas starkt att förbereda alikvoter av den lagerhållna odlingen vid-80 ° C för rutinmässig inympning till förrätt kulturer. Dessutom kräver arbeta med kliniska isolat tätare restreaks från-80 ° C bestånd som genetiska förändringar observeras snabbt när övergår en kliniskt framställda bakteriestam i laboratoriet inställning30,31 . Speciellt arbetar med Shigella isolerar, stammar anpassa snabbt och fenotyp förändringar uppstå ofta32,33. Det rekommenderas att restreak bakterier från frys lager när en månad, och restreak beståndet platta varannan vecka.
En annan viktig faktor att säkerställa reproducerbarhet är färska beredning av gallsalter media att begränsa variationen av analysen. Gallsalter media äldre än 1 vecka negativt robust fenotypen observerats med färska media förberedelse. Dessutom beroende på patogenen och vilken typ av exponering ska analyseras (tunntarmen kontra kolon), kan olika källor och blandningar av gallsalter krävas. Exempelvis enskilda gallsalter, konjugerat och de konjugerade källor eller rå galla extrakt som inkluderar ytterligare galla komponenter såsom kolesterol och bilirubin kan vara utnyttjade5,6. Shigella analyser har fokuserat på bakteriell anpassning till värden under transitering av tunntarmen innan infektion i tjocktarmen. Därför, användningen av en cholate och deoxicholat blandning härmar villkor av den små inälva5,6,34. Också när det gäller spridning analysen (avsnitt 5) anges det att PBS-kompletteras Reagenserna skall göras färsk dagligen och pre värmt till 37 ° C före analys. När reagenser som är äldre än ett par dagar användes, var reproducerbarhet analysens allvarligt äventyras. Det var också kritisk till pre värma dessa reagenser till 37 ° C som spridning inte inträffade lätt med rumstemperatur reagenser. Slutligen, dispersion metoder för bedömning av komplett titer uppräkning av biofilmen kan användas, som omfattar ultraljudsbehandling35,36 eller enzymatisk nedbrytning37. En strategi för spridning analysen var riktad mot att bedöma effekten av galla salt reabsorption som Shigella transiter från terminal ileum och in i tjocktarmen. Analysen baserades på hypoteser att förlusten av gallsalter skulle möjliggöra spridning av den övergående biofilmen och att Shigella måste skingra biofilmen före orsakar infektion i kolon epitel4,5 . Villkor såsom ultraljudsbehandling och enzymatisk nedbrytning representerar totala utgivningen av mikrobiell massa från biofilmen medan strategin presenteras här emulerar ileum kolon övergång till fånga en fysiologisk fenotyp för Shigella. Beroende på önskad experimentella förhållandena, kan det krävas ytterligare metoder för spridning analys eller biofilm uppräkning.
Analyserna är utformade för att vara måttligt hög genomströmning med användning av 96 brunnar att möjliggöra testning av flera bakteriestammar och/eller villkor. För att ytterligare säkerställa reproducerbarhet av biofilm bildning, användes flatbottnad, 96-bra plattor som var vävnadsodling behandlas. Av tekniska skäl inte kan plattan läsare noggrant mäta absorbansen eller fluorescens i rund botten pläterar. Dessutom erbjuds obelagda plåtar rörliga följsamhet profiler i Shigella, som är en pågående utredning. Analyserna kan skalas till större väl format proportionellt, men kommer att kräva ändringarna av det protokoll som kan minska experimentella effektivitet. Till exempel kommer att kultur media behöva överföras till kyvetter att registrera OD600 värdena med en spektrofotometer. Dessutom den kristallviolett-färgade biofilmen kan skrapas efter en 30-60 minuters inkubation i den 95% etanolen Avfärga steg och innehållet kan överföras till en kyvetten spektrofotometer mätvärden på OD540. Försiktighet måste iakttas vid skrotning innehållet i biofilmen i varje brunn att undvika stänk, och vi har funnit att skrotning är lättare efter en 60 minuters inkubation.
Analys med Shigella, Salmonella, och patogena E. coli4 visade en upprepad iakttagelse att biofilm bildning sker i en accelererad tidsskala (inom 24 h) för enteriska patogener utsätts för gallsalter. Tvärtemot andra bakterier som kräver 48 till 72 timmar att iaktta biofilm bildning under normala förhållanden, börjar bile salt-inducerad enteriska biofilm så tidigt som 4 h med fasen initial vidhäftning. Därefter EPS matrix bildandet framgår av 6 h och mognad sker genom 24 h. Som sådan, kan den följsamhet fenotypen på 24 h vara alltför robust att dechiffrera betydelsen av olika följsamhet faktorer i biofilm bildning. Tidiga analyser, möjliggör till exempel så tidigt som 4 h, identifiering av faktorer viktiga i early biofilm bildning som skulle annars missas vid en senare tidpunkt. Slutligen, och som nämnts ovan i protokollstegen, upptäcktes inte galla salt-inducerad biofilm bildning för Shigella i avsaknad av glukos4. Eftersom EPS-matrisen består primärt av polysackarider och är ett viktigt steg i biofilm bildning för de flesta bakterier38, är förekomst av glukos eller andra socker i media troligen viktigt att observera biofilm bildning. Beroende på bakteriella patogener analyseras, kan det krävas olika base media formuleringar.
Biofilm bildning är en mångbottnad process som ofta uppstår i ett öppet system där näringsämnen flux och flytande rörelse lätt uppstå1,2,3. Metoderna är begränsade av de stängda kultur och statiska tillväxt krav; men att metoderna bedömning av biofilm bildning i inställningen laboratorium. På identifiering av biofilm fenotypen, kan ytterligare experiment med flytande celler eller kontinuerlig kultur strategier39,40,41 tillhandahålla ytterligare mekanistiska insikter fysiologiska eller kliniska betydelsen av biofilm bildning. För identifiering av matrisen EPS använda protokollen den polysackarid-bindning lectin ConA. ConA binder α-D-glucosyl eller koalisera-närbesläktade resthalter42. Olika lektiner kan krävas beroende på typ av EPS som produceras för olika släkten eller arter. En alternativ strategi att identifiera EPS produktion är masspektrometri, vilket kommer att ge både verifiering att EPS tillverkas och bestämma sammansättningen av de EPS matrix43,44. Dessutom, kan användning av den DAPI motfärg resultera i betydande ljusstyrka anges antalet bakterier i biofilmen eller förekomsten av extracellulära DNA som förekommer ofta i EPS-matris45,46.
Det finns alternativ till ovanstående metoder beskrivna i litteraturen. Den fasta fasen bindande assay har till exempel rapporterats för användning i andra patogener (till exempel referenser4,25,47,48,49). Det finns ändringar av protokollet mellan publikationer; och därför de strategier som presenteras här är en lätt-till-replikera format. Det är viktigt att notera att protokoll ange air-drying biofilmer före färgning (steg 3.10) medan vissa grupper föredrar fixar biofilmer. De två olika synsätten kan representera varierande patogen-specifika strategier. Dessutom, genom att förbereda kristallviolett fläcken i vatten, upptäcktes en konsekvent biofilm bildning fenotyp. Andra grupper använder etanol till solubilize kristallviolett; som för Shigella, ledde till destabilization av biofilmer och äventyrat reproducerbarhet. Vi undersöker för närvarande vilka faktorer som kan vara etanol lösligt i den Shigella biofilmen. Ett annat exempel är kvantifiering av EPS-produktionen av ConA färgning. En fluorescerande detektionsmetod för plattan med 96 brunnar (steg 4.1) presenteras för att bestämma semikvantitativt värdena återspeglar mängden FITC-konjugerad ConA bindning till biofilmen. Till vår kunskap är metoden första gången denna strategi har rapporterats. EPS-identifiering via mikroskopisk undersökning accepteras i litteraturen och möjliggör en annorlunda, men avgiftsfritt, strategi för att visualisera EPS. Semikvantitativ fluorescens upptäckt kombinerat med confocal mikroskopisk detektion av EPS förstärkte verkligen data, särskilt med tanke på begränsningarna av DAPI motfärg förfarandet vid mikroskopi-analysen som beskrivs ovan. I alla är en betydande styrka i de analyser som beskrivs här att varje teknik kompletterar ett annat tillvägagångssätt för att ge upphov till en dynamisk bedömning av galla salt-inducerad biofilm bildning i enteriska patogener.
Som gallsalter och virulenta biofilmer inkorporeras i ett paradigm för inlåtande bakteriell patogenes, förväntas det att dessa metoder används för att validera modeller, identifiera roller av specifika gener, identifiera gener av okänd funktion och ger allmän karakterisering av klinisk stammar. Detta mångfacetterade tillvägagångssätt tillåter identifiering av gener som är viktiga i en aspekt av biofilm bildning som kan gå förlorad när den mogna biofilmen är etablerad, som därför möjliggör identifiering av specialiserade funktioner för varje bakteriell komponent av den biofilm. Dessutom, som framgår av det faktum att patogenen anpassning inom mänskliga tarmen är ett snabbt förekommande fenomen, är rollen av galla salt-inducerad biofilm bildning ett exempel på en nyligen uppskattat, bevarat och kritiska fenomen som uppstår i Shigella infektion samt ytterligare enteriska patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar.
Acknowledgments
Vi tackar Rachael B. Chanin och Alejandro Llanos-Chea för tekniskt bistånd. Vi tackar Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski och Bobby Cherayil för de stammar som används i denna studie. Detta arbete stöds av det nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar Grant K22AI104755 (C.S.F.). Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
References
- Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
- Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
- Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
- Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
- Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. delaL., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
- Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
- Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
- Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
- Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
- Paddock, S. W.
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
- Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-4, 646, 648 (2008).
- Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
- Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L.
- Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
- Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
- Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
- Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
- Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
- Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
- Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
- Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis? Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
- Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
- de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
- Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
- Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
- Huang, R., Li, M., Gregory, R. L.
- Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
- McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
- Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
- Liener, I. The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , Elsevier Science. (1986).
- Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
- Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
- Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
- Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).
