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Immunology and Infection

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/57322
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

Summary

Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.

Abstract

Biofilmbildung ist ein dynamisches, mehrstufigen Prozess, der in Bakterien unter rauen Umgebungsbedingungen oder Stresssituationen auftritt. Für enterischen Krankheitserregern wird eine erheblichen Stress-Reaktion während des Magen-Darm-Transports und nach Galle Exposition, ein normaler Bestandteil des menschlichen Verdauung induziert. Um die bakterizide Wirkung der Galle zu überwinden, bilden viele Enterische Krankheitserregern einen Biofilm Hypothese um zu überleben zu ermöglichen, beim Transit durch den Dünndarm. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zur Biofilmbildung durch Einhaltung der Festphasen-Assays sowie extrazellulären Polymeren Substanz (EPS)-Matrix-Erkennung und Visualisierung zu definieren. Darüber hinaus ist Biofilm Dispersion Bewertung vorgelegt, um die Analyse der Ereignisse, die Freisetzung von Bakterien bei der Infektion auslösen zu imitieren. KRISTALLVIOLETT Färbung wird verwendet, um anhaftenden Bakterien in einem Hochdurchsatz-96-Well-Platte Einhaltung Assay zu erkennen. EPS Produktion Bewertung ergibt sich aus zwei Assays, nämlich Mikroskopie Färbung der EPS-Matrix und semi-quantitative Analyse mit einem eindringmittel konjugierte Polysaccharid bindende Lektin. Zu guter Letzt wird Biofilm Dispersion durch Kolonie zählt und Plattieren gemessen. Positive Daten aus mehreren Tests unterstützen die Charakterisierung von Biofilmen und können genutzt werden, um Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in andere Bakterienstämme zu identifizieren.

Introduction

Biofilmbildung ist eine wichtige bakterielle Überlebensstrategie induziert bei rauen Umgebungsbedingungen. Exposition gegenüber bakterizide Verbindungen wie Antibiotika oder Änderungen an Nährstoff oder sauerstoffverfügbarkeit induziert einen gestressten Zustand in Bakterien, die durch Biofilmbildung gelindert werden können. Ein Biofilm zeichnet sich durch bakterielle Bindung an eine Oberfläche oder andere Bakterien und wird begleitet durch die Sekretion von einer EPS-Matrix bestehend aus hauptsächlich Polysaccharide1,2,3. Biofilmbildung ist ein dynamischer Prozess, in dem eine Kaskade von Ereignissen in Bildung eines ausgereiften anhaftende Bakteriengemeinschaft1,2,3gipfelt. Bakterien produzieren Adhesins um die frühe Bindung während der Verschiebung adhäsin gen expressionsprofile zur Stärkung der Anlage während der Reifung der Biofilm zu erleichtern. Gleichzeitig tritt die EPS-Produktion zu beschichten der Bakteriengemeinschaft in einer Matrix, die Zellen vor den ersten Stressor zu schützen. Der Biofilm enthaltene Bakterien sind langsam wachsend; und als solche die meisten Antibiotika unwirksam macht. Darüber hinaus spart das langsame Wachstum Energie, bis Bedingungen ändern, um bakterielles Wachstum1,2,3bevorzugen. Nach die harten Bedingungen bestanden haben, Bakterien den Biofilm zu zerstreuen und wieder planktonischen Lebensweise1,2,3. Traditionell, Biofilmen auf Oberflächen eingehalten werden und eine anhaltende klinische Herausforderung wegen Infektion Stauseen auf Katheter und in Wohnung Geräte1,2,3vorhanden.

Biofilmbildung wurde kürzlich für mehrere magensaftresistenten Krankheitserreger beschrieben; Bakterien, die den Dünndarm oder Dickdarm4infizieren. Shigella -Arten, tritt Infektion im menschlichen Dickdarm nach einer Durchreise durch die Mehrheit des Magen-Darm-Trakt. Während der Passage durch den Dünndarm ist Shigella Galle ausgesetzt; ein Lipid-abbauenden Waschmittel abgesondert in den Darm zur Verdauung von Lipiden während gleichzeitig töten die meisten Bakterien5zu erleichtern. Enterische Krankheitserregern haben die einzigartige Fähigkeit, die bakterizide Wirkung der Galle6widerstehen. Unsere jüngsten Analyse verwendet in-Vivo-wie Kombinationen aus Glukose und Gallensalze, robuste Biofilmbildung in S. Flexneri demonstrieren sowie anderen Arten von Shigellen, pathogene Escherichia coliund Salmonellen4. Zuvor, Salmonella Enterica Serovar Typhi gezeigt werden konnte, bilden einen Galle-induzierte Biofilm durch einzigartige Besiedlung der Gallenblase während der chronischen Infektion7,8,9, 10. Darüber hinaus vorherige Forschung mit Vibrio11und Campylobacter12 gezeigt Biofilmbildung auf Galle. Daher die Analysen erweitert die Galle-induzierte Biofilm Formation Beobachtungen auf andere Krankheitserreger und helfen, um Demonstration der konservierten magensaftresistenten Erreger Antwort auf Galle zu etablieren. Im Gegensatz zu chronischen Biofilme in der bakteriellen Gentranskription ist begrenzt und Zelle Seneszenz kann auftreten,1,2,3schlagen wir vor, dass der Magensaftresistente Galle-induzierte Biofilm in der Natur mehr vergänglich ist. Diese vorübergehende virulenten Biofilm ist geprägt durch eine schnelle Demontage (gesehen in der Dispersion-Assay) und verbesserte Virulenz Genexpression beobachtet in den Biofilm Bevölkerung4,6. 

Wie Biofilmbildung eine facettenreiche, dynamischer Prozess und die Verwendung von Gallensalzen wie ein auslösende Faktor für die meisten enterischen Krankheitserregern nur vor kurzem beschrieben ist, sind die Werkzeuge und Techniken, die einzigartige und kreative Anwendungen der traditionellen Methoden. So sind die hier vorgestellten drei kostenlose Strategien, mehrere wichtige Eigenschaften der Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erwachsenden bakterielle, Produktion von EPS-Matrix und Dispersion von lebensfähigen Bakterien von den Biofilm zu quantifizieren. Diese Techniken wurden in erster Linie für die Forschung mit Shigellagenutzt; und Bewertung der anderen enterischen Krankheitserregern erfordern daher, Optimierung. Dennoch positive Daten aus allen drei Tests unterstützen Identifikation von Biofilmen und reproduzierbare Protokolle für die Galle Salz-induzierte Biofilmbildung einführen.

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Protocol

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Gallensalze Medium: um tryptic Soy Bouillon (TSB) mit 0,4 % Gallensalze (Gewicht/Volumen) vorzubereiten, Aufschwemmen 200 mg der Gallensalze in 50 mL autoklaviert TSB. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Wöchentlich machen Sie frisches Medium.
    Anmerkungen: Die Salze der Gallensäure routinemäßig verwendet, ist eine 1:1 Mischung aus Natrium Cholate und Natrium-Deoxycholate von Schafen und Rindern Gallenblase isoliert. Wie zuvor4gezeigt hat, war die Anwesenheit von Glukose für Galle Salz-induzierte Biofilmbildung erforderlich. TSB hat Glukose im Vergleich zu Luria-Bertani (LB) Brühe hinzugefügt; und daher war ausreichend induzieren Biofilmbildung in Shigella und die anderen enterischen Krankheitserregern analysiert. Abhängig von den Bakterien analysiert werden könnten verschiedene Glukosekonzentration oder verschiedene Zucker Anforderungen erforderlich sein.
  2. 0,5 % w/V Kristallviolett im Wasser: 2,5 g Kristallviolett in 500 mL destilliertem Wasser auflösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren.
  3. Concanavalin A (ConA) konjugiert zu Fluorescein erfolgt (FITC): rekonstruieren die Aktie mit 1 X PBS-Puffer. Die 10 mg konzentriert-Aktie mit 400 μl 1 X PBS, eine Endkonzentration von 25 µg/mL zu verdünnen und vor Licht schützen.
  4. PBS + Glukose: 0,2 g Glukose in 10 mL 1 X PBS (2 % w/V Glukose final) auflösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.
  5. PBS + Gallensalze: Auflösen 40 mg in 10 mL 1 X PBS (0,4 % w/V Gallensalze final). Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.
  6. PBS + Glukose und Gallensalze: 40 mg Gallensalze und 0,2 g Glukose in 10 mL 1 X PBS (0,4 % w/V Gallensalze und 2 % w/V Glukose final) aufzulösen. Filter mit einem 0,22 µm-Filter zu sterilisieren. Am Tag der Verwendung machen Sie frisch.
  7. LB-Agar-Platten vorbereiten.
  8. Formaldehyd/Glutaraldehyd Fix: Hinzufügen 810 µL Formaldehyd (37 %-Stammlösung, 3 % Endkonzentration) und 125 µL Glutaraldehyd (25 % Stammlösung, 0,25 % Endkonzentration) 14 mL 1 X PBS. Gründlich mischen und Lagerung bei 4 ° C. Das Update sollte für den bestimmungsgemäßen Gebrauch kalt sein.
    Achtung: Das Update ist giftig und Sondermüll Beseitigung erfordert.
  9. Antifade Eindeckmedium Lösung: Verwenden Sie antifade Eindeckmedium Lösung mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Fleck, um Immunofluoreszenz immunofluorescent Mikroskopie Proben zu hemmen, während eindringmittel Färbung der DNS des Bakteriums.

2. Vorbereitung von Bakterien

  1. Wachsen Sie über Nacht Kulturen der Bakterienstämme impfen 3 mL TSB mit einer einzigen, gut isolierten Kolonie in einem sterilen Kultur Rohr getestet werden. Inkubation bei 37 ° C mit schütteln bei 225 u/min für die Inkubation über Nacht (16-24 h).
    Hinweis: Stämme sollten aus Gefrierschrank Beständen alle 2 bis 4 Wochen und gepflegt auf Platten nicht mehr als 2 Wochen alt restreaked werden.

3. Einhaltung der Festphasen-Assay

Hinweis: Dieser Assay quantifiziert anhaftende Bakterien mit einer 96-Well-Platte-Methode. Bakterien werden statisch in flachen Bodenplatten angebaut. Waschen wird durchgeführt, um nicht-anhaftende Bakterien entfernen und anhaftende Bakterien sind mit Kristallviolett gefärbt. KRISTALLVIOLETT Fleck Peptidoglycan in der bakteriellen Zellwand bindet und mit Ethanol solubilisiert werden kann. Die Zahl der anhaftenden Bakterien wird anhand von Kristallviolett Aufbewahrung bestimmt.

  1. Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + Gallensalze (BS).
  2. Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.
  3. Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).
  4. Fügen Sie in eine sterile, klar, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp (TSB und TSB + BS) getestet werden.
  5. Fügen Sie 130 µL/Well des beimpften Kultur in drei Vertiefungen und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.
  6. Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.
  7. Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Steuermedium klar ohne Anzeichen von Trübung. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normalisieren, gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.
  8. Entfernen Sie das Kulturmedium mit einem Vakuum durch leichtes Kippen der Plattenrandes und langsam Absaugen des Mediums am unteren Rand des Brunnens. Achten Sie darauf, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bakterienpopulation befindet sich auf der Kunststoffoberfläche. Wenn während der Inkubationszeit EPS Matrix produziert wurde, wird die Matrix als einen weißen Niederschlag visualisiert werden. Stören Sie die EPS-Matrix nicht.
  9. Vorsichtig waschen der Brunnen einmal mit 200 µL steriler PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.
  10. Invertieren Sie die Platte zum Trocknen. Lassen Sie ein Minimum von 20 min trocknen.
    Hinweis: Da der Biofilm vor Verschmutzung gründlich getrocknet werden muss, kann das Protokoll angehalten bei diesem Schritt für ein paar Stunden oder sogar über Nacht sein. Die zusätzliche Trocknungszeit wird das Färbeverfahren nicht verändern, während unvollständige Trocknung Quantifizierung der Ergebnisse und der Reproduzierbarkeit auswirkt.
  11. Gut 150 µL 0,5 % Kristallviolett bis jeweils experimentell und Steuerung hinzufügen.
  12. 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
  13. Der Brunnen einmal mit 400 µL destilliertes Wasser zu waschen. Das zusätzliche Volumen hilft, um passives Kristallviolett Fleck von den Seiten der Brunnen zu entfernen. Entfernen Sie das Waschen mit der Vakuumleitung.
  14. Die Brunnen fünfmal mit 200 µL destilliertes Wasser zu waschen. Entfernen Sie das Waschen mit der Vakuumleitung.
    Hinweis: Gründliches Waschen ist wichtig für die Quantifizierung. Wenn die leere Brunnen aus destilliertem Wasser sind und keine verbleibenden Kristallviolett Fleck enthalten, fahren Sie fort mit dem nächsten Schritt fort.
  15. Invertieren Sie die Platte trocken, vor Licht geschützt werden. Stellen Sie sicher, vollständige Trocknung der Platte wie oben erwähnt.
  16. Destain Brunnen mit 200 µL von 95 % Ethanol. Inkubieren Sie die Platte auf den Shaker für 30 min. Zur Vermeidung von Verdampfung, besonders bei höheren Temperaturen führen Sie diesen Schritt bei 4 ° C.
  17. Mit einem Teller Reader, Aufzeichnen der OD-540.
    Hinweis: Die Wellenlänge für maximale Absorption von Kristallviolett ist in der Nähe von 590 nm. Die Literatur berichtet eine Reihe von OD540 - OD5954,13,14,15,16 für Kristallviolett Absorption; So wählen Sie eine Wellenlänge zur Verfügung basierend auf der Platte-Leser.

4. EPS-Matrix-Erkennung

Hinweis: Diese kostenlose Proben zu quantifizieren und visualisieren die EPS. In beiden Fällen EPS-Erkennung erfolgt anhand einer Lektin Polysaccharide zu binden. Das eindringmittel konjugiert Protein ermöglicht die Quantifizierung (Schritt 4.1) oder Visualisierung (Schritt 4.2).

  1. Semi-quantitativen Nachweis von EPS
    1. Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.
    2. Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.
    3. Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (eine 01:50 Verdünnung).
    4. Fügen Sie in eine sterile, schwarz, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden. Die Brunnen 130 µL/Well des beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.
    5. Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.
    6. Übertragen Sie das Kulturmedium auf eine klare 96-Well-Platte mit einer Pipette, idealerweise ein Mehrkanal-Pipette. Seien Sie vorsichtig, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bevölkerung und/oder der EPS befindet sich auf der Kunststoffoberfläche. Beiseite stellen.
    7. Die schwarze Platte für 15 min bei RT mit 200 µL/Well von Formaldehyd/Glutaraldehyd in 1 X PBS zu beheben.
    8. Während die anhaftende Bevölkerung Befestigung ist, bewerten Sie die überstehende Fraktion aus Schritt 4.1.6. Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Steuermedium klar ohne Anzeichen von Trübung. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment.
      1. Alternativ kann der gesamte Test in eine schwarze klar Bodenplatte erfolgen. Unter diesen Umständen die OD600 Werte aufgezeichnet werden können und das Kulturmedium können anschließend vor 4.1.7 Schritt verworfen werden. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normieren im Fall gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.
    9. Entfernen Sie das Update und in den Sondermüll zu entsorgen.
    10. Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die PBS waschen mit der Vakuumleitung durch leichtes Kippen der Plattenrandes und langsam Absaugen der Wäsche am unteren Rand des Brunnens.
    11. 150 µL/Well von 25 µg/mL ConA-FITC hinzufügen und 15 min bei RT inkubieren
    12. Waschen Sie vorsichtig zweimal mit 200 µL PBS.
    13. Fügen Sie 150 µL PBS in jede Vertiefung. Aufzeichnen die Fluoreszenz bei 488 nm.
  2. Konfokale Mikroskopie Visualisierung von EPS-Produktion und Berechnung der Biofilm Dicke
    1. Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.
    2. Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.
    3. Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).
    4. Richten Sie eine sterile 24-Well-Platte mit 12 mm Runde Glasdeckgläser steril. Drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen fügen Sie 400 µL/Well nicht inokulierten Kontrolle Medien hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden.
    5. Brunnen in zweifacher Ausfertigung 400 µL der beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen überzogen sind.
    6. Statisch für 4-24 h bei 37 ° C inkubieren.
    7. Bestätigen Sie visuell Wachstum in der TSB Zustand, Wachstum und EPS Niederschlag in der TSB (weiß) + BS Zustand und kein Wachstum und/oder weißen Niederschlag in sterilen Kontroll-Vertiefungen. Entfernen Sie die Überstände.
    8. Fix für 15 min bei RT mit 200 µL/Well Formaldehyd/Glutaraldehyd Lösung mit 1 X PBS-Puffer.
    9. Entfernen Sie das Update und Sondermüll zu entsorgen.
    10. Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.
    11. 150 µL/Well von 25 µg/mL ConA-FITC hinzufügen und 15 min bei RT inkubieren
    12. Waschen Sie vorsichtig zweimal mit 200 µL/Well von PBS.
    13. Mit antifade Eindeckmedium Lösung mit DAPI montieren.
      Hinweis: Die Lösung ist eine fertige, Glycerin-basierte Montage-Lösung mit DAPI für Erhaltung der fluoreszierenden Labels während gleichzeitig Färbung der DNS in bakterielle Zellen für die Visualisierung als eine gegenfärbung. Folgen Sie des Kits Wegbeschreibungen und Empfehlungen für Inkubationszeiten vor imaging Proben. Das DAPI Färbeverfahren kann durchgeführt werden, vor der Anwendung antifade Eindeckmedium Lösung, die keine DAPI enthält.
    14. Bewerten von konfokalen Mikroskopie. Auf einem confocal Mikroskop legen des Lasers auf 495 nm/519 nm Anregung/Emission für FITC Visualisierung. Legen Sie einen zweiten Laser auf 360 nm/460 nm Anregung/Emission DAPI zu visualisieren. Suchen Sie den Biofilm durch die Konzentration auf das DAPI-Kanal. Das DAPI und FITC Kanäle verwenden, um die volle Dicke bestimmen und legen Sie die obere und untere Grenzen imaging. Volle Dicke Z-Stapel Bilder aufnehmen von Aufnahmen jeder 0,25 µm nach dem Festlegen der Umfänge auf der Ober- und Unterseite des Stapels Z. Finden Sie für weitere Informationen über konfokalen Mikroskopie in Publikationen von Paddock Et al. 17 , 18 , 19 , 20
    15. Die 3D-Bilder in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) zu visualisieren die volle Biofilmbildung und berechnen Sie die Dicke der Biofilm zu rekonstruieren. Die durchschnittliche Dicke erhielt für S. Flexneri Galle-Salz induzierte Biofilme war 14 µm4.

(5) Dispersion Assay

Hinweis: In diesem Test wird die Demontage der Biofilm durch bakterielle Streuung erkannt. Hier Reife Biofilme werden festgelegt und anschließend (in der Regel am nächsten Tag), die Medien werden durch PBS ersetzt oder ergänzt PBS. Überstand Komponente wird dann bewertet, um die Anzahl der Bakterien quantitate, die von den Biofilm getrennt haben.

  1. Richten Sie zwei 1,5 mL-Tuben. Etikett mit TSB oder TSB + BS.
  2. Fügen Sie 1 mL TSB oder TSB + BS auf die jeweiligen Rohre.
  3. Rohre mit 20 µL über Nacht Kultur zu impfen (bei einem 01:50 Verdünnung).
  4. Fügen Sie in eine sterile, klar, mit flachem Boden, Gewebekultur behandelt 96-Well-Platte 130 µL/Well nicht inokulierten Steuermedien drei Brunnen als die leere Kontrolle dienen hinzu. Richten Sie drei Kontroll-Vertiefungen für jeden Medientyp getestet werden.
  5. Drei Brunnen 130 µL/Well des beimpften Kultur hinzu, und wiederholen Sie, bis alle experimentelle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung überzogen sind.
  6. Statisch inkubieren Sie Platte-für 4-24 h bei 37 ° C.
  7. Bevor Sie fortfahren, zu wärmen, PBS, PBS + Glukose, PBS + Salze der Gallensäure und PBS + Gallensalze + Glukose auf 37 ° c Diese Reagenzien täglich frisch zubereiten.
  8. Mit einem Teller Reader, erfassen Sie die OD600. Legen Sie die Kontroll-Vertiefungen als "leer". Bestätigen Sie das Medium ohne Anzeichen von Trübung klar. Wenn Trübung erkannt wird, verwerfen Sie das Experiment. Die OD600 Werte können verwendet werden, um die Daten zu normalisieren, gibt es erhebliche Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämme.
  9. Entfernen Sie das Kulturmedium mit einer Vakuumleitung. Achten Sie darauf, das Kulturmedium zu sammeln, ohne Beeinträchtigung der adhärenten Bevölkerung befindet sich auf der Kunststoffoberfläche.
  10. Waschen Sie vorsichtig die Brunnen zweimal mit 200 µL/Well des sterilen PBS. Entfernen Sie die Vakuumleitung mit PBS waschen.
  11. Ersetzen Sie die Wäsche mit 130 µL/Well des folgenden in drei Brunnen: PBS, PBS + Glukose, PBS + Salze der Gallensäure und PBS + Gallensalze + Glukose. Diese Reagenzien müssen auf 37 ° c vorgewärmt werden.
  12. Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37 ° c
  13. Entfernen Sie vorsichtig die Platte aus dem Inkubator 37 ° C. Übertragen Sie die Überstände auf eine frische, sterile 96-Well-Platte.
  14. Mit einer 96-Well Platte oder Verdünnung Block 10-fach vorbereiten (01:10) serielle Verdünnungen des Überstands in sterilen PBS.
    Hinweis: Die Verdünnungsreihe sollte von unverdünnt bis 10-6 je nach Bakterienstamm zu prüfenden Bereich. Pilotprojekten können durchgeführt werden, um den optimalen Verdünnung zu ermitteln.
  15. Platte 5 µL jeder Verdünnung auf LB-Agar mit einer Mehrkanal-Pipette zu erkennen. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Zählen Sie Kolonien auf den nächsten Tag und Konto für den Verdünnungsfaktor, bei der Festlegung der Wiederherstellung koloniebildenden Einheiten (KBE). Um die prozentuale Dispersion im Vergleich zu den 1 x PBS Steuerelementsatz (100 %) zu berechnen, teilen Sie die Wiederaufnahme KBE aus jeder Behandlung Zustand durch die Erholung KBE von 1 X PBS Kontrollprobe.
    Hinweis: Routine Medien Platten für die bakterielle Belastung von Interesse können auch verwendet werden. Beispielsweise können Shigella auf Kongo-rot Platten beschichtet werden. Stellen Sie sicher, dass die Platten trocken für geeignete Stelle-Plating-Techniken sind.

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Representative Results

In Abbildung 1wird in den meisten der sechs magensaftresistenten Krankheitserreger getestet nach dem Wachstum in Medien, die Salze der Gallensäure Biofilmbildung induziert. Eine deutliche Zunahme der anhaftenden Bakterien nach Gallensalze Exposition in fast allen Stämmen beobachtet wird getestet. Die Ausnahme ist Enteroaggregative E. Coli (EAEC); beachten Sie jedoch die induzierte Beobachtung der Δaaf mutierten4. Die Ergebnisse zeigen, dass die Einhaltung der zusätzlichen Mechanismen durch die Salze der Gallensäure Exposition im EAG bei fehlender aggregativ Einhaltung Fangarmen induziert werden ich (AAF / ich)21. Schlüsse aus diesem Datensatz, zeichnen die OD-540 -Werte für jede Belastung und Medien getestet. Vergleicht man die Werte von jedem Stamm in der Mediensteuerung (-BS) im Verhältnis zu den Medien, enthält Salze der Gallensäure wird ermittelt, ob Gallensalze Biofilmbildung deutlich induzieren. Vergleiche zwischen den Bakterienstämme und/oder Mutanten können auch für weitere Charakterisierung Analysen durchgeführt werden.

Die ConA-FITC-Beurteilung der EPS wird in Abbildung 2dargestellt. Abbildung 2A stellt die semi-quantitative Bewertung der EPS-Produktion in denen ConA-FITC verwendet wird, um die Biofilme zu beflecken. Die ConA bindet an die Polysaccharide in der EPS-Matrix und einbehaltener Betrag wird von einem fluoreszierenden Platte Leser erkannt. Um die Daten zu präsentieren, die durchschnittliche Fluoreszenz-Einheiten für jede Bedingung des Grundstückes und vergleichen die Biofilm-induzierenden Bedingungen um die negativ-Kontrolle. Darüber hinaus können Vergleiche zwischen den Bakterienstämmen oder durch Mutation entstehende Variationen ausgeführt werden. Es ist wichtig, eine Medien-only, negative Kontrolle zur Bestimmung der Menge des Hintergrunds ConA-FITC Fluoreszenz, die für die Platte Auftritt zu analysieren. Der TSB Zustand war nicht signifikant verschieden von der Mediensteuerung, während die Fluoreszenz Lesungen deutlich erhöhte folgende Salze der Gallensäure Exposition. Die Daten bestätigen, dass EPS-Produktion bezeichnend für die Biofilmbildung ist und nicht bei fehlender Gallensalze für S. Flexneri tritt. Die Bilder der Galle Salz-induzierte Biofilme in S. Flexneri wird dargestellt in Abbildung 2 b. ConA-FITC wird verwendet, um Polysaccharide in der EPS-Matrix zu beflecken, während ein DAPI gegenfärbung verwendet wird, um die Bakterien durch Färbung der DNS zu visualisieren. Für Bakterien, die Salze der Gallensäure (Negativkontrolle) nicht ausgesetzt wird nur DAPI erkannt. Insbesondere ist die Dichte der Bakterien viel niedriger als in die Salze der Gallensäure-Zustand. Ein klarer Hintergrund auf der FITC-Kanal wird gewonnen, um den Mangel an EPS-Produktion anzugeben. Wie erwartet, zeigen die Daten, dass EPS-Produktion mit Biofilm Formation1,2,3 nach Gallensalze Exposition korreliert ist. Die ConA - Färbung Kontrolle in der Galle Salz-behandelten Proben steht zur Verfügung, um die Spezifität der FITC Fluoreszenz zu demonstrieren. Für diese Bilder 1 X PBS wurde anstelle von ConA-FITC verwendet und das DAPI gegenfärbung wurde beibehalten. Bildgebung kann mit einem konfokalen Mikroskop zu beurteilen, die Dicke der Biofilme mit dem EPS-positiven Proben4durchgeführt werden.

Bakterielle Streuung von Biofilmen in Abbildung 3 wird durch Inkubation etablierten Biofilme in PBS oder ergänzten PBS erkannt. Physiologisch, Galle ist in Umlauf im Dünndarm resorbiert und nur 5 % der Galle betritt den Doppelpunkt-5. Wie Shigella dringt in das Kolon Epithel, wir vermuten, die Resorption von Galle ist ein wichtiges Signal für Biofilm Dispersion. In dieser Abbildung tritt Streuung in Biofilmen auf PBS oder PBS + Glukose ausgesetzt; Allerdings ist Streuung in PBS + Gallensalze unabhängig von der Anwesenheit von Glukose gehemmt. Die Daten zeigen, dass die Entfernung der Gallensalze notwendige und ausreichende Streuung der S. Flexneri von Galle Salz-induzierte Biofilme4induzieren. Um die Daten zu Plotten, können entweder die wiederhergestellten KBE der Bakterien oder die relative Prozent auf das Steuerelement (wie hier gezeigt) geplottet werden.

Figure 1
Abbildung 1: Salze der Gallensäure induzieren Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern. 18 h Biofilme waren auf Gewebekultur behandelt 96-Well-Platten entweder TSB oder TSB + 0,4 % Gallensalze Medien angebaut und mit 0,5 % Kristallviolett gefärbt. Quantitative Werte von Ethanol Solubilisierung von Kristallviolett Fleck wurden durch Spektralphotometrie bei OD540ermittelt. Gallensalze Exposition deutlich erhöht Biofilmbildung in Shigella Flexneri, S. Dysenteriae enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella Enterica Serovar Typhi und S. Enterica Serovar Typhimurium. Statistischer Signifikanz wurde der Student T-Test für jede Belastung vergleichen die Salze der Gallensäure-Behandlung zur die Mediensteuerung bestimmt. Der Standardfehler des Mittelwertes (SEM) wird durch die Fehlerbalken dargestellt. Alle p-Werte sind < 0,0001. Daten sind von einem (n = 3) repräsentative Experiment mit einem vollständigen Satz von Daten in einer früheren Publikation4. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Galle Salz-induzierte Biofilmbildung zeichnet sich durch Produktion von einem EPS-Matrix, das erkannt wird mit FITC-markierte Concanavalin A. (A) steril schwarz, 96-Well-Platte wurden ausgesät mit S. Flexneri bei einem 01:50 Verdünnung in TSB oder TSB + Salze der Gallensäure und für 18 h. Biofilme gefixt, sanft gewaschen und gefärbt mit ConA-FITC gewachsen. Die Höhe der einbehaltenen Concanavalin-A FITC wurde durch eine fluoreszierende Platte Leser bestimmt. Die Werten geplottet demonstrieren EPS Quantifizierung nach einem Wachstum von S. Flexneri in TSB oder TSB-haltige Gallensalze angebaut. Bedeutung wurde durch einfache ANOVA bestimmt und p -Werte sind < 0,01. Die SEM wird durch die Fehlerbalken dargestellt. Daten sind von einem (n = 3) repräsentative Experiment mit einem vollständigen Satz von Daten in einer früheren Publikation4. (B) Mikroskopie Bilder von Galle Salz-induzierte Shigella Biofilm. Sterile Deckgläsern wurden ausgesät mit S. Flexneri bei einem 01:50 Verdünnung in TSB oder TSB + Salze der Gallensäure und für 18 h angebaut. Die Deckgläsern wurden anschließend fixiert und gefärbt mit ConA-FITC und/oder counterstained mit DAPI. ConA-FITC wurde nur in die Salze der Gallensäure Zustand aufgrund des Vorhandenseins der EPS-Matrix gefunden. Ein Deckglas gefärbt nur mit DAPI in der TSB + Gallensalze Behandlung wurde verwendet, um minimale Hintergrundfluoreszenz für die FITC-Einstellung auf das konfokale Mikroskop zeigen. Bilder für jede Wellenlänge Kanal und ein composite-Overlay sind für alle Behandlungsbedingungen zur Verfügung gestellt. Maßstabsleisten zeigen 10 µm. angezeigten Daten stammen aus einer (n = 3) repräsentative Experiment mit einem vollständigen Satz von Daten in einer früheren Publikation4. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Analyse der bakteriellen Streuung von Galle Salz-induzierte Biofilmen. 18 h Galle Salz-induzierte Shigella Flexneri Biofilme PBS oder PBS ergänzt mit Glukose, Gallensalzen oder eine Kombination von Glukose und Gallensalze ausgesetzt waren. Der Überstand wurde anschließend seriell verdünnt und auf Agarplatten zum Aufzählen der koloniebildenden Einheiten (KBE), die den Biofilm verstreut vernickelt. Die Anzahl der Bakterien wiederhergestellt wurde relativ zum PBS-Steuerelement dargestellt. Bakterien verteilt von den Biofilm in der PBS oder PBS + Glukose Bedingungen, aber das Vorhandensein von Gallensalzen reichte aus, um bakterielle Streuung von der Biofilm zu hemmen. Daten sind von einem (n = 3) repräsentative Experiment mit einem vollständigen Satz von Daten in einer früheren Publikation4. Als Referenz wurden 100-fold mehr Bakterien routinemäßig von den PBS Steuerung der Behandlung (ca. 7 x 107 KBE) im Vergleich zu den PBS + Salze der Gallensäure-Behandlung (ca. 7 x 105 KBE) geborgen. Bedeutung wurde durch einfache ANOVA bestimmt und p -Werte sind < 0,0001. Die SEM wird durch die Fehlerbalken dargestellt.

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Discussion

Analyse der Biofilmbildung ist schwierig wegen der dynamischen Natur von Biofilmen und die Variabilität zwischen Stämmen, Materialien, Labors und Tests. Hier sind mehrere Strategien vorgestellt, um Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern nach Gallensalze Exposition mit experimentellen Erkenntnisse zur Förderung der Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Es gibt weitere Überlegungen zur Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. In allererster Linie, empfehlen wir die Durchführung von mindestens drei unabhängigen Experimenten mit technischen Triplicates zu bestätigen, Beobachtungen und statistische Signifikanz aufgrund der Variation, die auftreten können. Zweitens ist die Verwendung von positiven und negativen Kontrollen wichtig, Reproduzierbarkeit des Tests zu gewährleisten. Es wird dringend empfohlen, den Wildtyp-Stamm als Positivkontrolle zu verwenden, bei der Bewertung von Mutanten für Biofilmbildung. Darüber hinaus, wie Gene, die wichtig sind für die Biofilmbildung identifiziert werden (siehe z. B. Vibrio22, Salmonellen7und E. Coli23,24,25), die Verwendung von Biofilm-Mutanten als negative Kontrollen werden die Reproduzierbarkeit des Tests überprüfen. Drittens: die oben genannten Methoden fokussierte Forschung mit Shigella Flexneri S., insbesondere beruhen. Anpassungen an die Protokolle möglicherweise abhängig von den Wachstumsanforderungen jedes magensaftresistenten Erreger bewertet erforderlich. Viertens: Messen der Assays bakteriellen Stressantwort; und daher ist es entscheidend für die Arbeit mit entsprechend gepflegt Bakterien aus gefrorenen Aktien (-80 ° C) oder Speicherfolien für nicht mehr als zwei Wochen im Kühlschrank (maximal 4 ° C) gehalten. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Bakterien, einschließlich der magensaftresistenten Krankheitserreger der Gattung Yersinia Psychrotrophs, die bei Temperaturen nahe 0 ° C26wachsen kann. Da die Lagerung bei gekühlten Temperaturen kann die bakterielle Physiologie zu ändern und möglicherweise genotypischen und phänotypischen Veränderungen27,28,29, es dringend empfohlen wird, Aliquote des vorzubereiten die Lager Kultur bei-80 ° C für die routinemäßigen Impfung in Starterkulturen. Darüber hinaus erfordert eine Zusammenarbeit mit klinischen Isolaten häufiger Restreaks von-80 ° C Aktien genetische Veränderungen schnell beobachtet werden, wenn eine klinisch abgeleitet Bakterienstamm den Übergang in das Labor30,31 . Vor allem die Arbeit mit Shigellen isoliert, Stämme sich rasch anzupassen und Phänotyp Verschiebungen auftreten, oft32,33. Es wird empfohlen, Restreak Bakterien aus den Beständen der Gefrierschrank, einmal einen Monat, und Restreak die Aktie alle zwei Wochen Platte.

Ein weiterer wichtiger Faktor, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten ist die frische Zubereitung der Gallensalze Medien, Variabilität des Assays zu begrenzen. Gallensalze Medien älter als 1 Woche belastete die robuste Phänotyp mit frischen Medien Vorbereitung beobachtet. Darüber hinaus können je nach Erreger und der Art der Exposition zu analysierten (Dünndarm versus Doppelpunkt), verschiedene Quellen und Mischungen von Gallensalzen erforderlich sein. Z. B. individuelle Gallensalze konjugiert und de-konjugiert Quellen, oder grobe Galle-Extrakte, die zusätzliche Galle Komponenten enthalten, wie z. B. Cholesterin und Bilirubin genutzt5,6. Shigella Untersuchungen konzentrierten sich auf bakterielle Anpassung an den Host während der Durchfahrt des Dünndarms vor der Infektion in den Dickdarm. Deshalb imitiert die Verwendung einer Mischung von Cholate und Deoxycholate Bedingungen der Dünndarm5,6,34. Auch in Bezug auf die Streuung Assay (Abschnitt 5), wird genau festgelegt, dass die PBS ergänzt Reagenzien sind täglich frisch gemacht und 37 ° C vor der Testdurchführung vorgewärmt werden. Wenn älter als ein paar Tage Reagenzien verwendet wurden, war Reproduzierbarkeit des Assays erheblich beeinträchtigt. Es war auch entscheidend für diese Reagenzien auf 37 ° C vorwärmen wie Streuung nicht ohne weiteres mit Raumtemperatur Reagenzien auftraten. Zu guter Letzt können Dispersion Methoden zur Bewertung der komplette Titer-Enumeration des Biofilms verwendet werden, die Beschallung35,36 oder enzymatische Verdauung37umfassen. Der Ansatz für die Dispersion Assay richtete sich zur Beurteilung der Wirkung der Galle Salz Resorption als Shigella Transite von Klemme Ileum und in den Darm. Die Analyse beruhte auf der Hypothese, dass der Verlust der Gallensalze Streuung des transienten Biofilms ermöglichen würde, Shigella den Biofilm vor verursacht Infektion in das Kolon Epithel4,5 verteilen müssen . Bedingungen wie Beschallung und enzymatische Verdauung stellen Gesamtfreigabe mikrobielle Masse aus der Biofilm während die hier vorgestellten Strategie Ileum Doppelpunkt Übergang zu einen physiologischen Phänotyp für Shigellaerfassen emuliert. Zusätzliche Methoden für die Dispersion Analyse oder Biofilm Aufzählung ist abhängig von der gewünschten experimentellen Bedingungen erforderlich sein.

Die Tests sollen mäßig Hochdurchsatz-mit dem Einsatz von 96-Well-Platten zur Prüfung von mehreren Bakterienstämme und/oder Bedingungen zu ermöglichen. Um die Reproduzierbarkeit der Biofilmbildung weiter zu gewährleisten, wurden mit flachem Boden, 96-Well-Platten, die Gewebekultur behandelt wurden verwendet. Aus technischen Gründen messen nicht Platte Leser genau Extinktion oder Fluoreszenz in rundem Bodenplatten. Zusätzlich angeboten unbeschichtete Platten Variable Einhaltung Profile in Shigella, die eine Allee von Untersuchung ist. Die Assays können auf größeren Formaten auch proportional skaliert werden, aber erfordert die Änderungen des Protokolls, die experimentelle Effizienz reduziert werden kann. Beispielsweise müssen die Kulturmedien, Küvetten aufzunehmen die OD600 Werte mit einem Spektrophotometer übertragen werden. Darüber hinaus kann der Kristall violett gefärbten Biofilm abgekratzt werden Anschluss an einer 30-60 min Inkubation in den 95 % igem Ethanol destain Schritt und den Inhalt auf eine Küvette für Spektralphotometer Lesungen bei OD540übertragen werden können. Muss darauf geachtet werden wenn der Inhalt des Biofilms in jede Vertiefung Verschrottung zu vermeiden, spritzt, und wir haben festgestellt, dass Verschrottung einfacher nach einer 60 min Inkubation.

Analyse mit Shigellen, Salmonellen, und pathogenen E. Coli4 demonstriert eine wiederholte Beobachtung, dass Biofilmbildung in einer beschleunigten Zeitskala (innerhalb von 24 h) für enterischen Krankheitserregern ausgesetzt Gallensalze auftritt. Im Gegensatz zu anderen Bakterien, die 48 bis 72 h beobachten Biofilmbildung unter normalen Bedingungen erfordern, beginnt Galle Salz-induzierte magensaftresistenten Biofilm ab 4 Uhr mit der Einhaltung der ersten Phase. Anschließend EPS Matrixbildung ist offensichtlich von 6 h und Reifung erfolgt durch 24 h. Als solche kann die Einhaltung der Phänotyp bei 24 h zu entschlüsseln, die Rolle der Einhaltung der verschiedenen Faktoren bei der Biofilmbildung auch robust sein. Frühen Analysen, ermöglicht zum Beispiel so früh wie 4 h, Identifizierung von Faktoren wichtig in frühen Biofilmbildung, die sonst zu einem späteren Zeitpunkt verpasst hätte. Schließlich, und wie oben erwähnt in den Protokoll-Schritten wurde Galle Salz-induzierte Biofilmbildung für Shigella in Ermangelung von Glukose4nicht erkannt. Da die EPS-Matrix hauptsächlich aus Polysacchariden besteht und ein wichtiger Schritt für die meisten Bakterien38Biofilmbildung ist, ist das Vorhandensein von Glukose oder andere Zucker in den Medien wahrscheinlich wichtig, Biofilmbildung beobachten. Abhängig von der bakteriellen Erreger analysiert sein verschiedene base Medien Formulierungen erforderlich.

Biofilmbildung ist ein vielschichtiger Prozess, der tritt häufig in einem offenen System wo auftreten Nährstoff Flux und flüssigen Bewegung leicht,1,2,3. Die Methoden sind durch die geschlossene Kultur und statische Wachstumsanforderungen begrenzt; Allerdings ermöglichen die Methoden Beurteilung der Biofilmbildung in der Laborumgebung. Bei der Identifizierung der Biofilm Phänotypus weitere vorsehen Experimente mit flüssigen Zellen oder kontinuierliche Kultur Strategien39,40,41 zusätzliche mechanistische Einblicke in physiologische oder klinischen Bedeutung der Biofilmbildung. Für die Identifizierung der EPS-Matrix verwenden Sie die Protokolle der Polysaccharid-bindenden Lektin ConA. ConA bindet α-D-glukosyl- oder sterisch eng verwandten Rückstände42. Je nach Art der EPS für verschiedene Gattungen oder Arten produziert evtl. unterschiedliche Lektine. Eine alternative Strategie, EPS-Produktion zu identifizieren ist Massenspektrometrie, die bieten beide geprüft werden, ob EPS wird produziert und bestimmen die Zusammensetzung der EPS Matrix43,44. Darüber hinaus kann die Verwendung von DAPI gegenfärbung führen bedeutende Helligkeit, da die Anzahl der Bakterien im Biofilm oder das Auftreten von extrazellulärer DNA, die oft in der EPS Matrix45,46vorhanden ist.

Es gibt Alternativen zu den oben genannten Methoden in der Literatur beschrieben. Beispielsweise wurde die Festphasen-Bindung-Assay für den Einsatz in anderen Krankheitserregern (z. B. Verweise4,25,47,48,49) berichtet. Es gibt Änderungen des Protokolls zwischen Publikationen; und deshalb sind die hier vorgestellten Strategien-Format einfach replizieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die Protokolle lufttrocknendes Biofilmen angeben vor der Färbung (Schritt 3.10), während einige Gruppen bevorzugen, Biofilme zu beheben. Die zwei unterschiedliche Ansätze können unterschiedliche Erreger-spezifische Strategien darstellen. Darüber hinaus wurde mit der Erstellung des Kristallviolett Flecks im Wasser, ein konsistente Biofilm Formation Phänotyp erkannt. Andere Gruppen verwenden Äthanol um zu solubilisieren Kristallviolett; die für Shigella, führte zur Destabilisierung von Biofilmen und Reproduzierbarkeit in Frage gestellt. Wir untersuchen derzeit die Faktoren, die möglicherweise Ethanol löslich in Shigella Biofilm. Ein weiteres Beispiel ist die Quantifizierung der EPS-Produktion von ConA Färbung. Eine 96-Well-Platte-Fluoreszenz-Detektion-Methode (Schritt 4.1) wird vorgestellt, um semi-quantitativen Werte die Menge an FITC konjugiert ConA Bindung an den Biofilm reflektieren zu ermitteln. Nach unserem Kenntnisstand ist die Methode zum ersten Mal diese Strategie berichtet worden ist. EPS-Erkennung über die mikroskopische Untersuchung wird in der Literatur anerkannt und ermöglicht eine unterschiedliche, aber kostenlos, Strategie, EPS zu visualisieren. Die semi-quantitativen Fluoreszenz Detektion kombiniert mit den konfokale mikroskopische Nachweis von EPS verstärkt sicherlich die Daten, vor allem angesichts der Einschränkungen des DAPI gegenfärbung Verfahrens in der Mikroskopie-Analyse, die oben beschriebenen. Alles in allem ist eine wesentliche Stärke in der Menge der hier beschriebenen Tests, dass jede Technik, ein anderer Ansatz ergänzt um eine dynamische Beurteilung der Galle Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern hervorrufen.

Wie das Paradigma der magensaftresistenten bakterielle Pathogenese Gallensalze und virulenten Biofilme integriert sind, wird davon ausgegangen, dass diese Methoden verwendet werden, um Modelle zu überprüfen, Rollen bestimmter Gene zu identifizieren, identifizieren Gene unbekannter Funktion und bieten Allgemeine Charakterisierung der klinischen Stämme. Diese mehrdimensionalen Ansatzes ermöglicht die Identifizierung von Genen wichtig in einem Aspekt der Biofilmbildung, die einmal die Reife Biofilm verloren werden kann hergestellt, somit ermöglicht die Identifizierung von Spezialfunktionen der einzelnen bakterielle Komponenten des der Biofilm. Außerdem, wie offensichtlich durch die Tatsache, dass die Erreger Anpassung im menschlichen Darm rasch auftretende Phänomen, ist die Rolle der Galle Salz-induzierte Biofilmbildung ein Beispiel für ein neu geschätzt, konservierte und kritischen Phänomen, die auftritt, in Shigella Infektion sowie zusätzliche enterischen Krankheitserregern.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Angaben.

Acknowledgments

Wir danken Rachael B. Chanin und Alejandro Llanos-Chea für technische Hilfe. Wir danken Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski und Bobby Cherayil für die Stämme, die in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Allergy und ansteckende Krankheiten Grant K22AI104755 (C.S.F.) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One 655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000

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Immunologie und Infektion Ausgabe 135 Biofilmbildung magensaftresistenten Krankheitserreger Shigella Galle Gallensalze EPS-Matrix Dispersion
Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung
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Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).

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