Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Galde Salt-induceret Biofilmdannelse i enterisk patogener: teknikker til identifikation og kvantificering

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/57322
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

Summary

Denne protokol det muligt for læseren at analysere galde salt-induceret Biofilmdannelse i enterisk patogener ved hjælp af en mangefacetteret tilgang til at fange den dynamiske karakter af bakterielle biofilm ved vurderingen af overholdelse, ekstracellulære polymert stof matrix dannelse, og dispersion.

Abstract

Biofilmdannelse er en dynamisk, flertrins proces, der forekommer i bakterier under hårde miljømæssige forhold eller tider med stress. For enterisk patogener, er en betydelig stressrespons induceret under gastrointestinal transit og galde eksponering, en normal del af menneskers fordøjelse. For at overvinde de bakteriedræbende virkninger af galde, udgøre mange enteriske patogener en biofilm hypotese for at muliggøre overlevelse, når transit gennem tyndtarmen. Her præsenterer vi metoder for at definere Biofilmdannelse gennem solid-faset tilslutning assays samt ekstracellulære polymert stof (EPS) matrix påvisning og visualisering. Derudover præsenteres biofilm spredning vurdering for at efterligne analyse af begivenheder udløser frigivelse af bakterier under infektion oparbejde. Krystalviolet farvning bruges til at påvise vedhængende bakterier i en høj overførselshastighed 96-brønd plade overholdelse assay. EPS-produktion vurdering bestemmes af to assays, nemlig mikroskopi farvning af EPS-matrix og semi-kvantitative analyse med en fluorescently-konjugeret polysaccharid bindende lektin. Endelig måles biofilm spredning gennem koloni tæller og plating. Positive data fra flere assays støtte karakterisering af biofilm og kan udnyttes til at identificere galde salt-induceret Biofilmdannelse i andre bakterielle stammer.

Introduction

Biofilmdannelse er en vigtig bakteriel overlevelsesstrategi induceret under hårde miljømæssige forhold. Eksponering for bakteriedræbende stoffer som antibiotika eller ændringer i næringsstof eller ilt tilgængelighed inducerer en stresset tilstand i bakterier, der kan afhjælpes gennem Biofilmdannelse. En biofilm er karakteriseret ved bakteriel vedhæftet fil til en overflade eller andre bakterier og er ledsaget af udskillelsen af en EPS-matrix primært består af polysaccharider1,2,3. Biofilmdannelse er en dynamisk proces, hvor en kaskade af begivenheder kulminerer i dannelsen af en moden vedhængende bakteriel EF1,2,3. Bakterier producere adhesins for at fremme tidlig vedhæftet fil mens skiftende adhesin gen expression profiler for at styrke vedhæftet fil under biofilm modning. Samtidigt, sker EPS-produktion til pels bakteriel Fællesskabet i en matrix til at beskytte celler fra den oprindelige stressor. Bakterier findes i biofilm er langsomt voksende; og som sådan gør de fleste antibiotika ineffektive. Desuden, den langsomme vækst sparer energi, indtil forholdene ændrer til at favorisere bakterievækst1,2,3. Efter de barske forhold har bestået, bakterier spredes biofilm og genoptage en planktoniske livsstil1,2,3. Traditionelt biofilm er observeret på overflader og repræsentere en vedvarende klinisk udfordring på grund af infektion reservoirer til stede på katetre og i boligen enheder1,2,3.

Biofilmdannelse blev for nylig beskrevet for flere enterisk patogener; bakterier, der inficerer tyndtarmen eller tyktarmen4. For Shigella arter, opstår infektion i den menneskelige kolon efter transit gennem størstedelen af mave-tarmkanalen. Under passagen gennem tyndtarmen, er Shigella udsat for galde; et lipid-nedbrydende vaskemiddel udskilles i tarmen til at lette fordøjelsen af lipider mens samtidig dræber de fleste bakterier5. Enterisk patogener har en unik evne til at modstå bakteriedræbende virkningerne af galde6. Vores seneste analyse udnyttet i vivo-indkvartering kombinationer af glucose og galdesalte at demonstrere robust Biofilmdannelse i S. flexneri samt andre arter af Shigella, patogene Escherichia coliog Salmonella4. Tidligere, Salmonella enterica serovar Typhi blev vist til at danne en galde-induceret biofilm på grund af unikke kolonisering af galdeblæren under kronisk infektion7,8,9, 10. Derudover tidligere forskning med Vibrio11og Campylobacter12 demonstreret Biofilmdannelse svar på galde. Derfor analyserne udvidet galde-induceret biofilm dannelse bemærkninger til andre patogener og bidrage til at etablere demonstration af en bevaret enterisk patogen svar på galde. I modsætning til kronisk biofilm hvor bakterielt gen transskription er begrænset, og celle ældning kan forekomme1,2,3, foreslår vi, at den enteriske galde-induceret biofilm er mere forbigående karakter. Denne forbigående, virulent biofilm er stemplet af en hurtig afmontering (som ses i dispersion assay) og forøget virulence genekspression observeret i biofilm befolkning4,6. 

Biofilmdannelse er en mangesidet, dynamisk proces og anvendelsen af galde salte som en igangsættende faktor er kun blevet for nylig beskrevet for mest enterisk patogener, er værktøjer og teknikker, der anvendes unikke og kreative anvendelser af traditionelle metoder. Derfor er præsenteres her tre gratis strategier til at kvantificere flere vigtige egenskaber af galde salt-induceret Biofilmdannelse, herunder bakteriel tilslutning, produktion af EPS-matrix, og spredning af levedygtige bakterier fra biofilm. Disse teknikker har været udnyttet primært for forskning med Shigella; og derfor, evaluering af andre enteriske patogener kan kræve optimering. Ikke desto mindre, positive data fra alle tre assays støtte identifikation af biofilm og fastlægge reproducerbare protokoller for galde salt-induceret Biofilmdannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af reagenser

  1. Galdesalte medium: for at forberede tryptic soja bouillon (TSB) der indeholder galdesalte 0,4% (vægt/volumen), resuspend 200 mg af galdesalte i 50 mL autoklaveres TSB. Filter sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm filter. Gøre friske medium ugentligt.
    Noter: Galdesalte rutinemæssigt anvendes er en 1:1 blanding af natrium cholat og natrium deoxycholate isoleret fra får og kvæg gallbladders. Som det fremgår tidligere4, var tilstedeværelsen af glucose påkrævet for galde salt-induceret Biofilmdannelse. TSB har tilføjet glukose i forhold til Luria-Bertani (LB) bouillon; og derfor var tilstrækkelig til at fremkalde Biofilmdannelse i Shigella og andre enteriske patogener analyseret. Afhængigt af bakterierne der skal analyseres, er forskellige glucose koncentrationer eller andet sukker krav påkrævet.
  2. 0,5% w/v krystalviolet i vand: Opløs 2,5 g af krystalviolet i 500 mL destilleret vand. Filter sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm filter.
  3. Concanavalin Andersen (ConA) konjugeret til fluorescein isothiocyanat (FITC): rekonstruere bestanden i 1 x PBS. Fortyndet 10 mg koncentreret bestanden med 400 μL 1 x PBS til en endelig koncentration på 25 µg/mL, og beskytte mod lys.
  4. PBS + glukose: Opløses 0,2 g glukose i 10 mL 1 x PBS (2% w/v glukose endelige). Filter sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm filter. Gøre friske dag i brug.
  5. PBS + galdesalte: Opløses 40 mg i 10 mL 1 x PBS (0,4% w/v galdesalte endelige). Filter sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm filter. Gøre friske dag i brug.
  6. PBS + glukose og galdesalte: 40 mg galdesalte og 0,2 g glukose i 10 mL 1 x PBS (0,4% w/v galdesalte og 2% w/v glukose endelige) opløses. Filter sterilisere ved hjælp af et 0,22 µm filter. Gøre friske dag i brug.
  7. Forberede LB agar plader.
  8. Formaldehyd/glutaraldehyd fix: Tilføj 810 µL formaldehyd (37% stamopløsning, 3% slutkoncentration) og 125 µL glutaraldehyd (25% stamopløsning, 0,25% slutkoncentration) til 14 mL 1 x PBS. Bland grundigt og opbevares ved 4 ° C. Rettelsen bør være koldt for korrekt brug.
    Forsigtig: Rettelsen er giftigt og kræver bortskaffelse af farligt affald.
  9. Antifade praeparat løsning: Brug antifade praeparat løsning indeholdende 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pletten til at hæmme photobleaching immunfluorescent mikroskopi prøver mens fluorescently farvning DNA fra bakterier.

2. forberedelse af bakterier

  1. Vokse overnight kulturer af bakteriestammer skal testes ved at vaccinere 3 mL TSB med et enkelt, godt isoleret koloni i en steril kultur tube. Der inkuberes ved 37 ° C under omrystning på 225 rpm i natten inkubation (16-24 h).
    Bemærk: Stammer bør være restreaked fra fryseren bestande hver 2 til 4 uger, og vedligeholdt på plader ikke mere end 2 uger gamle.

3. fast-fase overholdelse Assay

Bemærk: Dette assay kvantificerer vedhængende bakterier ved hjælp af en 96-brønd plade metode. Bakterier er vokset statisk i flad bundplade. Vask udføres for at fjerne ikke-tilhænger bakterier og vedhængende bakterier farves med krystalviolet. Krystalviolet pletten binder peptidoglycan i den bakterielle cellevæg og kan være solubilized med ethanol. Antallet af vedhængende bakterier bestemmes baseret på krystalviolet fastholdelse.

  1. Oprettet to 1,5 mL rør. Etiket med TSB eller TSB + galdesalte (BS).
  2. Der tilsættes 1 mL af TSB eller TSB + BS at de respektive rør.
  3. Podes rør med 20 µL af overnight kultur (på en 1:50 fortynding).
  4. I en steril, klar, fladbundet, væv kultur-behandlede 96-brønd plade, skal du tilføje 130 µL/brønd af utilsåede kontrol medier til tre brønde til at tjene som blindprøvekontrollen. Oprette tre kontrolhullerne for hver medietype (TSB og TSB + BS) skal testes.
  5. Tilføje 130 µL/brønd af podede kultur til tre brønde, og Gentag indtil alle forsøgsbetingelser er belagt i tre eksemplarer.
  6. Inkuber i 4-24 timer ved 37 ° C statisk.
  7. Ved hjælp af en Pladelæser, registrere OD600. Indstille kontrolhullerne som 'Tom'. Bekræfte kontrol medium er klar med ingen tegn på turbiditet. Hvis nogen turbiditet er opdaget, kassere eksperimentet. OD600 værdier kan bruges til at normalisere dataene, hvis der er betydelige forskelle i vækstraten mellem bakteriestammer.
  8. Fjerne dyrkningsmediet ved hjælp af et vakuum linje af forsigtigt vippe pladen og langsomt sugning medium på den nederste kant af brønden. Vær sikker på at indsamle alle næringssubstratet uden at forstyrre den vedhængende bakterielle befolkning beliggende på plastik overflade. Hvis EPS-matrix blev produceret under inkubationstiden, visualiseret matrix som et hvidt bundfald. Forstyr ikke EPS-matrix.
  9. Forsigtigt brøndene vaskes en gang med 200 µL sterilt PBS. Fjerne PBS vask ved hjælp af vakuum linje.
  10. Vend pladen til tørre. Tillade et minimum på 20 min. til tørre.
    Bemærk: Da biofilm skal tørres grundigt før farvning, protokollen kan blive standset på dette trin i et par timer eller endda natten. Tilføjet tørretiden vil ikke ændre proceduren farvning mens ufuldstændig tørring vil påvirke kvantificeringen af resultater og reproducerbarhed.
  11. Tilføj 150 µL af 0,5% krystalviolet til hver eksperimentelle og kontrol godt.
  12. Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur (RT).
  13. Brøndene vaskes en gang med 400 µL destilleret vand. Den tilsatte mængde hjælper med at fjerne resterende krystalviolet pletten fra siderne af brøndene. Fjerne vask med vakuum linje.
  14. Brøndene vaskes fem gange med 200 µL destilleret vand. Fjerne vask med vakuum linje.
    Bemærk: Grundig vask er vigtigt for kvantificering. Når Tom brøndene er fremgår af destilleret vand og ikke indeholder nogen resterende krystalviolet pletten, fortsætte til næste trin.
  15. Vend pladen til at tørre, beskyttet mod lys. Sikre fuldstændig udtørring af pladen som nævnt ovenfor.
  16. Destain brønde med 200 µL af 95% ethanol. Inkuber plade på shaker i 30 min. For at undgå fordampning, især ved højere temperaturer, udføre dette trin ved 4 ° C.
  17. Ved hjælp af en Pladelæser, registrere OD540.
    Bemærk: Bølgelængde for maksimal absorbansen af krystalviolet er nær 590 nm. Litteraturen rapporterer en spænder fra OD540 - OD5954,13,14,15,16 krystalviolet absorbans; således vælge en bølgelængde tilgængelige baseret på i pladelæseren.

4. EPS Matrix påvisning

Bemærk: Disse gratis assays kvantificere og visualisere EPS. I begge, er EPS opdaget ved hjælp af en lektin binde polysaccharider. Fluorescently-konjugeret protein giver mulighed for kvantificering (trin 4.1) eller visualisering (trin 4.2).

  1. Semi-kvantitative påvisning af EPS
    1. Oprettet to 1,5 mL rør. Etiket med TSB eller TSB + BS.
    2. Der tilsættes 1 mL af TSB eller TSB + BS at de respektive rør.
    3. Podes rør med 20 µL af overnight kultur (1:50 fortynding).
    4. I en steril, sort, fladbundet, væv kultur-behandlede 96-brønd plade, skal du tilføje 130 µL/brønd af utilsåede kontrol medier til tre brønde til at tjene som blindprøvekontrollen. Oprette tre kontrolhullerne for hvert medium type skal testes. Tilføje 130 µL/brønd af podede kultur brønde, og Gentag indtil alle forsøgsbetingelser er belagt i tre eksemplarer.
    5. Inkuber i 4-24 timer ved 37 ° C statisk.
    6. Overføre næringssubstratet til en klar 96-brønd plade med en pipette, ideelt set en multikanalpipette. Være forsigtige for at indsamle alle næringssubstratet uden at forstyrre den vedhængende befolkning og/eller EPS beliggende på plastik overflade. Der er afsat.
    7. Fastsætte den sorte trykplade for 15 min på RT bruger 200 µL/brønd af formaldehyd/glutaraldehyd i 1 x PBS.
    8. Mens den vedhængende befolkning er fastsættelse, vurdere den supernatanten fraktion fra trin 4.1.6. Ved hjælp af en Pladelæser, registrere OD600. Indstille kontrolhullerne som 'Tom'. Bekræfte kontrol medium er klar med ingen tegn på turbiditet. Hvis nogen turbiditet er opdaget, kassere eksperimentet.
      1. Alternativt kan hele analysen udføres i en sort klar bundplade. Under disse omstændigheder OD600 værdier kan registreres og substratet kan efterfølgende kasseret før fortsætter til trin 4.1.7. OD600 værdier kan bruges til at normalisere dataene i tilfældet der er betydelige forskelle i vækstraten mellem bakteriestammer.
    9. Fjern fix og bortskaffer farligt affald.
    10. Forsigtigt brøndene vaskes to gange med 200 µL/brønd af steril PBS. Fjerne PBS vask ved hjælp af vakuum linjen ved forsigtigt vippe pladen og langsomt sugning vask på den nederste kant af brønden.
    11. Tilføj 150 µL/brønd på 25 µg/mL ConA-FITC, og Inkuber i 15 min. ved RT.
    12. Forsigtigt vaskes to gange med 200 µL af PBS.
    13. Tilsæt 150 µL af PBS til hver brønd. Optage fluorescens på 488 nm.
  2. Konfokal mikroskopi visualisering af EPS-produktion og beregning af biofilm tykkelse
    1. Oprettet to 1,5 mL rør. Etiket med TSB eller TSB + BS.
    2. Der tilsættes 1 mL af TSB eller TSB + BS at de respektive rør.
    3. Podes rør med 20 µL af overnight kultur (på en 1:50 fortynding).
    4. Oprette en steril 24-godt plade med 12 mm sterile runde glas coverslips. Tilføj 400 µL/brønd af utilsåede kontrol medier til tre brønde til at tjene som blindprøvekontrollen. Oprette tre kontrolhullerne for hvert medium type skal testes.
    5. Tilføj 400 µL af podede kultur brønde i to eksemplarer, og Gentag indtil alle forsøgsbetingelser er forgyldt.
    6. Inkuber i 4-24 timer ved 37 ° C statisk.
    7. Visuelt bekræfte vækst i TSB betingelse, vækst og EPS bundfald (hvid) i TSB + BS tilstand, og ingen vækst og/eller hvidt bundfald i sterile kontrolhullerne. Fjerne supernatanter.
    8. Fix for 15 min på RT bruger 200 µL/brønd af formaldehyd/glutaraldehyd løsning i 1 x PBS.
    9. Fjern fix og bortskaffer farligt affald.
    10. Forsigtigt brøndene vaskes to gange med 200 µL/brønd af steril PBS. Fjerne PBS vask ved hjælp af vakuum linje.
    11. Tilsæt 150 µL/brønd på 25 µg/mL ConA-FITC og Inkuber i 15 min. ved RT.
    12. Forsigtigt vaskes to gange med 200 µL/brønd af PBS.
    13. Mount med antifade praeparat løsning med DAPI.
      Bemærk: Løsningen er en færdiglavet, glycerol-baserede mount løsning indeholdende DAPI for at bevare den fluorescerende label mens samtidig farvning DNA i bakterieceller for visualisering som en kontrastfarve. Følg sættet anvisninger og anbefalinger for inkuberingstider før imaging prøver. DAPI farvning proceduren kan udføres før du installerer antifade praeparat løsning, der ikke indeholder DAPI.
    14. Vurdere Konfokal mikroskopi. En Konfokal mikroskop, Indstil laser til 495 nm/519 nm excitation/emission for FITC visualisering. Angiv en anden laser til 360 nm/460 nm excitation/emission til at visualisere DAPI. Find biofilm ved at fokusere på DAPI kanal. Brug både DAPI og FITC kanaler til at bestemme den fuld tykkelse og angive øvre og lavere imaging grænser. Optage fuld tykkelse Z-stak billeder af fanger billeder hver 0,25 µm efter indstilling bander til toppen og bunden af z-stakken. For mere information om Konfokal mikroskopi, henvises til publikationer af paddocken et al. 17 , 18 , 19 , 20
    15. Rekonstruere 3D-billeder i ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) til at visualisere den fulde Biofilmdannelse og beregne biofilm tykkelse. Den gennemsnitlige tykkelse opnås for S. flexneri galde-salt induceret biofilm var 14 µm4.

5. spredning analyse

Bemærk: I dette assay, afmontering af biofilm gennem bakteriel spredning er opdaget. Her, modne biofilm er etableret og efterfølgende (normalt den næste dag), medier er erstattet med PBS eller suppleret med PBS. Komponenten supernatanten vurderes derefter for at kvantificere antallet af bakterier, der har taget afstand fra biofilm.

  1. Oprettet to 1,5 mL rør. Etiket med TSB eller TSB + BS.
  2. Der tilsættes 1 mL af TSB eller TSB + BS at de respektive rør.
  3. Podes rør med 20 µL af overnight kultur (på en 1:50 fortynding).
  4. I en steril, klar, fladbundet, væv kultur-behandlede 96-brønd plade, skal du tilføje 130 µL/brønd af utilsåede kontrol medier til tre brønde til at tjene som blindprøvekontrollen. Oprette tre kontrolhullerne for hver medietype skal testes.
  5. Tilføje 130 µL/brønd af podede kultur til tre brønde, og Gentag indtil alle forsøgsbetingelser er belagt i tre eksemplarer.
  6. Inkuber plade i 4-24 timer ved 37 ° C statisk.
  7. Før du fortsætter, varm PBS, PBS + glukose, PBS + galdesalte, og PBS + galdesalte + glukose til 37 ° C. Forberede disse reagenser frisk dagligt.
  8. Ved hjælp af en Pladelæser, registrere OD600. Indstille kontrolhullerne som 'Tom'. Bekræfte mediet er klar med ingen tegn på turbiditet. Hvis nogen turbiditet er opdaget, kassere eksperimentet. OD600 værdier kan bruges til at normalisere dataene, hvis der er betydelige forskelle i vækstraten mellem bakteriestammer.
  9. Fjerne dyrkningsmediet ved hjælp af et vakuum linje. Vær sikker på at indsamle alle næringssubstratet uden at forstyrre vedhængende befolkningen beliggende på plastik overflade.
  10. Forsigtigt brøndene vaskes to gange med 200 µL/brønd af steril PBS. Fjerne PBS vask ved hjælp af vakuum linje.
  11. Erstatte vask med 130 µL/brønd af følgende til tre brønde: PBS, PBS + glukose, PBS + galdesalte, og PBS + galdesalte + glukose. Disse reagenser skal være præ opvarmet til 37 ° C.
  12. Inkuber plade i 30 minutter ved 37 ° C.
  13. Forsigtigt fjerne pladen fra 37 ° C inkubator. Overføre analysere til en ny, sterile 96-brønd plade.
  14. Ved hjælp af en 96-brønd plade eller fortynding blok, forberede 10-fold (1:10) serielle fortyndinger af supernatanten opbevares i steril PBS.
    Bemærk: Fortyndingsrække bør spænder fra ufortyndet til 10-6 afhængig af bakteriel belastningen skal afprøves. Pilotforsøg kan udføres for at fastslå den optimale fortynding.
  15. Spot plade 5 µL af hver fortynding på LB-agar ved hjælp af en multikanalpipette. Der inkuberes ved 37 ° C natten over. Tælle kolonier på den næste dag og konto for fortyndingsfaktoren, ved fastsættelsen af den opsving kolonidannende enheder (CFU). For at beregne den procentvise spredning i forhold til 1 x PBS kontrol (sat til 100%), opdele opsving CFU fra hver behandling betingelse af recovery CFU fra 1 x PBS kontrolprøve.
    Bemærk: Rutine media plader til den bakterielle stamme af interesse kan også bruges. For eksempel, kan Shigella være forgyldt på Congo rød plader. Sikre, at pladerne er tør for passende spot-plating teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I figur 1, er Biofilmdannelse induceret i de fleste af de seks enterisk patogener testet følgende vækst i medie, der indeholder galdesalte. En betydelig stigning i vedhængende bakterier efter galdesalte eksponering er observeret i næsten alle stammer testet. Undtagelsen er enteroaggregative E. coli (Euratom); men Bemærk den inducerede observation af Δaaf mutant4. Resultaterne tyder på, at overholdelse af yderligere mekanismer er induceret af galdesalte eksponering i Euratom i mangel af aggregative tilslutning fimbriae jeg (AAF / jeg)21. At drage konklusioner af dette datasæt, plot OD540 værdier for hver stamme og media type testet. Sammenligne værdierne fra hver stamme i media control (-BS) i forhold til medierne der indeholder galdesalte vil bestemme hvis galdesalte betydeligt fremkalde Biofilmdannelse. Sammenligninger på tværs af bakterielle stammer og/eller mutanter kan også udføres for yderligere karakterisering analyser.

ConA-FITC vurdering af EPS er præsenteret i figur 2. Figur 2A repræsenterer den semi-kvantitative vurdering af EPS-produktion hvor ConA-FITC bruges til at plette biofilm. ConA binder sig til polysaccharider i matrixen EPS og tilbageholdt beløb registreres af en fluorescerende pladelæseren. At præsentere data, plot gennemsnitlige fluorescens enheder for hver betingelse og sammenligne de biofilm-fremkaldende forhold til den negative kontrol. Derudover kan du udføre sammenligninger på tværs af bakteriestammer eller mutanter. Det er kritisk at analysere en media-only, negativ kontrol for at fastslå størrelsen af baggrunden ConA-FITC fluorescens, der opstår for pladen. TSB betingelse var ikke signifikant forskellig fra medieobjekt, mens den fluorescens aflæsninger betydeligt øget følgende galdesalte eksponering. Dataene bekræfte, at EPS-produktion er betegnende for Biofilmdannelse og forekommer ikke i mangel af galdesalte for S. flexneri. Billeder af galde salt-induceret biofilm i S. flexneri er repræsenteret i figur 2B. ConA-FITC bruges til at plette polysaccharider i EPS-matrix, mens en DAPI kontrastfarve bruges til at visualisere bakterier ved farvning DNA. For bakterier ikke er udsat for galdesalte (negativ kontrol), registreres kun DAPI. Bemærkelsesværdigt, er tætheden af bakterier meget lavere end i galdesalte tilstand. En klar baggrund på FITC-kanal er fremstillet for at angive manglende af EPS-produktion. Som forventet, viser dataene, at EPS-produktion er korreleret med biofilm dannelse1,2,3 efter galdesalte eksponering. -ConA farvning kontrol i galde salt-behandlede prøverne er fastsat til at demonstrere specificiteten af FITC fluorescens. For disse billeder, 1 x PBS blev brugt i stedet for ConA-FITC og DAPI kontrastfarve blev opretholdt. Imaging kan udføres med en Konfokal mikroskop til at vurdere tykkelsen af biofilm med EPS-positive prøver4.

Bakteriel spredning fra biofilm i figur 3 er opdaget af kvægbruget etablerede biofilm i PBS eller suppleres med PBS. Fysiologisk, galde reabsorberes i omløb i tyndtarmen og kun 5% af galde ind kolon5. Som Shigella invaderer Colon epitel, vi hypotesen at reabsorption af galde er et vigtigt signal for biofilm spredning. I denne figur sker spredning i biofilm udsat for PBS eller PBS + glukose; dog hæmmes dispersion i PBS + galdesalte uanset tilstedeværelsen af glukose. Dataene viser, at fjernelsen af galdesalte er nødvendig og tilstrækkelig til at fremkalde spredning af S. flexneri fra galde salt-induceret biofilm4. Hvis du vil afbilde data, kan enten den gendannede CFU af bakterier eller den relative procent til kontrol (som vist her) afbildes.

Figure 1
Figur 1: galdesalte fremkalde Biofilmdannelse i enterisk patogener. 18 h biofilm blev dyrket på vævskultur behandlet 96-brønd plader i enten TSB eller TSB + 0,4% galdesalte medier og farves med krystalviolet 0,5%. Kvantitative værdier fra ethanol oploesning af krystalviolet pletten blev fastlagt ved spektrofotometri ved OD540. Galdesalte eksponering betydeligt øget Biofilmdannelse i Shigella flexneri, S. dysenteriae, enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhi og S. enterica serovar Typhimurium. Statistisk signifikans var bestemt af student's T-test for hver stamme sammenligne galdesalte behandling til kontrolelementet medier. Standardafvigelsen på middelværdien (SEM) er repræsenteret af fejllinjer. Alle p-værdier er < 0,0001. Vises data er fra en (n = 3) repræsentative eksperiment med et komplet sæt af data, der leveres i en tidligere publikation4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: galde salt-induceret Biofilmdannelse er karakteriseret ved produktion af en EPS-matrix, der er registreret med FITC-mærket Concanavalin A. (A) sterilt sort, 96-brønd plade var seedet med S. flexneri på en 1:50 fortynding i TSB eller TSB + galdesalte og vokset til 18 h. biofilm var fast, blidt vasket, og farves med ConA-FITC. Mængden af beholdt Concanavalin-A FITC var bestemt af en fluorescerende pladelæseren. Værdierne afbildet vise EPS-kvantificering efter vækst af S. flexneri dyrkes i TSB eller TSB-indeholder galdesalte. Betydning var bestemt af en-vejs ANOVA og p -værdier er < 0,01. SEM'EN er repræsenteret af fejllinjer. Vises data er fra en (n = 3) repræsentative eksperiment med et komplet sæt af data, der leveres i en tidligere publikation4. (B) mikroskopi billeder fra en galde salt-induceret Shigella biofilm. Sterile coverslips var seedet med S. flexneri på en 1:50 fortynding i TSB eller TSB + galdesalte og vokset til 18 h. Coverslips blev efterfølgende fast og farves med ConA-FITC og/eller counterstained med DAPI. ConA-FITC blev kun fundet i galdesalte tilstand på grund af tilstedeværelsen af EPS-matrix. En coverslip plettet kun med DAPI i TSB + galdesalte behandling blev brugt til at påvise minimal baggrund fluorescens for indstillingen FITC på Konfokal mikroskop. Billeder for hver bølgelængde kanal og en sammensat overlay er fastsat for alle behandling betingelser. Skalaen angiver 10 µm. viste Data er fra en (n = 3) repræsentative eksperiment med et komplet sæt af data, der leveres i en tidligere publikation4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: analyse af bakteriel spredning fra galde salt-induceret biofilm. 18 h galde salt-induceret Shigella flexneri biofilm blev udsat for PBS eller PBS suppleret med glucose, galdesalte eller en kombination af glucose og galdesalte. Supernatanten blev efterfølgende seriefremstillede fortyndet og belagt på agar plader til at optælle kolonidannende enheder (CFUs) der spredte biofilm. Antallet af bakterier inddrives blev afbildet i forhold til PBS-kontrol. Bakterier spredes fra biofilm i PBS eller PBS + glukose betingelser, men tilstedeværelse af galdesalte var tilstrækkelig til at hæmme bakteriel spredning fra biofilm. Vises data er fra en (n = 3) repræsentative eksperiment med et komplet sæt af data, der leveres i en tidligere publikation4. For reference, blev 100-fold flere bakterier rutinemæssigt inddrevet fra PBS kontrol behandling (ca 7 x 107 CFU) i forhold til PBS + galdesalte behandling (ca 7 x 105 CFU). Betydning var bestemt af en-vejs ANOVA og p -værdier er < 0,0001. SEM'EN er repræsenteret af fejllinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analyse af Biofilmdannelse er udfordrende på grund af den dynamiske natur af biofilm og variabiliteten mellem stammer, materialer, laboratorier og assays. Her præsenteres flere strategier for at bestemme Biofilmdannelse i enterisk patogener efter galdesalte eksponering med eksperimentelle indsigt til fremme reproducerbarhed. Der er yderligere overvejelser at sikre reproducerbarhed. Først og fremmest anbefaler vi udfører mindst tre uafhængige forsøg hver med tekniske tre at bekræfte observationer og Statistisk signifikans på grund af den variation, der kan opstå. Andet er brugen af positive og negative kontroller afgørende for at sikre reproducerbarheden af analysen. Det anbefales at bruge vildtype stamme som positiv kontrol, når de evaluerer mutanter for Biofilmdannelse. Desuden, som gener, der er vigtige for Biofilmdannelse identificeres (for eksempel Se Vibrio22, Salmonella7og E. coli23,24,25), brug af biofilm mutanter som negative kontroller vil validere reproducerbarhed af analysen. For det tredje baseret de ovenfor metoder på målrettet forskning med Shigella og S. flexneri, navnlig. Justeringer til protokollerne kan være påkrævet afhængigt af kravene vækst af hver enterisk patogen evalueret. For det fjerde måle assays en bakteriel stressrespons; og det er derfor kritisk at arbejde med korrekt vedligeholdt bakterier fra frosne lagre (-80 ° C) eller opbevaring plader holdes under nedkøling (maksimum 4 ° C) i højst to uger. Det er vigtigt at bemærke, at nogle bakterier, herunder de enterisk patogener i Yersinia slægten psychrotrophs, der kan vokse ved temperaturer tæt på 0 ° C26. Da opbevaring i nedkølet temperaturer kan ændre bakteriel fysiologi og muligvis resultere i genotypiske eller fænotypiske forskydninger27,28,29, det anbefales stærkt at forberede delprøver af den materiel kultur ved-80 ° C til rutinemæssig podning i starteren kulturer. Derudover kræver arbejder med kliniske isolater hyppigere restreaks fra-80 ° C bestande som genetisk Skift overholdes hurtigt når overgang en klinisk afledt bakteriel stamme i laboratoriet indstilling30,31 . Især arbejder med Shigella isolerer, stammer tilpasse hurtigt og fænotype forskydninger opstår ofte32,33. Det anbefales at restreak bakterier fra fryseren bestande, når en måned, og restreak bestanden plade hver to uger.

En anden vigtig faktor at sikre reproducerbarhed er frisk forberedelse af galdesalte media begrænse variation af analysen. Galdesalte media ældre end 1 uge påvirket negativt robust fænotype observeret med friske medier forberedelse. Desuden, afhængigt af patogenet og typen af eksponering skal analyseres (tyndtarmen versus kolon), forskellige kilder og blandinger af galde salte kan være påkrævet. For eksempel, enkelte galdesalte, konjugeret og de-konjugeret kilder, eller rå galde ekstrakter, som omfatter yderligere galde komponenter, såsom kolesterol og bilirubin kan være udnyttet5,6. Shigella analyser har fokuseret på bakteriel tilpasning til værten under transit af tyndtarmen før infektion i tyktarmen. Derfor efterligner brugen af en cholat og deoxycholate blandingen betingelser af tyndtarmen5,6,34. Også med hensyn til dispersion assay (afsnit 5), er det angivet, at PBS-suppleret reagenser er lavet frisk dagligt og pre varmet til 37 ° C før assay. Når reagenser ældre end et par dage blev brugt, var reproducerbarhed af analysen alvorligt kompromitteret. Det var også vigtig at forhånd varme disse reagenser til 37 ° C som dispersion ikke forekomme let med stuetemperatur reagenser. Endelig kan dispersion metoder til vurdering af komplet titer optællingen af biofilm bruges, som omfatter sonikering35,36 eller enzymatisk fordøjelsen37. Tilgang til spredning assay var rettet mod at vurdere effekten af galde salt reabsorption som Shigella transitter fra terminal ileum og colon. Analysen blev baseret på de hypoteser, at tabet af galdesalte ville muliggøre spredning af den forbigående biofilm og at Shigella skal sprede biofilm katalysatoren(-erne) infektion i Colon epitel4,5 . Forhold såsom ultralydbehandling og enzymatiske fordøjelsen repræsenterer samlede udgivelse af mikrobielle masse fra biofilm, mens strategien præsenteret her emulerer ileum kolon overgangen til fange en fysiologisk fænotype for Shigella. Afhængigt af de ønskede forsøgsbetingelser, kan yderligere metoder til spredning analyse eller biofilm tælling være påkrævet.

Assays er designet til at være moderat høj overførselshastighed med brug af 96-brønd plader til afprøvning af flere bakterielle stammer og/eller betingelser. For yderligere at sikre reproducerbarheden af Biofilmdannelse, blev fladbundet, 96-brønd plader, der var vævskultur behandlet brugt. Af tekniske årsager, plade læsere kan ikke præcist at måle absorbans eller fluorescens i rund bund plader. Derudover tilbydes ubestrøget plader variabel tilslutning profiler i Shigella, som er en allé af nuværende undersøgelse. Assays kan skaleres til større godt formater forholdsmæssigt, men vil kræve ændringer i protokollen, der kan reducere eksperimentelle effektivitet. For eksempel, bliver kultur medier nødt til at blive overført til kuvetter optage OD600 værdier med et spektrofotometer. Derudover krystalviolet-bejdset biofilm kan være skrabet følger en 30-60 min inkubation i 95% ethanol destain trin og indholdet kan overføres til en kuvette for spektrofotometrets aflæsninger på OD540. Pleje skal tages ved ophugning indholdet af biofilm i hver brønd at undgå sprøjt, og vi har fundet, at ophugning er lettere efter en 60 min inkubation.

Analyse med Shigella, Salmonella, og sygdomsfremkaldende E. coli4 vist en gentagen observation at Biofilmdannelse forekommer i en fremskyndet tidsskala (indenfor 24 timer) til enteriske patogener udsat for galdesalte. I modsætning til andre bakterier, der kræver 48-72 h at observere Biofilmdannelse under normale forhold, begynder galde salt-induceret enterisk biofilm så tidligt som 4 h med overholdelse af indledende fase. Efterfølgende EPS-matrix dannelse fremgår af 6 h, og modning opstår af 24 h. Som sådan kan overholdelse fænotype ved 24 h være alt for robust til at dechifrere overholdelse af forskellige faktorer i Biofilmdannelse rolle. Udfører tidlige analyser, for eksempel så tidligt som 4 h, giver mulighed for identifikation af faktorer vigtige i tidlige Biofilmdannelse, der ellers ville blive savnet på et senere tidspunkt. Endelig, og som nævnt ovenfor i trin protokol blev galde salt-induceret Biofilmdannelse for Shigella ikke fundet i mangel af glucose4. Da EPS-matrix består primært af polysaccharider og er et afgørende skridt i Biofilmdannelse for de fleste bakterier38, er tilstedeværelsen af glukose eller andre sukker i medierne sandsynligvis vigtigt at observere Biofilmdannelse. Afhængigt af en bakteriel patogen analyseret, kan forskellige base medier formuleringer være påkrævet.

Biofilmdannelse er et flerlaget proces, der ofte opstår i et åbent system hvor næringsstof flux og flydende bevægelse let opstår1,2,3. Metoderne, der er begrænset af de lukkede kultur og statisk vækst krav; men metoderne, der aktiverer vurdering af Biofilmdannelse i indstillingen laboratorium. Efter identifikation af biofilm fænotype, kan yderligere eksperimenter ved hjælp af flydende celler eller kontinuerlig kultur strategier39,40,41 give yderligere mekanistiske indblik i fysiologiske eller kliniske betydningen af Biofilmdannelse. For identifikation af matrixen EPS bruge protokollerne polysakkarid-bindende lektin ConA. ConA binder α-D-glucosyl eller sterically-nært beslægtede rester42. Forskellige lektiner kan være påkrævet afhængigt af EPS produceret til forskellige slægter eller arter. En alternativ metode til at identificere EPS-produktion er massespektrometri, som vil give både verifikation at EPS er produceret og bestemme sammensætningen af EPS-matrix43,44. Desuden kan brug af DAPI kontrastfarve resultere i betydelige lysstyrke betragtning af antallet af bakterier i biofilm eller forekomsten af ekstracellulære DNA, der er ofte til stede i EPS-matrix45,46.

Der er alternativer til de ovenfor metoder beskrevet i litteraturen. For eksempel er fast-fase bindende assay blevet rapporteret til brug i andre patogener (f.eks referencer4,25,47,48,49). Der er ændringer til protokollen mellem publikationer; og de strategier, der præsenteres her er derfor et nemt til kopiere formatet. Det er vigtigt at bemærke, at protokollerne angiver lufttørring biofilm før farvning (trin 3.10), mens nogle grupper foretrækker at lave biofilm. De to forskellige tilgange kan repræsentere varierende patogen-specifikke strategier. Derudover ved at forberede krystalviolet pletten i vand, blev en konsekvent biofilm dannelse fænotype opdaget. Andre grupper bruges ethanol til solubilize krystalviolet; som for Shigella, ført til destabilisering af biofilm og kompromitteret reproducerbarhed. Vi er i øjeblikket ved at undersøge de faktorer, der kan være ethanol opløselige i Shigella biofilm. Et andet eksempel er kvantificering af EPS-produktion af ConA farvning. En 96-brønd plade fluorescerende påvisningsmetode (trin 4.1) præsenteres for at bestemme semi-kvantitative værdier afspejler mængden af FITC-konjugeret ConA binding til biofilm. Til vores viden er metoden første gang denne strategi er blevet rapporteret. EPS-registrering via mikroskopisk undersøgelse er accepteret i litteraturen og giver mulighed for en anderledes, men gratis, strategi at visualisere EPS. Semi-kvantitative fluorescens påvisning kombineret med Konfokal mikroskopisk påvisning af EPS helt sikkert styrket data, især i betragtning af begrænsningerne af proceduren DAPI kontrastfarve i mikroskopi analysen ovenfor beskrevne. I alt er en væsentlig styrke i sæt af assays beskrevet her, at hver teknik supplerer en anden tilgang for at give anledning til en dynamisk vurdering af galde salt-induceret Biofilmdannelse i enterisk patogener.

Som galdesalte og virulent biofilm er indarbejdet i paradigme enterisk bakteriel patogenese, forventes det, at disse metoder vil blive brugt til at validere modeller, identificere roller af specifikke gener, identificere gener af ukendt funktion og give generelle karakterisering af klinisk stammer. Denne mangefacetteret tilgang giver mulighed for identifikation af gener, der er vigtigt i et aspekt af Biofilmdannelse, der kan gå tabt når den modne biofilm er etableret, som derfor muliggør identifikation af specialiserede funktioner af hver bakteriel komponent af den biofilm. Desuden, som fremgår af, at patogenet tilpasning inden for human tarmen er et hurtigt forekommende fænomen, er rolle af galde salt-induceret Biofilmdannelse et eksempel på et nyligt værdsat, bevarede og kritisk fænomen, der opstår i Shigella infektion samt yderligere enterisk patogener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger.

Acknowledgments

Vi takker Rachael B. Chanin og Alejandro Llanos-Chea for teknisk bistand. Vi takker Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski og Bobby Cherayil for de stammer, der er anvendt i denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af det nationale Institut for allergi og smitsomme sygdomme Grant K22AI104755 (C.S.F.). Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One 655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. delaL., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), 992-6, 998-1002, 1004 (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-4, 646, 648 (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis? Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , Elsevier Science. (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
  48. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 135 Biofilmdannelse enterisk patogener Shigella galde galde salte EPS matrix dispersion
Galde Salt-induceret Biofilmdannelse i enterisk patogener: teknikker til identifikation og kvantificering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, K. P., Faherty, C. S.… More

Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter