Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Желчь соли индуцированной биопленки в кишечных патогенов: методы для идентификации и количественной оценки

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/57322
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

Summary

Этот протокол позволяет читателю анализа соли желчных индуцированной биопленки в кишечных патогенов, используя многосторонний подход для захвата динамический характер бактериальных биопленок путем оценки соблюдения, формирования матрицы внеклеточного полимерные вещества, и дисперсией.

Abstract

Биопленки является динамичной, многоступенчатый процесс, который происходит в бактерий в суровых условиях окружающей среды или время стресса. Для кишечных патогенов значительный стресс ответ индуцируется во время транзита желудочно-кишечного тракта и при воздействии желчи, нормальной составляющей человека пищеварение. Чтобы преодолеть бактерицидный эффект желчи, многие кишечных патогенов образуют биопленки, предположили, чтобы разрешить выживания, когда транзитом через кишечник. Здесь мы представляем методологии для определения биопленки через присоединение твердофазный анализов, а также внеклеточного полимерные вещества (EPS) матрица обнаружения и визуализации. Кроме того Оценка дисперсии биопленки представлена имитировать анализ событий, вызывая релиз бактерий во время процесса инфекции. Фиолетовый Кристалл пятнать используется для обнаружения адэрентных бактерий в assay соблюдение высокой пропускной способностью 96-луночных пластины. Оценка производства EPS определяется двумя анализов, а именно микроскопии пятнать EPS матрицы и полуколичественного анализа с Лектин привязки дневно конъюгированных полисахарид. Наконец дисперсия биопленки измеряется с помощью графов колонии и обшивки. Позитивные данные из нескольких анализов поддерживают характеристику биопленки и могут быть использованы для выявления желчные соли индуцированной биопленки в других бактериальных штаммов.

Introduction

Биопленки является важным бактериальных выживания, индуцированной в суровых условиях окружающей среды. Подверженности бактерицидные соединения как антибиотики или изменения в питательных или наличие кислорода вызывает напряженного состояния в бактерии, которые могут быть решены через биопленки. Биопленки характеризуется бактериальных привязанность к поверхности или других бактерий и сопровождается секрецию EPS матрицы, в основном состоят из полисахаридов1,2,3. Биопленки представляет собой динамичный процесс, в котором каскад событий достигает кульминации в формировании зрелой адэрентных бактериальных сообщества1,2,3. Бактерии производят адгезины для облегчения начала вложения при переходе принимает ген выражение профили для укрепления вложений во время созревания биопленки. Одновременно производство EPS происходит пальто бактериальное сообщество в матрице защитить клетки от первоначального стресса. Бактерии, содержащиеся в биопленки растут медленно; и таким образом, сводит на нет большинство антибиотиков. Кроме того медленные темпы роста экономит энергию, пока изменения условий в пользу бактерий в1,2,3. После того, как прошло суровые условия, бактерии разогнать биопленки и возобновить планктона жизни1,2,3. Традиционно биоплёнки наблюдаются на поверхностях и представляют собой стойких клинических вызов из-за заражения водоемов на катетеры и в жилой устройства1,2,3.

Биопленки недавно описал несколько кишечных патогенов; бактерии, которые заражают тонкой кишки или кишечника4. Шигеллы видов, инфекции происходит в толстой кишке человека после транзитом через большинство из желудочно-кишечного тракта. Во время прохождения через кишечник шигеллы подвергается желчи; моющее средство унижающего достоинство липидов, секретируемых в кишечнике для облегчения переваривания липидов при одновременно убить большинство бактерий5. Кишечных патогенов имеет уникальную способность противостоять бактерицидный эффект желчь6. Наш недавний анализ используемых в естественных условиях-как комбинации глюкозы и желчных солей продемонстрировать надежную биопленки в S. Флекснера , а также других видов шигеллами, патогенных кишечной палочкии Сальмонелла4. Ранее, Salmonella enterica серовар Typhi было показано образуют желчь индуцированной биопленки благодаря уникальной колонизации желчного пузыря при хронической инфекции7,8,9, 10. Кроме того, предварительные исследования с Vibrio11и Campylobacter12 продемонстрировал биопленки в ответ желчи. Таким образом анализ продлил желчь индуцированной биопленки формирования замечания других патогенов и способствовать созданию демонстрации ответа сохраняется кишечных патогенов желчи. В отличие от хронической биопленки в котором транскрипции гена бактериальной ограничено и старение клеток может произойти1,2,3мы предлагаем, что кишечной биопленки желчь индуцированной более преходящими в природе. Это преходящее, вирулентным биопленки hallmarked по быстрой разборки (как видно в assay дисперсия) и повышение экспрессии генов вирулентности, наблюдается в биопленки населения4,6. 

Биопленки является многогранной, динамичный процесс и использование желчных солей как инициирующего фактора только была недавно описана для наиболее кишечных патогенов, инструменты и методы, используемые как уникальный и творческий применения традиционных методов. Таким образом здесь представлены три бесплатные стратегии для количественного определения нескольких важных характеристик желчные соли индуцированной биопленки, включая бактериальные присоединения, производство EPS матрицы и дисперсия жизнеспособных бактерий от биопленки. Эти методы были использованы главным образом для исследований с шигеллезом; и поэтому, оценки других кишечных патогенов могут требовать оптимизации. Тем не менее позитивные данные из всех трех анализов поддерживают идентификация биопленки и создать воспроизводимый протоколы для соли желчных индуцированной биопленки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов

  1. Средний желчных солей: подготовить tryptic соевый бульон (БСЭ) содержит 0,4% желчных солей (вес/объем), Ресуспензируйте 200 мг солей желчи в 50 мл газобетона TSB. Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.22 мкм. Сделайте свежие среднего за неделю.
    Примечания: Желчных солей регулярно используется — 1:1 смесь холат натрия и Дезоксихолат натрия, изолированных от gallbladders баранину и говядину. Как показано ранее4, для соли желчных индуцированной биопленки требовалось наличие глюкозы. БСЭ добавил глюкозы относительно бульоне Лурия-Бертани (LB); и поэтому, было достаточно, чтобы побудить биопленки в Shigella и других кишечных патогенов проанализированы. В зависимости от бактерий, чтобы быть проанализированы концентрации различных глюкозы или сахара в различные требования могут быть необходимы.
  2. 0,5% w/v Фиолетовый Кристалл в воде: растворить 2,5 г Фиолетовый Кристалл в 500 мл дистиллированной воды. Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.22 мкм.
  3. Конканавалина А (Кона) конъюгированных флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC): восстановить запасы в однократном ПБС. Разбавить 10 мг сосредоточены акций с 400 мкл ПБС в конечной концентрации 25 мкг/мл и защищать от света.
  4. PBS + глюкоза: Растворить 0,2 г глюкозы в PBS 1 x 10 мл (2% w/v глюкозы окончательный). Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.22 мкм. Сделайте свежий в день использования.
  5. PBS + желчных солей: Растворить 40 мг в 10 мл ПБС (0,4% w/v желчных солей окончательный). Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.22 мкм. Сделайте свежий в день использования.
  6. PBS + глюкоза и желчных солей: растворить 40 мг желчных солей и глюкозы 0,2 г в 10 мл 1 x PBS (0,4% w/v желчных солей и 2% w/v глюкозы окончательный). Фильтр стерилизовать, с помощью фильтра 0.22 мкм. Сделайте свежий в день использования.
  7. Подготовьте плиты агара фунтов.
  8. Формальдегид/глютаральдегид исправить: добавить 810 мкл формальдегида (37% раствор, 3% конечной концентрации) и 125 мкл глутаровый (25% раствор, 0,25% конечная концентрация) до 14 мл ПБС. Тщательно перемешать и хранить при 4 ° C. Исправление должно быть холодным для надлежащего использования.
    Предупреждение: Исправление является токсичным и требует удаления опасных отходов.
  9. Antifade mountant решение: используйте antifade mountant раствор, содержащий 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятно для подавления Фотообесцвечивание immunofluorescent микроскопию образцов при дневно окрашивание ДНК бактерий.

2. Подготовка бактерий

  1. Растут на ночь культуры штаммов бактерий, чтобы быть проверена путем прививки 3 мл TSB с одного, хорошо изолированные колонии в стерильных культуры трубки. Инкубируйте при 37 ° C при встряхивании в 225 rpm для инкубации ночи (16-24 ч).
    Примечание: Штаммов должно быть restreaked из морозильника запасов каждые 2 до 4 недель и поддерживается на пластины не более 2 недель.

3. твердофазный присоединение Assay

Примечание: Этот assay количественно адэрентных бактерий с помощью метода 96-луночных пластины. Бактерии выращивают статически в плоское дно тарелки. Стиральная выполняется, чтобы удалить бактерии, не сторонник и сторонником бактерии запятнаны с Фиолетовый Кристалл. Фиолетовый Кристалл пятно связывает мукопептида клеточной стенки бактерий и может быть солюбилизирован с помощью этанола. Количество бактерий, сторонником определяется на основании Фиолетовый Кристалл удержания.

  1. Созданы две 1,5 мл пробирок. Этикетка с БСЭ или TSB + желчных солей (BS).
  2. Добавьте 1 mL TSB или TSB + BS в соответствующих труб.
  3. Прививать трубы с 20 мкл ночь культуры (в 1:50 разрежения).
  4. В стерильные, ясно, плоскодонные, культуры тканей лечение 96-луночных тарелку добавьте 130 мкл/хорошо uninoculated управления СМИ трех скважин в качестве пустой элемент управления. Созданы три контроля скважин для каждого типа носителя (TSB и БСЭ + BS) для проверки.
  5. Добавьте 130 мкл/хорошо привитых культуры в три скважины и повторять до тех пор, пока все экспериментальные условия покрыты в трех экземплярах.
  6. Проинкубируйте 4-24 ч при 37 ° C статически.
  7. С помощью пластины читатель, рекорд ОД600. Установка контроля скважин как «пустой». Подтвердите, что средство управления ясно с никаких признаков замутненности. При обнаружении любых мутность, отбросить эксперимент. ОД600 значения может использоваться для нормализации данных, если имеются существенные различия между бактериальных штаммов темпов роста.
  8. Удалите носитель культуры, с помощью разрежением, слегка наклоняя тарелку и медленно аспирационных среднего по нижнему краю колодца. Не забудьте собрать все питательной среды без нарушения адэрентных бактериальная популяция, расположенные на поверхности пластика. Если матрица EPS был выпущен во время инкубации, матрица будет визуализирована как Белый преципитат. Не беспокоить EPS матрицы.
  9. Осторожно промойте лунки с 200 мкл стерильные PBS. Удаление PBS мыть с помощью вакуумной магистрали.
  10. Инвертируйте пластину для просушки. Разрешить минимум 20 мин для просушки.
    Примечание: Поскольку биопленки необходимо тщательно просушить до окрашивания, протокол может быть приостановлена на этот шаг на несколько часов или даже на ночь. Добавлено время сушки не изменит пятная процедуру, пока неполная сушка повлияет количественной оценки результатов и воспроизводимость.
  11. Добавьте 150 мкл Фиолетовый Кристалл 0,5% для каждой экспериментальной и управления хорошо.
  12. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре (RT).
  13. Промойте лунки с 400 мкл дистиллированной воды. Добавлено объем помогает для удаления остаточного Фиолетовый Кристалл пятно от сторон скважин. Удаление мыть с вакуумной линией.
  14. Промойте лунки пять раз с 200 мкл дистиллированной воды. Удаление мыть с вакуумной линией.
    Примечание: Тщательного мытья имеет важное значение для количественной оценки. Когда пустой колодцы из дистиллированной воды и не содержат каких-либо остаточных Фиолетовый Кристалл пятно, переходите к следующему шагу.
  15. Инвертируйте пластину в сухом, защищенном от света. Обеспечение полного высыхания плиты, как указано выше.
  16. Отмойте скважин с 200 мкл 95% этиловом спирте. Инкубируйте пластину на шейкер для 30 мин. Чтобы избежать испарения, особенно при высоких температурах, выполните этот шаг на 4 ° C.
  17. С помощью пластины читатель, рекорд ОД540.
    Примечание: Волны максимального поглощения Фиолетовый Кристалл находится вблизи 590 нм. Литературе сообщает о диапазоне от ОД540 - ОД5954,13,14,,1516 для поглощения Фиолетовый Кристалл; Таким образом выберите волны имеющихся основанных на пластине читателя.

4. EPS матрица обнаружение

Примечание: Эти бесплатные анализы количественно и визуализировать EPS. В обоих EPS обнаруживается с помощью Лектин для привязки полисахаридов. Дневно конъюгированных белка позволяет количественной (шаг 4.1) или визуализации (шаг 4.2).

  1. Полуколичественного определения EPS
    1. Созданы две 1,5 мл пробирок. Этикетка с БСЭ или TSB + BS.
    2. Добавьте 1 mL TSB или TSB + BS в соответствующих труб.
    3. Прививать трубы с 20 мкл ночь культуры (1:50 разрежения).
    4. В стерильные, черный, плоскодонные, культуры тканей лечение 96-луночных тарелку добавьте 130 мкл/хорошо uninoculated управления СМИ трех скважин в качестве пустой элемент управления. Созданы три контроля скважин для каждого типа носителя для проверки. Добавить 130 мкл/хорошо привитых культуры к скважинам и повторять, пока все экспериментальные условия покрыты в трех экземплярах.
    5. Проинкубируйте 4-24 ч при 37 ° C статически.
    6. Передать ясно 96-луночных плита с пипеткой, в идеале многоканальные пипетки питательной среды. Будьте осторожны, чтобы собрать все питательной среды без нарушения адэрентных населения и/или EPS, расположенный на поверхности пластика. Отложите в сторону.
    7. Черный пластина для 15 мин на RT, используя 200 мкл/колодец глютаральдегид формальдегида в ПБС.
    8. Хотя фиксация адэрентных населения, оцените супернатанта фракция от шага 4.1.6. С помощью пластины читатель, рекорд ОД600. Установка контроля скважин как «пустой». Подтвердите, что средство управления ясно с никаких признаков замутненности. При обнаружении любых мутность, отбросить эксперимент.
      1. Кроме того весь assay может выполняться в черный четких днище. В этих обстоятельствах ОД600 значения могут быть записаны и питательной среды, может быть впоследствии удален перед шаг 4.1.7. OD600 значения могут использоваться для нормализации данных в случае существуют значительные различия между бактериальных штаммов темпов роста.
    9. Удаление исправления и удаления опасных отходов.
    10. Осторожно промойте лунки дважды с 200 мкл/хорошо стерильных PBS. Удалите в PBS стирку с помощью вакуумной магистрали, слегка наклоняя тарелку и медленно аспирационных мыть на нижнем краю колодца.
    11. Добавить 150 мкл/хорошо 25 мкг/мл ConA FITC и Инкубируйте 15 мин на RT.
    12. Осторожно промойте дважды с 200 мкл PBS.
    13. Добавьте 150 мкл PBS в каждой скважине. Запись флуоресценции в 488 нм.
  2. Конфокальная микроскопия визуализация производства EPS и расчета толщины биопленки
    1. Созданы две 1,5 мл пробирок. Этикетка с БСЭ или TSB + BS.
    2. Добавьте 1 mL TSB или TSB + BS в соответствующих труб.
    3. Прививать трубы с 20 мкл ночь культуры (в 1:50 разрежения).
    4. Настройка стерильные 24-ну плита с 12 мм стерильные круглые стекло coverslips. Добавьте 400 мкл/хорошо uninoculated управления СМИ трех скважин в качестве пустой элемент управления. Созданы три контроля скважин для каждого типа носителя для проверки.
    5. 400 мкл привитых культуры для скважин в двух экземплярах и повторять, пока покрытием всех экспериментальных условиях.
    6. Проинкубируйте 4-24 ч при 37 ° C статически.
    7. Визуально подтверждают рост в состоянии TSB, роста и EPS преципитат (белый) в БСЭ + BS условие и не роста и/или белый осадок в стерильных контроля скважин. Удаление supernatants.
    8. Исправление для 15 мин на RT, используя 200 мкл/хорошо раствора формальдегида/глютаральдегид в ПБС.
    9. Удаление исправления и удаления опасных отходов.
    10. Осторожно промойте лунки дважды с 200 мкл/хорошо стерильных PBS. Удаление PBS мыть с помощью вакуумной магистрали.
    11. Добавить 150 мкл/хорошо 25 мкг/мл ConA FITC и Инкубируйте 15 мин на RT.
    12. Осторожно промойте дважды с 200 мкл/хорошо PBS.
    13. Крепление с antifade mountant раствор с DAPI.
      Примечание: Решение является готовых, на основе глицерина горе раствор, содержащий DAPI для сохранения флуоресцентные метки при одновременно окрашивание ДНК в бактериальных клетках для визуализации как изображение. Следуйте комплект направления и рекомендации для инкубации раз до изображений образцов. DAPI пятнать процедура может выполняться до применения antifade mountant решение, которое не содержит DAPI.
    14. Оцените, confocal микроскопии. На конфокального микроскопа Установите лазер 495 нм/519 Нм возбуждения/выбросов для визуализации FITC. Установите второй лазер 360 Нм/460 Нм возбуждения/выбросов для визуализации DAPI. Найдите биопленки, сосредоточив внимание на канале DAPI. Использование FITC и DAPI каналов для определения полной толщины и задать верхний и нижний изображений границ. Запись полная толщина Z-стек изображений путем захвата изображения каждые 0,25 мкм после установки периметров для верхней и нижней части z стека. Для больше информации на confocal микроскопии пожалуйста, обратитесь к публикации в паддоке и др. 17 , 18 , 19 , 20
    15. Реконструировать 3D изображения в ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) для визуализации полный биопленки и рассчитать толщину биопленки. Средняя толщина получены для S. Флекснера желчь соль индуцированных биопленок было 14 мкм4.

5. дисперсия Assay

Примечание: В этот assay, обнаружен Разборка биопленки через бактериальный дисперсии. Здесь Зрелые биоплёнки устанавливаются и впоследствии (обычно на следующий день), средства массовой информации будут заменены PBS или дополнены PBS. Затем компонент супернатанта оценивается чтобы quantitate количество бактерий, которые отделены от биопленки.

  1. Созданы две 1,5 мл пробирок. Этикетка с БСЭ или TSB + BS.
  2. Добавьте 1 mL TSB или TSB + BS в соответствующих труб.
  3. Прививать трубы с 20 мкл ночь культуры (в 1:50 разрежения).
  4. В стерильные, ясно, плоскодонные, культуры тканей лечение 96-луночных тарелку добавьте 130 мкл/хорошо uninoculated управления СМИ трех скважин в качестве пустой элемент управления. Созданы три контроля скважин для каждого типа носителя быть проверены.
  5. Добавить 130 мкл/хорошо привитых культуры в трех скважин и повторять, пока все экспериментальные условия покрыты в трех экземплярах.
  6. Инкубируйте пластину для 4-24 ч при 37 ° C статически.
  7. Прежде чем продолжить, теплый PBS, PBS + глюкоза, PBS желчных солей и PBS + желчных солей + глюкозы до 37 ° C. Подготовьте эти реагенты свежий ежедневно.
  8. С помощью пластины читатель, рекорд ОД600. Установка контроля скважин как «пустой». Убедитесь, что носитель ясно с никаких признаков замутненности. При обнаружении любых мутность, отбросить эксперимент. ОД600 значения может использоваться для нормализации данных, если имеются существенные различия между бактериальных штаммов темпов роста.
  9. Удалите носитель культуры, с помощью вакуумной линии. Не забудьте собрать все питательной среды без нарушения адэрентных населения, расположенных на поверхности пластика.
  10. Осторожно промойте лунки дважды с 200 мкл/хорошо стерильных PBS. Удаление PBS мыть с помощью вакуумной магистрали.
  11. Заменить мыть с 130 мкл/хорошо следующее в три скважины: PBS, PBS + глюкоза, PBS желчных солей и PBS + желчных солей + глюкоза. Эти реагенты должен быть подогретым до 37 ° C.
  12. Инкубировать пластину для 30 минут при 37 ° C.
  13. Осторожно снимите пластину из инкубатора 37 ° C. Передать supernatants свежий, стерильные 96-луночных плиты.
  14. Используя блок плиты или разбавления 96-луночных, подготовить 10 (1:10) серийных разведений супернатант в стерильных PBS.
    Примечание: Серии разрежения должен варьируются от неразбавленном 10-6 в зависимости от бактериального штамма для проверки. Экспериментальный эксперименты можно определить оптимальное разведение диапазон.
  15. Пятно плита 5 мкл каждого разведения на LB агар с помощью многоканальных дозаторов. Инкубируйте при 37 ° C на ночь. Граф колоний на следующий день и счета для коэффициент разбавления, при определении восстановления колонии, образуя единиц (CFU). Чтобы вычислить процент дисперсии относительно 1 x PBS Управление (устанавливается на 100%), делят восстановления кое от каждого условия лечения, восстановления кое от образца управления PBS 1 x.
    Примечание: Обычные СМИ пластины для бактериальный штамм интерес может также использоваться. Например шигеллы могут покрытием на Конго красный пластин. Убедитесь, что пластины сухой для соответствующих методов спот обшивка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1биопленки индуцируется в большинстве проверенных следующие роста шести кишечных патогенов в средствах массовой информации, содержащие желчных солей. Значительное увеличение адэрентных бактерий после воздействия желчных солей наблюдается в почти всех штаммов испытания. Исключение составляет энтероагрегативной E. coli (ВАЭС); однако, обратите внимание, индуцированная наблюдения Δaaf мутант4. Результаты показывают, что присоединение дополнительных механизмов индуцированных желчных солей экспозиции в ЕврАзЭС в отсутствие фимбрий агрегатное присоединения я (AAF / я)21. Чтобы сделать выводы из этого набора данных, участок ОД540 значения для каждого испытанного типа штамма и СМИ. Сравнение значений из каждого штамма в СМИ управления (-BS) по отношению к СМИ, содержащих желчных солей будет определять если желчных солей существенно стимулировать биопленки. Сравнение различных штаммов бактерий и/или мутанты также может выполняться для дальнейшего анализа характеристик.

Кона-FITC оценки EPS представлена на рисунке 2. Рисунок 2A представляет полу количественной оценки производства EPS, в котором ConA-FITC используется пятно биопленки. ConA связывается с полисахаридами в матрице EPS и сохраняется сумма определяется флуоресцентные пластины читателя. Для представления данных, участок средняя флуоресценции единиц для каждого условия и сравнить условия биопленки побуждение к отрицательного контроля. Кроме того можно выполнить сравнение различных штаммов бактерий или мутантов. Очень важно для анализа только для средств массовой информации, негативные управления, чтобы определить количество фона ConA FITC флуоресценции, что происходит на пластине. БСЭ условие не было значительно отличается от элемента управления средств массовой информации, а флуоресценции чтений значительно увеличили следующие экспозиции желчных солей. Эти данные подтверждают, что производство EPS является показателем биопленки и не происходят в отсутствие желчных солей для S. Флекснера. Образы желчные соли индуцированной биопленки в S. Флекснера представлена в Рисунок 2B. Кона-FITC используется для пятно полисахаридов в матрице EPS, в то время как DAPI изображение используется для визуализации бактерии путем пятнать ДНК. Для бактерий, не подвержены желчных солей (отрицательный контроль) обнаруживается только DAPI. В частности плотность бактерий гораздо ниже, чем в состоянии желчных солей. Очистить фон на канале FITC получается что указывает на отсутствие производства EPS. Как и ожидалось, данные показывают, что производство EPS соотносится с биопленки формирования1,2,3 после воздействия желчных солей. -ConA пятнать управления в образцах желчные соли лечение предоставляется продемонстрировать специфика FITC флуоресценции. Для этих изображений ПБС был использован вместо ConA FITC и DAPI изображение был сохранен. Изображения могут быть выполнены с Конфокальный микроскоп, чтобы оценить толщину биоплёнки с EPS-позитивных образцов4.

Бактериальные дисперсии от биопленки в рисунке 3 обнаруживается инкубирования установленных биопленки в PBS или дополнить PBS. Физиологически желчь реабсорбируется в обращение в тонкой кишке и только 5% желчь поступает двоеточие5. Как шигелла вторгается в эпителии кишечника, мы предполагаем, что реабсорбции желчи является важным сигналом для дисперсии биопленки. На этом рисунке дисперсия происходит в биопленки, подвергается PBS или PBS + глюкоза; Однако дисперсия тормозится в PBS + желчных солей независимо от наличия глюкозы. Данные показывают, что удаление желчных солей необходимо и достаточно побудить дисперсии S. Флекснера желчные соли индуцированной биоплёнки4. Чтобы отобразить данные, восстановленные CFU бактерий или относительный процент к элементу управления (как показано ниже) могут быть отображены.

Figure 1
Рисунок 1: желчных солей побудить биопленки в кишечных патогенов. 18 h биоплёнки были выросли на ткани Культура лечение 96-луночных пластины либо TSB или TSB + 0,4% желчных солей СМИ и витражи с Фиолетовый Кристалл 0.5%. Количественные значения из этанола солюбилизация Фиолетовый Кристалл пятна были определены методом спектрофотометрии на од540. Воздействия солей желчи значительно увеличили биопленки в шигеллам Флекснера, S. dysenteriae, энтеропатогенные эшерихии коли, Salmonella enterica серовар Typhi и S. enterica серовар Typhimurium. Статистическая значимость определяется T-тест Стьюдента для каждого штамма, сравнение лечения желчных солей для средств массовой информации управления. Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) представлена погрешностей. Все p-значений < 0,0001. Данные являются от одного (n = 3) представитель эксперимент, с полным набором данных, представленных в предыдущей публикации4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: желчные соли индуцированной биопленки характеризуется производства EPS матрицы, которая обнаруживается с FITC-меченых конканавалина а. (A) стерильными черный, 96-луночных пластины были посеяны с S. Флекснера 1:50 разрежения в БСЭ или TSB + желчных солей и вырос на 18 ч биоплёнки были исправлены, аккуратно промывают и окрашенных с Кона-FITC. Количество сохраненных Concanavalin-A FITC определяется флуоресцентные пластины читателя. Значения, отображенные продемонстрировать EPS количественная оценка, после роста S. Флекснера выращенных в БСЭ или TSB-содержащих желчных солей. Значение определяется односторонняя ANOVA и p -значений < 0.01. SEM представлена погрешностей. Данные являются от одного (n = 3) представитель эксперимент, с полным набором данных, представленных в предыдущей публикации4. (B) микроскопия изображения из соли желчных индуцированной Shigella биопленки. Стерильные coverslips были посеяны с S. Флекснера 1:50 разрежения в БСЭ или TSB + желчных солей и вырос на 18 ч. Coverslips были впоследствии фиксированной и витражи с Кона-FITC и/или counterstained с DAPI. Кона-FITC только был обнаружен в состояние желчных солей вследствие наличия EPS матрицы. Coverslip только окрашивали DAPI в БСЭ + Лечение желчных солей был использован для демонстрации минимальных фон флуоресценции для параметра FITC конфокального микроскопа. Изображения для каждого канала волны и композитных оверлея предоставляются для всех условий лечения. Масштаб бары указывают 10 мкм. данные от одного (n = 3) представитель эксперимент, с полным набором данных, представленных в предыдущей публикации4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: анализ бактериальной дисперсии от соли желчных индуцированной биопленки. 18 ч желчные соли индуцированной шигеллам Флекснера биоплёнки были подвержены PBS, дополнена глюкозы, желчных солей или сочетанием глюкозы и желчных солей или PBS. Супернатант впоследствии серийно был разведен и покрытием на плиты агара для перечисления колонии, образуя единиц (CFUs), которые разогнали биопленки. Количество бактерий, восстановлены создавалась относительно управления PBS. Бактерии разогнали от биопленки в PBS или PBS + глюкоза условий, однако наличие желчных солей было достаточно, чтобы сдерживать Бактериальные дисперсии от биопленки. Данные являются от одного (n = 3) представитель эксперимент, с полным набором данных, представленных в предыдущей публикации4. Для справки 100-кратного больше бактерий обычно были извлечены из обращения управления PBS (примерно 7 x 107 кое), по сравнению с PBS + Лечение желчных солей (примерно 7 x 105 CFU). Значение определяется односторонняя ANOVA и p -значений < 0,0001. SEM представлена погрешностей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ биопленки является сложной задачей вследствие динамичного характера биопленки и изменчивость между штаммами, материалы, лабораторий и анализов. Здесь представлены несколько стратегий для определения биопленки в кишечных патогенов, после облучения желчных солей с экспериментальной понимание для содействия воспроизводимость. Существуют дополнительные соображения для обеспечения воспроизводимости. Прежде всего мы рекомендуем выполнять по крайней мере три независимых экспериментов с технической triplicates для подтверждения наблюдений и статистическую значимость из-за изменения, которые могут произойти. Во-вторых использование положительных и отрицательных элементов управления имеет жизненно важное значение для обеспечения воспроизводимости результатов анализа. Настоятельно рекомендуется использовать штамм дикого типа как позитивный элемент управления при оценке мутантов биопленки. Кроме того, как определены гены, которые важны для биопленки (например, см. Vibrio22, сальмонеллы7и E. coli23,24,25), использование биопленки мутантов как негативный контроль будет проверять воспроизводимость анализа. В-третьих вышеуказанные методы основаны на целенаправленных исследований с Shigella и Флекснера S., в частности. В зависимости от роста требований каждого кишечных патогенов оценены могут потребоваться корректировки к протоколам. В-четвертых анализов измерить ответ бактериальных напряжений; и поэтому, очень важно работать с надлежащим образом поддерживается бактерий из замороженных запасов (-80 ° C) или хранения пластины, хранится в холодильнике (максимум 4 ° C) для не более чем двух недель. Важно отметить, что некоторые бактерии, включая кишечных патогенов в род Yersinia psychrotrophs, которые могут расти при температурах около 0 ° C26. Так как хранения охлажденных температурах можно изменить бактериальных физиологии и привести к генотипические и фенотипические изменения27,28,29, настоятельно рекомендуется подготовить аликвоты из складе культура-80 ° C для плановой иммунизации в стартерных культур. Кроме того работа с клинических изолятов требует более частой restreaks от-80 ° C запасов как генетические изменения быстро наблюдаются при переходе клинически производные бактериальный штамм в лабораторию, установив30,31 . Особенности работы с шигеллезом изолятов, штаммы быстро адаптироваться и фенотип сдвиги происходят часто32,33. Рекомендуется для restreak бактерий из морозильника запасов после того, как месяц и restreak запас пластины каждые две недели.

Еще одним важным фактором для обеспечения воспроизводимости результатов является свежий подготовка желчных солей СМИ ограничить изменчивость assay. Старше 1 недели соли желчных СМИ негативно сказалось надежные фенотип, наблюдается с подготовкой свежие СМИ. Кроме того в зависимости от возбудителя и тип воздействия быть проанализированы (тонкой кишки и толстой кишки), могут потребоваться различные источники и смеси желчных солей. Например отдельные желчных солей, конъюгированных и де конъюгированных источники, или сырая желчь экстрактов, которые включают дополнительные желчи компоненты, такие как билирубина и холестерина может быть использованы5,6. Шигеллы анализы были сосредоточены на бактериальных адаптации к принимающей во время транзита тонкой кишки до инфекции в толстой кишке. Таким образом использование смеси холат и Дезоксихолат имитирует условия в тонком кишечнике5,6,34. Также относительно assay дисперсии (раздел 5), указывается, что PBS-дополнить реагенты должны быть сделаны свежий ежедневно и предварительно разогретую до 37 ° C до их анализа. При использовании реагентов, старше, чем несколько дней, воспроизводимость анализа была серьезно подорваны. Было также важно заранее теплый эти реагенты до 37 ° C, как дисперсия не было легко с комнатной температуре реагентов. Наконец может использоваться дисперсии методы для оценки полной титр перечисления биопленки, которые включают в себя sonication35,36 или ферментативного пищеварения37. Подход к assay дисперсия была направлена на оценке воздействия соли желчных реабсорбции как шигелла Транзиты от терминала подвздошной кишки и толстой кишки. Анализ на основе гипотезы, что потеря желчных солей позволит дисперсии переходных биопленки и Shigella должны разогнать биопленки до вызывая инфекцию в эпителии кишечника4,5 . Условия, такие как sonication и ферментативного пищеварения представляют общий выпуск микробной массы от биопленки в то время как стратегия, представленная здесь эмулирует подвздошной кишки двоеточие переход для захвата физиологические фенотип для Shigella. В зависимости от желаемого экспериментальных условиях могут потребоваться дополнительные методы для анализа или биопленки перечисления дисперсии.

Анализы предназначены для быть умеренно высокой пропускной способности с использованием 96-луночных пластин для тестирования нескольких штаммов бактерий и/или условий. Для дальнейшего обеспечения воспроизводимости биопленки, плоскодонные, 96-а пластины, которые были культуры ткани лечение были использованы. По техническим причинам плита читателей не может точно измерить поглощения или флуоресценции в раунде нижней плиты. Кроме того без покрытия плиты предложил переменной присоединение профилей в шигеллами, который является проспект текущего расследования. Анализы можно масштабировать до больших форматов хорошо пропорционально, но потребует изменений в протокол, который может снизить эффективность экспериментальных. Например средства массовой информации культуры нужно будет передаваться кюветы для записи значения600 од с спектрофотометром. Кроме того, может быть царапины Фиолетовый Кристалл окрашенных биопленки следующие 30-60 мин инкубации в 95% этаноле Отмойте шаг и содержимое может быть передана кюветы для спектрофотометр чтений на од540. Будьте внимательны при утилизации содержимого биопленки в каждой скважине чтобы избежать разбрызгивания, и мы обнаружили, что слом легче после инкубации 60 мин.

Анализ с шигеллы, сальмонеллы и патогенной кишечной палочки4 продемонстрировал повторные наблюдения, что биопленки происходит в ускоренные сроки (в течение 24 ч) для кишечных патогенов, подвергается желчных солей. В отличие от других бактерий, которые требуют 48 до 72 h соблюдать биопленки в нормальных условиях желчные соли индуцированной кишечной биопленки начинается 4 h с этапа первоначального присоединения в кратчайшие сроки. Впоследствии EPS формирования матрицы видно, 6 h, и созревание происходит от 24 h. Таким образом присоединение фенотип 24 ч может быть слишком надежные расшифровать роли различных присоединения факторов в биопленки. Выполнение раннего анализа, например 4 ч, в кратчайшие сроки позволяет выявление факторов важную роль в начале биопленки, которые в противном случае будет не хватать в более поздний момент времени. Наконец и, как упоминалось выше, в протоколе шаги желчные соли индуцированной биопленки для Shigella не был обнаружен в отсутствие глюкозы4. Так как матрица EPS состоит главным образом из полисахаридов и является важнейшим шагом в биопленки для большинства бактерий38, наличие глюкозы или другие сахара в средствах массовой информации наиболее вероятно важно соблюдать биопленки. В зависимости от бактериальных патогенов проанализированы могут потребоваться различные базы СМИ составов.

Биопленки это многослойный процесс, который часто встречается в открытой системе, где поток питательных веществ и движение жидкости легко произойти1,2,3. Методы ограничены закрытой культуры и статические роста требований; Однако методы позволяют оценку биопленки в лабораторных условиях. После идентификация биопленки фенотипа дальнейшие эксперименты с использованием жидкости клетки или непрерывное культуры стратегии3940,,41 может обеспечить дополнительные механистический понимание физиологических и клинических значение биопленки. Для идентификации EPS матрицы протоколы используют полисахарид привязки Лектин ConA. ConA связывает α-D-Глюкозил или труднодоступных тесно связанных между собой остатки42. Различных лектинов могут потребоваться в зависимости от типа EPS производится для разных родов и видов. Альтернативная стратегия для идентификации производства EPS является масс-спектрометрии, который будет обеспечивать обе проверки EPS производится и определить состав EPS матрица43,44. Кроме того использование DAPI изображение может привести к значительным яркость, учитывая количество бактерий в биопленки или возникновение внеклеточной ДНК, который часто присутствует в EPS матрица45,46.

Существуют альтернативы для выше методов, описанных в литературе. Например сообщалось assay твердофазный привязки для использования в другие патогены (например, ссылки на4,25,47,,4849). Существуют модификации протокола между публикаций; и, следовательно, стратегии, представленные здесь, формат легко реплицировать. Важно отметить, что протоколы укажите вентилирование биоплёнки до окрашивания (шаг 3.10), хотя некоторые группы предпочитают исправить биопленки. Два различных подхода может представлять различные патогенные конкретные стратегии. Кроме того подготавливая Фиолетовый Кристалл пятно в воде, был обнаружен фенотип формирования последовательной биопленки. Другие группы использовать этанол чтобы солюбилизировать последнего Фиолетовый Кристалл; который для шигеллами, привело к дестабилизации биопленки и скомпрометированы воспроизводимость. Мы в настоящее время изучают факторы, которые могут быть этаноле, растворим в Shigella биопленки. Другим примером является количественная оценка производства EPS путем пятнать ConA. Чтобы определить полуколичественного значения, отражающие количество FITC-конъюгированных ConA привязки к биопленки представлен метод флуоресцентного обнаружения 96-луночных пластины (шаг 4.1). К нашему знанию метод является первый раз, когда эта стратегия поступало. EPS обнаружение через микроскопического исследования принимается в литературе и позволяет для различных, но бесплатно, стратегии для визуализации EPS. Полуколичественного флуоресценции обнаружения в сочетании с конфокальный микроскопических обнаружения EPS безусловно укрепить данных, особенно учитывая ограничения процедуры изображение DAPI в анализе микроскопии, описанных выше. Во всех значительные силы в наборе анализов, описанные здесь является, что каждый метод дополняет другой подход к привести к динамической оценки желчные соли индуцированной биопленки в кишечных патогенов.

Как желчных солей и вирулентные биоплёнки включены в парадигме патогенеза кишечной бактериальной, предполагается, что эти методы будут использоваться для проверки модели, определения роли конкретных генов, выявления генов неизвестной функции и обеспечивают Общая характеристика клинических штаммов. Этот многосторонний подход позволяет идентификации генов, важное значение в один из аспектов биопленки, который может быть потеряна после зрелого биопленки установлено, что таким образом позволяет идентификации специализированных функций каждого бактериального компонента биопленки. Кроме того, как свидетельствует тот факт, что адаптация возбудителя в кишечнике человека быстро происходящие явления роль желчи соли индуцированной биопленки является примером недавно оценили, сохранены и критические явления, которое происходит в Бактерии Shigella инфекции, а также дополнительные кишечных патогенов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют не раскрытия.

Acknowledgments

Мы благодарим Rachael B. Chanin и Алехандро Льянос-Чеа для оказания технической помощи. Мы благодарим Энтони т. Maurelli, Брайан P. Херли, Алессио Fasano, Бретт э. Swierczewski и Бобби Cherayil штаммов, используемые в данном исследовании. Эта работа была поддержана национального института аллергии и инфекционных заболеваний Грант K22AI104755 (РППО). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One 655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. delaL., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), 992-6, 998-1002, 1004 (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-4, 646, 648 (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis? Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , Elsevier Science. (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
  48. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 135 биопленки кишечных патогенов шигеллы желчь желчных солей EPS матрица дисперсия
Желчь соли индуцированной биопленки в кишечных патогенов: методы для идентификации и количественной оценки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, K. P., Faherty, C. S.… More

Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter