Summary
このプロトコルにより、腸管病原体の付着、細胞外高分子物質マトリックス形成を評価することによって細菌のバイオ フィルムの動的な性質をキャプチャする多面的なアプローチを使用しての胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成を分析するリーダー分散。
Abstract
バイオ フィルム形成は、過酷な環境条件やストレスの時代下で細菌が発生するダイナミック ・多段階のプロセスです。胃腸管内輸送中と胆汁の露出、人間の消化の法線成分に腸内病原体の重要なストレス反応が誘起されます。胆汁の殺菌効果を克服するためには、多くの腸病原体は、小腸を通過するときに生存を許可するいると仮定バイオ フィルムを形成します。固相の付着試金と同様に細胞外高分子物質 (EPS) マトリックス検出と可視化によるバイオ フィルム形成を定義するための方法論をご紹介します。さらに、バイオ フィルム分散評価が感染プロセス中に細菌のリリースをトリガーするイベントの解析を模倣するように表示されます。クリスタル バイオレット染色、高スループット 96 ウェル プレートの付着試験で付着性細菌を検出するために使用されます。EPS 生産評価、すなわち 2 つの試金によって決まります顕微鏡 EPS 行列と多糖類の蛍光共役結合レクチンと半定量分析の染色します。最後に、コロニー カウントとめっきによるバイオ フィルムの分散を測定します。複数のアッセイから肯定的なデータは、バイオ フィルムの特性をサポートし、他の菌株による胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成を識別するために利用することができます。
Introduction
バイオ フィルム形成は、過酷な環境条件の中に誘起される重要な細菌の生存戦略です。殺菌の化合物への露出のように抗生物質や栄養の変化または酸素可用性がバイオ フィルム形成によって軽減することができます細菌のストレス状態を誘導します。バイオ フィルムは、サーフェスまたは他の細菌に細菌の付着によって特徴付けられるし、多糖類1,2,3の主にで構成される EPS 行列の分泌を伴います。バイオ フィルム形成はダイナミックなプロセスでイベントのカスケード成熟した付着性を有する細菌群集1,2,3の形成で絶頂に達する。細菌アドヘシン成熟バイオ フィルムの中に添付ファイルを強化する付着性遺伝子発現プロファイルをシフトさせながら初期添付ファイルを容易にするを生成します。同時に、EPS の生産は初期のストレスから細胞を保護するために行列に細菌群集のコートに発生します。バイオ フィルム内の細菌は、成長が遅い。そのため、レンダリングのほとんどの抗生物質は効果がないと。さらに、低成長は、細菌の増殖1,2,3を支持する条件を変更するまで、エネルギーを節約します。過酷な条件が過ぎた後、細菌はバイオ フィルムを分散し、浮遊性ライフ スタイル1,2,3を再開します。従来、バイオ フィルムは表面に観察される、感染貯水池カテーテルと住居のデバイス1,2,3に存在のための永続的な臨床的課題を表します。
バイオ フィルム形成最近述べたいくつかの腸病原体;小腸または結腸4感染細菌。赤痢菌種、の感染は人間のコロンの消化管の大部分を通過後に発生します。小腸を通過、中に赤痢菌が胆汁; にさらされています。同時にほとんどの細菌5を殺しながら、脂質の消化を容易にするために腸に分泌される脂質分解洗剤です。腸内の病原体は、胆汁6の殺菌の効果に抵抗するユニークな能力を持っています。私たちの最近の分析は生体内で活用-グルコースとs. 菌で堅牢なバイオ フィルム形成を示すため胆汁酸塩の組み合わせだけでなく、赤痢菌、病原性大腸菌、およびの他の種のようにサルモネラ4。以前は、サルモネラ血清型慢性感染症7,8,9,中に胆嚢のユニークな植民地化のため胆汁によるバイオ フィルムを形成する発疹チフスを示した10.11ビブリオカンピロバクター12先行研究が胆汁に対するバイオ フィルム形成を実証するさらに、します。したがって、分析は他の病原体に胆汁によるバイオ フィルム形成観察を拡張、胆汁に保存された腸内病原体応答のデモを確立するのに役立ちます。慢性的なバイオ フィルム細菌の遺伝子の転写は限られているし、細胞老化は1,2,3を発生することが, とは異なり腸胆汁によるバイオ フィルムがより本質的に一時的である提案します。この過渡病原性バイオ フィルムはように品質証明され急速な分解 (分散分析で見られる) と、バイオ フィルムの人口4,6で観察された病原性遺伝子発現を強化します。
バイオ フィルム形成は多面的なダイナミックなプロセス、および胆汁酸塩の使用開始因子が最近最も腸内病原体の説明だけされて、ツールやテクニックを使用は、従来の方法のユニークで創造的なアプリケーションです。したがって、ここでは胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成、バイオ フィルムから細菌付着、EPS 行列の生産と生菌数の分散を含むいくつかの重要な特徴を定量化するための 3 つの無料戦略。これらのテクニックは、赤痢菌の研究に主に利用されています。したがって、他の腸管病原体の評価が最適化を必要とします。それにもかかわらず、3 つすべてのアッセイから肯定的なデータはバイオ フィルムの識別をサポート、胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成の再現可能なプロトコルを確立します。
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Protocol
1. 試薬の調製
- 胆汁酸塩培地: トリプシン大豆スープ (TSB) 0.4% の胆汁酸塩 (重量/体積) を含むを準備、50 mL の胆汁酸塩 200 mg を再懸濁しますオートクレーブ TSB。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。毎週新鮮な媒体を作る。
ノート: 定期的に使用される胆汁酸塩は、コール酸ナトリウムと羊や牛の胆嚢から分離されたデオキシ コール酸ナトリウムの 1:1 混合物です。先ほど説明した4グルコースの存在が胆汁酸塩によるバイオ フィルムの形成のため必要でした。TSB がルリア ベルターニカミラ (LB) のスープを基準にしてグルコースを追加します。したがって、赤痢菌分析その他の腸内の病原体のバイオ フィルム形成を誘導するのに十分だったし、。分析する細菌によって別グルコース濃度または別の砂糖の要件が必要な場合があります。 - 0.5 水に %w/v クリスタル バイオレット: 500 ml の蒸留水でクリスタル バイオレットの 2.5 g を溶かします。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。
- コンカナバリン A (ConA) かに (FITC) に共役: 1 × PBS で株式を再構成します。集中 10 mg 株式を 25 μ G/ml の最終的な集中に 1 × PBS の 400 μ l を希釈し、光から保護します。
- PBS + ブドウ糖: 10 mL の 1x PBS (最後の血糖値 2 w/v) で 0.2 グラムのブドウ糖を溶解します。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。使用の日に新鮮なを確認します。
- PBS + 胆汁酸塩: 溶解 10 mL の 1x PBS で 40 mg (0.4% 胆汁酸塩最終的な w/v)。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。使用の日に新鮮なを確認します。
- PBS + グルコースと胆汁酸塩: 40 mg 胆汁酸塩と 10 mL の 1x PBS (0.4 %w/v 胆汁酸塩および 2 %w/v グルコース最終) の 0.2 グラムのブドウ糖を溶解します。フィルターは、0.22 μ m フィルターを使用して滅菌します。使用の日に新鮮なを確認します。
- LB 寒天培地プレートを準備します。
- ホルムアルデヒド ・ グルタルアルデヒド修正: 追加 810 μ L のホルムアルデヒド (37% 原液、最終濃度 3%) および 125 の μ L グルタールアルデヒド (25% 原液、最終濃度 0.25%) 14 mL の 1x PBS。徹底的にミックスし、4 ° C で保存修正プログラムは、適切な使用のため寒いはずです。
注意: この修正プログラムは毒性があり有害廃棄物処理が必要です。 - Antifade フィルターとフィルター ソリューション: 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 汚れを含む antifade フィルターとフィルター ソリューションを使用して、細菌の DNA を蛍光染色しながら蛍光顕微鏡観察試料の変質を阻害します。
2. 細菌の準備
- 無菌培養管の単一、独立した植民地と TSB の 3 mL を接種によってテストする細菌の緊張の一夜の文化を育てます。37 ° C で一晩インキュベート (16-24 h) の 225 rpm で振とうしながらインキュベートします。
注: 系統必要がありますされる restreaked 冷凍庫株からすべて 2 4 週間とに上で保持板にない 2 週間以上古い。
3. 固相付着試験
注: このアッセイは、96 ウェル プレート法を用いた細菌の付着を定量化します。細菌は、底が平らなプレートに静的に栽培しています。洗濯を行って非付着細菌を排除して細菌付着がクリスタル バイオレットで染色します。水晶バイオレットの汚れは細菌の細胞壁のペプチドグリカンをバインドし、エタノールを用いた可溶化します。付着性細菌の数は、クリスタル バイオレットの保持に基づいて決定されます。
- 2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + 胆汁酸塩 (BS) とラベルを付けます。
- それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。
- 一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 で希釈)。
- 滅菌、クリア、平底、組織培養治療 96 ウェルのプレートで空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 130 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。3 つのコントロール井戸 (TSB、TSB + BS) テストする各メディアの種類の設定します。
- 3 つの井戸に接種した培の 130 μ L/ウェルを追加し、3 通すべての実験条件をめっきまで繰り返します。
- 静的に 37 ° C で 4-24 時間インキュベートします。
- プレート リーダーを使用して、外径600を記録します。'Blank' として制御井戸を設定します。濁度の証拠と明確な制御媒体を確認します。任意の濁度が検出された場合は、実験を破棄します。菌株間の成長率に有意差がある場合、データを正規化する外径 φ600の値を使用できます。
- プレートを軽く傾斜して井戸の下の端にある媒体をゆっくり吸引真空ラインを使用して培養液を削除します。必ずプラスチックの表面に位置する付着性細菌の人口を中断させることがなくすべての培養液を収集してください。EPS の行列は、培養時間の間に作り出されたマトリックスが白い沈殿として視覚化されます。EPS マトリックスを操作不可します。
- 軽く 200 μ L 滅菌 PBS で 1 回洗浄します。真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。
- 乾燥するプレートを反転します。乾燥する 20 分の最小値を許可します。
注: バイオ フィルムを染色する前に完全に乾燥する必要がありますので、プロトコルは、数時間のこの段階で一時停止また更に夜通し。不完全な乾燥結果と再現性の定量化に影響を与えます、追加乾燥時間は汚損プロシージャに変わりません。 - まあ 150 のそれぞれ実験的に 0.5% クリスタル バイオレットの μ L とコントロールを追加します。
- 室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。
- 一度蒸留水 400 μ L で洗浄します。追加されたボリュームは、井戸の側面から残留クリスタル バイオレット染色を削除するのに役立ちます。真空ラインの洗浄を削除します。
- 蒸留水を 200 μ l 添加で 5 回洗浄します。真空ラインの洗浄を削除します。
メモ: 徹底的に洗浄は、定量化のため重要です。空白の井戸が蒸留水から明らかが、任意の残留クリスタル ・ バイオレットの汚れが含まれていないときは、次の手順に進みます。 - 光から保護、乾燥するプレートを反転します。前述のようにプレートの完全乾燥を確認します。
- 95% エタノール 200 μ L で井戸をすすぐ。30 分間、シェーカーでプレートを孵化させなさい。特に高温で蒸発を避けるために 4 ° C でこの手順を実行します。
- プレート リーダーを使用して、外径540を記録します。
注: クリスタル ・ バイオレットの最大吸収波長は近く 590 nm。文献報告から外径540 - 外径5954,13,14,15,16クリスタル バイオレット吸光度の範囲このようにプレート リーダーに基づいて使用可能な波長を選択します。
4. EPS マトリックス検出
注: これらの無料試定量化し、EPS を可視化します。どちらも、多糖類をバインドするレクチンを用いた EPS が検出されました。蛍光共役タンパク質により定量化 (手順 4.1) か (ステップ 4.2) の可視化ができます。
- EPS の半定量的検出
- 2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + BS 付きのラベル。
- それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。
- 一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 希釈)。
- 滅菌、黒、平底、組織培養治療 96 ウェルのプレートで空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 130 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。テストする各メディアの種類の 3 つのコントロールの井戸を設定します。接種した培の 130 μ L/ウェルを井戸に追加し、3 通すべての実験条件をめっきまで繰り返します。
- 静的に 37 ° C で 4-24 時間インキュベートします。
- 培養液を理想的にマルチ チャンネル ピペット ピペットを明確 96 ウェル プレートに転送します。付着性の人口および/またはプラスチックの表面に位置する EPS を中断させることがなくすべての培養液を収集するために慎重になります。脇を設定します。
- 1x PBS で 200 μ L/ウェルのホルムアルデヒド ・ グルタルアルデヒドを用いた常温 15 分用黒色プレートを修正します。
- 付着性の人口を固定すると、ステップ 4.1.6 から上清画分と評価します。プレート リーダーを使用して、外径600を記録します。'Blank' として制御井戸を設定します。濁度の証拠と明確な制御媒体を確認します。任意の濁度が検出された場合は、実験を破棄します。
- また、黒い透明な底板の全体の分析を実行できます。このような状況で OD600の値を記録することができ、4.1.7 をステップに進む前にその後培養液を破棄できます。外径600値をデータの正規化に使用できます、場合に菌株間成長率に有意差があります。
- 修正プログラムを削除し、有害廃棄物の処分します。
- 200 μ L/ウェル滅菌 pbs で 2 回井戸を優しく洗います。プレートを軽く傾斜して井戸の下の端では、洗浄をゆっくり吸引真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。
- 25 μ g/mL、ConA FITC の 150 μ L/ウェルを追加し、室温に 15 分間インキュベート
- 200 μ L の PBS で 2 回やさしく洗います。
- 150 μ L の PBS を各ウェルに加えます。488 で蛍光を記録 nm。
- 共焦点顕微鏡可視化 EPS 生産とバイオ フィルムの厚さの計算
- 2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + BS 付きのラベル。
- それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。
- 一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 で希釈)。
- 滅菌ガラス coverslips ラウンド 12 mm 滅菌 24 ウェル プレートを設定します。空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 400 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。テストする各メディアの種類の 3 つのコントロールの井戸を設定します。
- 、重複での井戸に接種文化の 400 μ L を追加し、すべての実験条件をメッキまで繰り返します。
- 静的に 37 ° C で 4-24 時間インキュベートします。
- TSB 条件、成長および EPS 沈殿物 (白) TSB + BS 状態で成長ない成長および滅菌コントロール ウェルズに白い沈殿物を視覚的に確認します。培養上清を削除します。
- 1x PBS でのホルムアルデヒド ・ グルタルアルデヒド溶液 200 μ L/ウェルを使用して RT で 15 分を修正しました。
- 修正プログラムを削除し、有害廃棄物の処分します。
- 200 μ L/ウェル滅菌 pbs で 2 回井戸を優しく洗います。真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。
- 25 μ g/mL ConA FITC の 150 μ L/ウェルを追加し、室温に 15 分間インキュベート
- 軽く 200 μ L/ウェルの PBS で 2 回洗います。
- DAPI と antifade フィルターとフィルター ソリューションをマウントします。
注: ソリューションは、同時に、対比染色として、可視化細菌の細胞内の DNA を染色しながら蛍光ラベルを保持するために DAPI を含む既製、グリセリン ベース マウント ソリューションです。イメージングのサンプルの前にインキュベーション時間のキットの方向と推奨事項に従ってください。DAPI が含まれていない antifade フィルターとフィルター ソリューションを適用する前に、プロシージャを汚す DAPI を実行できます。 - 共焦点顕微鏡による評価します。共焦点顕微鏡レーザーを 495 nm/519 nm 励起/蛍光 FITC 可視化のために設定します。2 番目のレーザーを 360 nm/460 nm 励起/蛍光 DAPI を視覚化するために設定します。DAPI チャネルに焦点を当て、バイオ フィルムを探します。DAPI と FITC の両方のチャンネルを使用して完全な厚さを判断して上限を設定し、罫線を下部イメージングします。Z スタックの上下に境界を設定した後すべての 0.25 μ m の画像をキャプチャすることにより完全な厚さ Z スタック画像を記録します。共焦点顕微鏡の詳細についてを参照してください文書パドックらによって17,18,19,20
- ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) によるバイオ フィルム形成を視覚化し、バイオ フィルムの厚さを計算で 3 D 画像を再構成します。S. 菌胆汁酸塩によるバイオ フィルムの取得平均厚さ 14 μ m4であった。
5. 分散分析
注: このアッセイでは、バイオ フィルム細菌の分散性を介しての逆アセンブリが検出されます。ここでは、成熟したバイオ フィルムが確立され、その後 (通常翌日)、メディア、PBS に置き換えられますまたは PBS を添加しました。培養上清中のコンポーネントをバイオ フィルムから分離した細菌の数を量的に評価します。
- 2 つの 1.5 mL チューブを設定します。TSB や TSB + BS 付きのラベル。
- それぞれのチューブに TSB や TSB + BS の 1 mL を追加します。
- 一晩かけて培養の 20 μ L で管を接種する (、1:50 で希釈)。
- 滅菌、クリア、平底、組織培養治療 96 ウェルのプレートで空白のコントロールとして機能する 3 つの井戸に 130 μ L/ウェル無接種メディアを追加します。テストする各メディアの種類のための 3 つのコントロール井戸を設定します。
- 3 つの井戸に接種した培の 130 μ L/ウェルを追加し、すべての実験条件が 3 通でメッキまで繰り返します。
- 37 ° C で 4 24 h のプレートを静的にインキュベートします。
- 前に、PBS、PBS + ブドウ糖、PBS + 胆汁酸塩と PBS + 胆汁酸塩 + 37 ° C にグルコースを暖めるこれらの試薬の新鮮な毎日を準備します。
- プレート リーダーを使用して、外径600を記録します。'Blank' として制御井戸を設定します。濁度の証拠と明確な媒体を確認します。任意の濁度が検出された場合は、実験を破棄します。菌株間の成長率に有意差がある場合、データを正規化する外径 φ600の値を使用できます。
- 真空ラインを使用して培養液を削除します。必ずプラスチック表面に付着性の人口を中断させることがなくすべての培養液を収集してください。
- 200 μ L/ウェル滅菌 pbs で 2 回井戸を優しく洗います。真空ラインを使用して PBS 洗浄を削除します。
- 3 つの井戸に次の 130 μ L/ウェルで洗浄を置き換えます: PBS、PBS + ブドウ糖、PBS + 胆汁酸塩と PBS + 胆汁酸塩ブドウ糖。これらの試薬は、あらかじめ 37 ° C に加温する必要があります。
- 37 ° C で 30 分の版を孵化させなさい
- 37 ° C の定温器からプレートを慎重に取り外します。新鮮な生殖不能の 96 ウェル プレートに培養上清を転送します。
- 96 ウェルのプレートまたは希釈のブロックを使用して準備を 10 倍 (1:10) 滅菌 PBS に上澄みのシリアル希薄。
注: 希釈系列ではテストする菌株によって 10-6原液から範囲する必要があります。パイロット実験は、最適な希釈範囲を決定する実行できます。 - スポットは、マルチ チャンネル ピペットを使用して LB 寒天培地の上にそれぞれの希釈の 5 μ L をプレートします。37 ° C で一晩インキュベートします。回復コロニー (CFU) の単位を形成を決定する際、翌日と希釈倍率のアカウントにコロニーを数えます。(100% で設定) PBS コントロール x 1 基準 % 分散を計算するには、1 × PBS コントロールのサンプルから CFU の回復によって各処理条件から回復 CFU を割ります。
注: 興味の細菌の緊張のためのルーチン メディア プレートを使用もできます。たとえば、赤痢菌は、コンゴ赤板にめっきすることが。プレートが適切なスポットめっき技術の乾燥を確認します。
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Representative Results
図 1、胆汁酸塩を含んでいる媒体で六つの腸病原体テスト次の成長のほとんどのバイオ フィルム形成が誘導されます。付着性細菌の胆汁酸塩の露出はほぼすべての株で観察される後の大幅な増加をテストしました。例外は絋エシェリヒア属大腸菌(EAEC);ただし、Δaaf変異4の誘導の観察。結果を示すこと追加接着機構による蚕付着毛のない状態で EAEC の胆汁酸塩の露出私 (AAF/私)21。このデータ セットから結論をテストされるひずみおよびメディアの種類ごとに外径540値をプロットします。メディア コントロールの各ひずみの値を比較 (-BS) メディアに対する胆汁酸塩が含まれているを決定する胆汁酸塩によってバイオ フィルム形成が有意に誘発するかどうか。さらに特性評価解析の細菌および/または突然変異体の間での比較が行えます。
EPS の ConA FITC 評価は図 2で示されます。図 2 aは、ConA FITC がバイオ フィルムの汚れに使われている EPS 生産の半定量的評価を表します。ConA が EPS 行列の多糖類に結合し、蛍光プレート リーダーによって保持量が検出されました。データを表示するには、各条件の平均蛍光ユニットをプロットし、ネガティブ コントロールにバイオ フィルムを誘発する条件を比較します。さらに、細菌の緊張または突然変異体間で比較を実行できます。背景プレートが発生する ConA FITC 蛍光の量を決定するメディアのみ、否定的な制御を分析するが重要です。TSB 条件が大幅に異なる蛍光測定値大幅増加次胆汁酸塩曝露中のメディア コントロールでした。データは EPS 生産はバイオ フィルム形成の示していることを確認してから、 s. 菌のため胆汁酸塩の不在では発生しません。S. 菌で胆汁酸塩によるバイオ フィルムのイメージは図 2 b.で表されますConA FITC は、DAPI 対比染色、DNA を染色によって細菌を視覚化に使用されます EPS 行列の多糖類の染色に使用されます。細菌の胆汁酸塩 (マイナス コントロール) にさらされない、DAPI のみが検出されました。特に、細菌の密度は、胆汁酸塩の状態よりもはるかに低いです。EPS の生産の不足を示す FITC チャンネルで明確な背景が得られます。予想通り、データは EPS 生産バイオ フィルム形成1,2,3を胆汁酸塩曝露と相関していることを示しています。胆汁酸塩処理サンプルのコントロールを染色 - ConA FITC 蛍光の特異性を示す提供しています。これらの画像は 1x PBS は、ConA FITC の代わりに使用され、DAPI 対比染色が維持されました。EPS 正サンプル4バイオ フィルムの厚さを評価する共焦点顕微鏡とイメージングを実行できます。
図 3にバイオ フィルムから細菌の分散は、PBS または補われた PBS で確立されたバイオ フィルム インキュベーターによって検出されます。生理的には、胆汁が小腸の循環に再吸収され、胆汁のわずか 5% に入るコロン5。赤痢菌が大腸の上皮侵入として頻出胆汁の再吸収がバイオ フィルムの分散のための重要な信号です。この図では、PBS または PBS + ブドウ糖; にさらされるバイオ フィルムで分散が発生しますただし、分散、PBS + ブドウ糖の有無にかかわらず胆汁酸塩で抑制されます。データは、胆汁酸塩の除去は、必要かつ十分な胆汁塩誘起バイオ4からs. 菌の拡散を誘発することを示しています。データをプロットするには、細菌の回復 CFU またはコントロール (下図) に相対的な割合のいずれかをプロットできます。
図 1: 胆汁酸塩は、腸管病原体のバイオ フィルム形成を誘発する。18 h のバイオ フィルムは、TSB や TSB + 0.4% の胆汁酸塩のメディアで扱われる培養 96 ウェル プレートで栽培され、0.5% クリスタル バイオレットで染色します。水晶バイオレットの汚れのエタノール可溶化に基づく定量値は、外径540で吸光光度法により決定しました。胆汁酸塩露出増大赤痢菌 s. 赤痢、急性胃腸炎起因菌バイオ フィルム形成性大腸菌、サルモネラ血清型発疹チフスと米由来型ネズミチフス菌。統計的有意性は、メディア コントロールに胆汁酸塩処理を比較する各緊張にスチューデントの T 検定によって決定されました。(SEM) 平均値の標準誤差は、エラー バーで表されます。すべてのp-値が < 0.0001。表示されるデータは、1 つから (n = 3)、前文書4で提供されたデータの完全なセットの代表的な実験。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成は FITC 標識コンカナバリン a が検出された EPS 行列の生産によって特徴付けられる(A) 無菌黒、96 ウェル プレートは、1:50 でs. 菌と播種 TSB や TSB + 胆汁酸塩に希釈と 18 h バイオ フィルムは、優しく洗浄しとステンド グラスの ConA FITC 修正されたために育てられます。剰余金 Concanavalin-A FITC の蛍光プレート リーダーによって決まります。プロットされた値は、EPS 定量化菌 S. TSB や TSB を含む胆汁酸塩の成長の成長を示しています。意義は、一方向の分散分析によって決定された、 p -値が < 0.01。SEM は、誤差の範囲で表されます。表示されるデータは、1 つから (n = 3)、前文書4で提供されたデータの完全なセットの代表的な実験。(B) 顕微鏡は、胆汁酸塩による赤痢菌バイオ フィルムから画像します。滅菌 coverslips は、1:50 でs. 菌と播種 TSB や TSB + 胆汁酸塩の希釈、18 h の成長します。Coverslips でしたその後固定 ConA FITC で染色および DAPI で counterstained。ConA FITC は、EPS のマトリックスの存在のため胆汁酸塩の状態でのみ検出されました。共焦点顕微鏡の FITC の設定の最小のバック グラウンド蛍光を示すのみで TSB + 胆汁酸塩治療 DAPI 染色 coverslip いました。各波長チャネルおよび複合オーバーレイ用の画像は、すべての治療条件を提供しています。スケール バーを示す 10 μ m. 表示されるデータは、1 つから (n = 3)、前文書4で提供されたデータの完全なセットの代表的な実験。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 胆汁酸塩によるバイオ フィルムから細菌の拡散の解析。胆汁酸塩による 18 h赤痢菌のバイオ フィルムが PBS またはグルコースと胆汁酸塩の組み合わせや胆汁酸塩、ブドウ糖と補われる PBS にさらされました。上清だったその後順次希釈し、寒天コロニー形成単位 (CFUs) バイオに分散を列挙するためのメッキします。回復した細菌の数は、PBS のコントロールを基準としてプロットしました。条件、PBS または PBS + グルコース バイオ フィルムから分散して細菌が胆汁酸塩の存在はバイオ フィルムから細菌の拡散を抑制するのに十分だった。表示されるデータは、1 つから (n = 3)、前文書4で提供されたデータの完全なセットの代表的な実験。参考のため 100 より多くの細菌は日常的に PBS コントロール治療 (約 7 × 107 CFU) PBS + 胆汁酸塩治療 (約 7 × 105 CFU) と比較してから回収されました。意義は、一方向の分散分析によって決定された、 p -値が < 0.0001。SEM は、誤差の範囲で表されます。
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Discussion
バイオ フィルム形成の分析は、バイオ フィルムとアッセイ研究所、材料株間変動の動的な性質のために挑戦です。ここでは、再現性を促進するために提供される実験的洞察力と胆汁酸塩の露出に続く腸管病原体のバイオ フィルム形成を決定するいくつかの方法が掲載されています。再現性を確保するための追加の考慮事項があります。第一に、それぞれの観測と発生する変動の統計的有意性を確認する技術的なトリプリケート実行する少なくとも 3 つの独立した実験をお勧めします。第二に、正と負のコントロールの使用は、測定の再現性を確保するために不可欠です。バイオ フィルム形成の変異を評価するとき、肯定的な制御として野生型株を使用するを強くお勧めします。また、バイオ フィルム形成に重要な遺伝子が識別されます (たとえば、22ビブリオ、サルモネラ7、および大腸菌23,24,25を参照) の使用ネガティブ コントロールとしてバイオ フィルムを突然変異体は、測定の再現性を検証します。第三に、上記の方法が特に赤痢菌と米菌研究に基づいています。プロトコルを調整評価各の腸病原体の成長要件に応じて必要があります。第四に、法測定細菌のストレス応答;したがって、それは凍結する在庫 (-80 ° C) または 2 週間以上 (最大 4 ° C) 冷蔵保管ストレージ プレートから適切に維持された細菌を使用する重要です。エルシニア属に腸内の病原体を含むいくつかの細菌が生菌数 0 の ° C の26に近い温度で育つことができることに注意してくださいすることが重要です。表現型変化27,28,29、強くお勧めの因数を準備するか、または細菌の生理学を変更して生じる可能性遺伝子型冷蔵温で貯蔵できますから、-80 ° c スターター文化に定期接種でストックの文化。さらに、臨床分離株での作業は、30,31 の設定研究所に臨床的に派生した菌株を遷移するときに急速に遺伝的変化が観察される-80 ° C 株からより頻繁に restreaks を必要とします。.特に赤痢菌の操作を分離株は急速に適応、表現型が変化発生多くの場合32,33。お勧め restreak 細菌冷凍庫株から一度、月、および restreak 在庫プレート 2 週間ごと。
再現性を確保するためのもう一つの重要な要因は、アッセイの変動を制限する胆汁酸塩メディアの新鮮な準備です。胆汁酸塩メディア 1 週間より前に、新鮮なメディアの準備で観測された堅牢な表現型悪影響を与えました。また、病原体と分析 (小腸大腸対) をように露出の種類、に応じてさまざまなソースや胆汁酸塩の混合物が必要。たとえば、個々 の胆汁酸塩、共役し、脱共役ソース、またはコレステロールやビリルビンがありますように追加胆汁構成成分を含む原油胆汁エキス活用5,6。赤痢菌の解析は転送中にホストにコロンで感染前に小腸の細菌の適応に焦点を当てています。したがって、コール酸、デオキシ コール酸の混合物の使用は、小腸5,6,34の条件を模倣します。また分散分析 (セクション 5) に関して、PBS 添加試薬は、新鮮な毎日を作られ、試金する前の 37 ° C に加温が指定されます。数日以上の試薬を用いて、アッセイの再現性だった深刻な危険にさらさ。また、事前室温試薬を用いる分散が容易に発生しませんでした、37 ° c これらの試薬を暖かく重要なだった。最後に、その超音波35,36または37酵素消化を含む、バイオ フィルム完全な価列挙体の評価のための分散方法が使用できます。分散分析へのアプローチは、回腸と結腸に赤痢菌通過として胆汁塩吸収の効果を評価する方に指示されました。分析は、胆汁酸塩の損失は一時的なバイオ フィルムの分散を有効にすることと、赤痢菌が大腸の上皮4,5 で感染症を引き起こす前にバイオ フィルムを分散する必要がありますの仮説に基づいていた.超音波処理と酵素消化などの条件は、ここで示した戦略エミュレート回腸結腸転移赤痢菌の生理学的な表現型をキャプチャすると、バイオ フィルムから微生物の固まりの合計リリースを表します。希望の実験条件等に応じて分散分析やバイオ フィルムの列挙型の追加のメソッド必要があります。
法は、複数の細菌および/または条件をテストできるように 96 ウェル プレートを用いるハイスループット適度に設計されています。さらにバイオ フィルム形成の再現性を組織培養処理をした平底、96 ウェルのプレートが使用されました。技術的な理由により、プレート リーダーは、吸光度または蛍光丸底プレートで正確に測定できません。さらに、コーティングされていない板は現在調査の道である赤痢菌で変数準拠プロファイルを提供しています。法は比例して大きいよくフォーマットにスケールできますが、実験の効率を減らすことができるプロトコルの変更が必要になります。たとえば、文化メディアはキュベット分光光度計と OD600の値を記録するために転送する必要があります。さらに、クリスタル バイオレット染色バイオ フィルムを掻きすることができます 95% エタノールで 30-60 分インキュベーションを次のステップをすすぐし、外径540で分光光度計の測定値のキュベットに内容を転送できます。注意が必要各ウェルにバイオ フィルムの内容を壊すとき、水しぶきを避けるために、我々 は、廃棄が簡単 60 分インキュベーションを次を発見しました。
解析赤痢菌、サルモネラ、病原性大腸菌と4は繰り返し観測のバイオ フィルム形成が胆汁にさらされて腸内の病原体のため (24 h) 内で加速時間スケールで発生することを示した。通常の条件下でのバイオ フィルムの形成を観察する 48 に 72 時間を必要とする他の細菌とは逆に胆汁酸塩による腸内バイオ フィルムは初期接着性の段階の 4 時間も早く開始します。その後、EPS マトリックス形成は 6 h で明らかと成熟は、24 h で発生します。など、24 h での付着表現型が異なる付着バイオ フィルム形成要因の役割を解読するあまりにも堅牢な可能性があります。初期解析を実行するたとえば、早ければ 4 h を識別できます要因の後時点では獲得できない初期のバイオ フィルム形成に重要です。最後に、およびプロトコルの手順で上記のよう、赤痢のため胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成がグルコース4の不在で検出されませんでした。EPS マトリックス多糖類から主に成るが、ほとんど細菌38のバイオ フィルム形成の重要なステップはので、ブドウ糖またはメディアの他の砂糖の存在は最も可能性の高いバイオ フィルム形成を観察することが重要。分析、細菌病原体によって異なる基本メディア製剤は要求されるかもしれない。
バイオ フィルム形成はオープン システムでしばしば発生する多層化プロセス栄養塩フラックスと滑らかな動作は容易に1,2,3発生します。メソッドは、閉じた文化や静的成長の要件によって制限されます。ただし、メソッドは、実験室の設定でバイオ フィルム形成の評価を有効にします。バイオ フィルムの表現型の識別、時にさらに実験流体セルまたは連続培養戦略39,40,41可能性があります洞察を提供機構生理や臨床バイオ フィルム形成の重要性EPS 行列の識別のためのプロトコルは多糖結合レクチン ConA を使用します。ConA α D 糖または立体-密接に関連残42にバインドします。異なるレクチン EPS 異属または種の生成の種類に応じて必要があります。EPS 生産を識別するための代替戦略は質量分析法、EPS が生成される EPS マトリックス43,44の組成を決定する、両方の検証を提供します。また、DAPI 対比染色の使用は、細菌バイオ フィルムや EPS マトリックス45,46にある多くの場合細胞外 DNA の発生の数を考えるとかなりの明るさにつながります。
文献に記載されている上記の方法に代わる方法があります。たとえば、他の病原体 (たとえば、参照4,25,47,48,49) で使用するため固相結合の試金を報告されています。出版物間のプロトコルに変更があります。したがって、ここで説明する方針、複製簡単形式.プロトコル指定前の染色 (ステップ 3.10) にバイオ フィルムを修正するいくつかのグループを好む乾バイオ フィルムであることに注意してくださいすることが重要です。病原体固有の方法を変化させる 2 つの異なるアプローチがあります。さらに、水のクリスタル ・ バイオレットの汚れの準備、一貫性のあるバイオ フィルム形成表現型が検出されました。他のグループがクリスタル バイオレット; の可溶化エタノールを使用します。赤痢菌のバイオ フィルムの不安定化につながったし、再現性が危険にさらさ。我々 は現在、エタノール可溶性赤痢菌バイオ フィルムにことができる要因を調べています。別の例は、ConA の汚損によって EPS 生産の数量です。96 ウェル プレート蛍光検出法 (手順 4.1) は、バイオ フィルムに FITC 結合 ConA 結合量を反映した半定量的な値を決定するのに提示されます。私たちの知る限り、メソッドはこの戦略を報告されているの初めてです。顕微鏡検査による EPS 検出文献の受け入れし、EPS を視覚化するための異なる、しかし、無料、戦略が可能になります。EPS の共焦点顕微鏡による検出と組み合わせる半定量的蛍光検出は確かに特に DAPI 対比染色手順の制限は、上記顕微鏡による解析データを強化しました。すべてでは、ここで説明の試金のセットの重要な強さは、各テクニックが腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成の動的評価を生じに対する別のアプローチを補完するものです。
これらのメソッドはモデルの検証、特定の遺伝子の役割の確認、機能未知の遺伝子を識別し提供されるが予想されるように胆汁酸塩と病原性バイオ フィルムは腸管病原細菌のパラダイムに組み込まれ、臨床株の一般的な特性。この多面的なアプローチにより、一度成熟したバイオ フィルムを失われる可能性がありますバイオ フィルム形成の一側面で重要な遺伝子の識別を確立すると、そのための各細菌成分の特殊な関数の同定ができます、バイオ フィルム。さらに、ヒトの腸内で病原体の適応が急速に発生する現象であるという事実によって明白ように胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成の役割は、新しく評価、保存、および重要な現象の例赤痢菌追加腸管病原体と同様に、感染症。
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Disclosures
著者の開示があります。
Acknowledgments
テクニカル サポート、レイチェル B. チャニンとアレハンドロ リャノス Chea に感謝します。本研究で使用される系統、アンソニー ・ t. Maurelli、ブライアン p. ハーレー、アレッシオ ファザーノ、ブレット E. Swierczewski とボビー Cherayil に感謝します。この作品は、国立研究所のアレルギーと感染疾患グラント K22AI104755 (C.S.F.) によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
References
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