Summary
هذا البروتوكول يتيح للقارئ لتحليل تكوين بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في مسببات الأمراض المعوية باستخدام نهج متعدد الأوجه لالتقاط الطابع الدينامي للأغشية الحيوية البكتيرية بتقييم التقيد بتشكيل المصفوفة خارج الخلية مادة البوليمر، والتشتت.
Abstract
تشكيل بيوفيلم هو عملية دينامية ومتعددة المراحل التي تحدث في البكتيريا تحت ظروف بيئية قاسية أو أوقات الشدة. لمسببات الأمراض المعوية، هو فعل استجابة كبيرة من إجهاد أثناء العبور الجهاز الهضمي وعند التعرض الصفراء، عنصرا عادياً من الهضم البشرية. للتغلب على آثار جراثيم الصفراء، تشكل العديد من مسببات الأمراض المعوية بيوفيلم العينة للسماح بالبقاء على قيد الحياة عندما تمر عبر الأمعاء. وهنا يقدم منهجيات تحديد تشكيل بيوفيلم عن طريق فحوصات الالتزام المرحلة الصلبة، فضلا عن كشف المصفوفة خارج الخلية مادة البوليمر (EPS) والتصور. وعلاوة على ذلك، يرد بيوفيلم تشتت التقييم لتقليد تحليل الأحداث التي تسبب إطلاق سراح بكتيريا أثناء عملية العدوى. صبغة الكريستال البنفسجي يستخدم للكشف عن البكتيريا ملتصقة في مقايسة التزام الفائق 96-جيدا لوحة. تقييم إنتاج EPS يتحدد بفحوصات اثنين، هما مجهرية تلطيخ مصفوفة EPS وتحليل شبه كمي مع يكتين ملزمة السكاريد مترافق فلوريسسينتلي. وأخيراً، وتشتت بيوفيلم يقاس من خلال التهم مستعمرة والطلاء. بيانات إيجابية من فحوصات متعددة دعم توصيف الأغشية الحيوية، ويمكن أن تستخدم لتحديد تكوين بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في السلالات البكتيرية الأخرى.
Introduction
تشكيل بيوفيلم استراتيجية بقاء بكتيرية هامة التي يسببها خلال الظروف البيئية القاسية. التعرض لمركبات جراثيم مثل المضادات الحيوية أو التغييرات في المغذيات أو توافر الأوكسجين يدفع دولة أكد في البكتيريا التي يمكن تخفيفها من خلال تشكيل بيوفيلم. بيوفيلم يتسم بمرفق البكتيرية إلى سطح أو غيرها البكتيريا ومصحوبا بإفراز مصفوفة EPS تتألف أساسا من السكريات1،،من23. تشكيل بيوفيلم هو عملية دينامية الذي يتوج سلسلة أحداث في تشكيل مجتمع ناضج بكتيرية ملتصقة1،2،3. البكتيريا تنتج أدهيسينس لتيسير مرفق المبكر بينما تتحول ملامح التعبير الجينات أدهيسين لتعزيز مرفق أثناء النضج بيوفيلم. في الوقت نفسه، يحدث إنتاج EPS إلى معطف المجتمع البكتيري في مصفوفة لحماية الخلايا من الضغوطات الأولية. البكتيريا الواردة داخل بيوفيلم هي بطيئة النمو؛ وعلى هذا النحو، يجعل معظم المضادات الحيوية غير فعالة. وعلاوة على ذلك، يحفظ بطء نمو الطاقة حتى تتغير الظروف لصالح النمو البكتيري1،،من23. بعد أن مرت ظروف قاسية، تفريق بيوفيلم البكتيريا واستئناف حياة العوالق1،2،3. تقليديا، الأغشية الحيوية لوحظت على السطوح وتمثل تحديا سريرية مستمرة سبب الإصابة الخزانات الحالية في القسطرة وفي مسكن الأجهزة1،،من23.
ووصفت تشكيل بيوفيلم مؤخرا لعدة مسببات الأمراض المعوية؛ البكتيريا التي تصيب الأمعاء الدقيقة أو القولون4. للأنواع دوسنتاريا ، العدوى يحدث في القولون البشرية بعد عبور من خلال معظم الجهاز الهضمي. أثناء المرور عبر الأمعاء الدقيقة، يتعرض دوسنتاريا الصفراء؛ منظفات اللاإنسانية الدهن ويفرز في الأمعاء لتسهيل الهضم الدهون بينما قتل معظم البكتيريا5في وقت واحد. مسببات الأمراض المعوية بقدرة فريدة على مقاومة آثار جراثيم الصفراء6. استخدام لدينا التحليل مؤخرا في فيفو--مثل تركيبات من الجلوكوز وأملاح الصفراوية لإثبات تكوين بيوفيلم قوية في فليكسنيري س. وكذلك الأنواع الأخرى المسببة للأمراض دوسنتاريا، الإشريكيّة القولونية، و السالمونيلا4. سابقا، سرفار انتيريكا السالمونيلا التيفية أبدى لتشكيل بيوفيلم المستحثة الصفراوية بسبب استعمار فريدة من المرارة أثناء العدوى المزمنة7،،من89، 10. بالإضافة إلى ذلك، أثبتت البحوث السابقة مع الضمة11والعطيفه12 بيوفيلم تشكيل استجابة الصفراء. ولذلك، التحليلات الموسعة الملاحظات تشكيل بيوفيلم المستحثة الصفراء لمسببات الأمراض الأخرى وتساعد في إقامة مظاهرة رد الممرض المعوي يحافظ على الصفراء. خلافا للأغشية الحيوية المزمنة التي الجينات البكتيرية النسخ محدودة ويمكن أن تحدث الشيخوخة الخلية1،2،3، نقترح أن بيوفيلم التي يسببها الصفراوية المعوي أكثر عابرة في الطبيعة. هذه العابرة، بيوفيلم ضراوة هو المدموغة بتفكيك سرعة (كما رأينا في تحليل التشتت) وتعزيز التعبير الجيني الفوعة لوحظت في4،السكان بيوفيلم6.
كما تشكيل بيوفيلم هو عملية متعددة الأوجه، ودينامية، واستخدام أملاح الصفراوية كعامل التفجير تم وصف مؤخرا لمسببات الأمراض المعوية الأكثر فقط، الأدوات والتقنيات المستخدمة تطبيقات فريدة من نوعها ومبتكرة من الأساليب التقليدية. وهكذا، المعروضة هنا ثلاث استراتيجيات مجانية لقياس العديد من الخصائص الهامة لتشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية، بما في ذلك التقيد البكتيرية، إنتاج مصفوفة EPS، وتشتت من البكتيريا قادرة على البقاء من بيوفيلم. وقد استخدمت هذه التقنيات أساسا للبحث مع دوسنتاريا؛ وبالتالي، تقييم مسببات الأمراض المعوية الأخرى قد تتطلب التحسين. ومع ذلك، بيانات إيجابية من جميع الاختبارات الثلاثة دعم تحديد الأغشية الحيوية ووضع بروتوكولات استنساخه لتشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الكواشف
- الأملاح الصفراء المتوسطة: إعداد مرق الصويا تريبتيك (TSB) التي تحتوي على أملاح الصفراوية 0.4% (الوزن/الحجم)، ريسوسبيند 200 ملغ أملاح الصفراوية في 50 مل TSB يعقم. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. جعل متوسطة جديدة أسبوعيا.
الملاحظات: أملاح الصفراء التي تستخدم بشكل روتيني خليط 1:1 كوليت الصوديوم والصوديوم ديوكسيتشولاتي معزولة عن جالبلاديرس الأغنام والأبقار. كما هو موضح سابقا4، كان وجود الجلوكوز المطلوب لتشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية. وقد أضيف TSB الجلوكوز بالنسبة مرق لوريا بيرتاني (رطل)؛ ولذلك ليس كافياً للحث على تشكيل بيوفيلم دوسنتاريا ومسببات الأمراض المعوية الأخرى تحليلها. قد يلزم تبعاً للبكتيريا تحليلها، تركيزات الجلوكوز مختلفة أو متطلبات مختلفة من السكر. - 0.5% w/v الكريستال البنفسجي في المياه: حل 2.5 g من الكريستال البنفسجي في 500 مل مقطر من الماء. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
- كونكانافالين A (كونا) يضاف إلى fluorescein isothiocyanate (فيتك): إعادة تشكيل المخزون في برنامج تلفزيوني 1 x. تمييع الأسهم 10 ملغ مركزة مع 400 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x إلى تركيز نهائي من 25 ميكروغرام/مل، وحماية من الضوء.
- برنامج تلفزيوني + الجلوكوز: يحل الجلوكوز ز 0.2 في برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل (2% w/v الجلوكوز النهائي). تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. جعل الطازجة في يوم الاستخدام.
- برنامج تلفزيوني + أملاح الصفراء: حل 40 مغ في برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل (0.4% w/v الصفراوية أملاح النهائي). تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. جعل الطازجة في يوم الاستخدام.
- برنامج تلفزيوني + الجلوكوز والأملاح الصفراوية: تذوب الأملاح الصفراوية 40 مغ والسكر ز 0.2 في برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل (0.4% w/v الأملاح الصفراوية و 2% w/v الجلوكوز النهائي). تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. جعل الطازجة في يوم الاستخدام.
- إعداد لوحات أجار رطل.
- إصلاح فورمالدهايد/جلوتارالديهيدي: 810 إضافة ميليلتر فورمالدهايد (حل الأسهم 37%، 3% تركيز النهائي) و 125 glutaraldehyde ميليلتر (حل الأسهم 25%، وتركيز 0.25% النهائي) إلى برنامج تلفزيوني 1 x مل 14. مزيج دقيق وتخزينها في 4 درجات مئوية. يجب أن يكون الإصلاح الباردة للاستخدام الصحيح.
تنبيه: الإصلاح هو السامة ويتطلب التخلص من النفايات الخطرة. - الحل مونتانت أنتيفادي: استخدام محلول مونتانت أنتيفادي يحتوي على 4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وصمة عار لتمنع فوتوبليتشينج عينات مجهرية إيمونوفلوريسسينت أثناء فلوريسسينتلي تلطيخ الحمض النووي للبكتيريا.
2-إعداد البكتيريا
- تنمو الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات البكتيرية لفحصها بتطعيم 3 مل TSB مع مستعمرة وحيدة ومعزولة جيدا في أنبوب ثقافة عقيمة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة للحضانة بين عشية وضحاها (ح 16-24).
ملاحظة: سلالات ينبغي أن يكون ريستريكيد من الأرصدة المجمد كل 2 إلى 4 أسابيع، وحافظت على لوحات لا أكثر من 2 أسابيع من العمر.
3-المرحلة الصلبة التقيد بالانزيم
ملاحظة: هذا التحليل الكمي البكتيريا ملتصقة باستخدام أسلوب لوحة 96-جيدا. وتزرع البكتيريا بشكل ثابت في لوحات مسطحة القاع. يتم تنفيذ عملية الغسيل لإزالة البكتيريا غير ملتصقة والبكتيريا ملتصقة ملطخة بالكريستال البنفسجي. وصمة الكريستال البنفسجي يربط بيبتيدوجليكان في جدار الخلية البكتيرية، ويمكن أن يكون سولوبيليزيد باستخدام الإيثانول. يتم تحديد العدد البكتيريا ملتصقة استناداً إلى الاحتفاظ بالكريستال البنفسجي.
- إعداد أنبوبين 1.5 مل. قم بتسمية مع لجان أو لجان + الأملاح الصفراوية (درجة البكالوريوس).
- أضف 1 مل من لجان أو لجان + بكالوريوس للأنابيب الخاصة بكل منها.
- تلقيح الأنابيب مع 20 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها (في 01:50 إضعاف).
- في صفيحة 96-جيدا العقيمة، واضحة، مغلوطاً، المعالجة بزراعة الأنسجة، إضافة 130 ميليلتر/جيدا لمراقبة أونينوكولاتيد وسائل الإعلام إلى ثلاثة آبار ليكون بمثابة عنصر التحكم فارغاً. قم بإعداد ثلاثة آبار مراقبة لكل نوع من أنواع الوسائط (TSB و TSB + بكالوريوس) لفحصها.
- إضافة 130 ميليلتر/جيدا من الثقافة الملقحين في ثلاثة آبار، وكرر حتى يتم مطلي بكافة الشروط التجريبية في ثلاث نسخ.
- احتضانها ح 4-24 في 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
- استخدام قارئ لوحة، سجل OD600. آبار مراقبة ك 'فارغة'. تأكيد المتوسطة التحكم الواضح مع أي دليل على التعكر. إذا تم الكشف عن أي التعكر، تجاهل هذه التجربة. يمكن استخدام قيم600 OD تطبيع البيانات إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في معدل النمو بين السلالات البكتيرية.
- إزالة المتوسطة الثقافة باستخدام خط فراغ بإمالة اللوحة بلطف وبطء يسفط المتوسط عند الحافة السفلي من البئر. تأكد من جمع جميع المتوسط الثقافة دون تعطيل السكان بكتيرية ملتصقة الموجود على سطح البلاستيك. إذا كان إنتاج مصفوفة EPS خلال فترة حضانة المرض، سوف يمكن تصور المصفوفة ترسبات بيضاء. عدم الإزعاج المصفوفة EPS.
- تغسل برفق الآبار مرة واحدة مع 200 ميليلتر PBS العقيمة. قم بإزالة برنامج تلفزيوني الغسيل باستخدام خط فراغ.
- عكس اللوحة لتجف. يسمح كحد أدنى من 20 دقيقة الجاف.
ملاحظة: حيث يجب أن تجفف بيوفيلم دقة قبل التلوين، البروتوكول يمكن أن تكون متوقفة مؤقتاً في هذه الخطوة لبضع ساعات أو حتى ليلة وضحاها. وقت التجفيف وأضاف لن يغير هذا الإجراء المصبوغة بينما التجفيف غير مكتملة سوف تؤثر على القياس الكمي للنتائج وإمكانية تكرار نتائج. - إضافة 150 ميليلتر بنفسجي كريستال 0.5% لكل التجارب والتحكم جيدا.
- احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- غسل الآبار مرة واحدة مع 400 ميليلتر من الماء المقطر. وحدة التخزين المضافة يساعد على إزالة البقع المتبقية الكريستال البنفسجي من الجانبين من الآبار. إزالة الغسيل مع خط فراغ.
- غسل الآبار خمس مرات مع 200 ميليلتر من الماء المقطر. إزالة الغسيل مع خط فراغ.
ملاحظة: المهم غسيل شامل للقياس الكمي. عندما تكون واضحة من الماء المقطر الآبار فارغة ولا تحتوي على أي وصمة عار المتبقية الكريستال البنفسجي، تابع إلى الخطوة التالية. - عكس اللوحة لتجف، محمية من الضوء. ضمان التجفيف الكامل لصفيحة كما ذكر أعلاه.
- ديستاين الآبار مع 200 ميليلتر من الإيثانول 95%. احتضان لوحة على شاكر لمدة 30 دقيقة. لتجنب التبخر، وبخاصة عند درجات حرارة أعلى، بإجراء هذه الخطوة في 4 درجات مئوية.
- استخدام قارئ لوحة، سجل OD540.
ملاحظة: الطول الموجي لامتصاص الحد الأقصى من البنفسجي كريستال بالقرب من 590 نانومتر. تقارير الأدب مجموعة من التفجير المكشوف540 -OD5954،13،14،،من1516 لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية كريستال؛ ومن ثم اختر طول موجي متوفرة استناداً إلى قارئ لوحة.
4-EPS مصفوفة الكشف
ملاحظة: هذه فحوصات مجانية كمياً وتصور EPS. EPS في كليهما، يتم الكشف عن استخدام يكتين لربط السكريات. يسمح البروتين مترافق فلوريسسينتلي القياس الكمي (الخطوة 4.1) أو التصور (الخطوة 4، 2).
- كشف شبه كمي EPS
- إعداد أنبوبين 1.5 مل. التسمية مع لجان أو لجان + BS.
- أضف 1 مل من لجان أو لجان + بكالوريوس للأنابيب الخاصة بكل منها.
- تلقيح الأنابيب مع 20 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها (01:50 إضعاف).
- في صفيحة 96-جيدا العقيمة، أسود، مغلوطاً، المعالجة بزراعة الأنسجة، إضافة 130 ميليلتر/جيدا لمراقبة أونينوكولاتيد وسائل الإعلام إلى ثلاثة آبار ليكون بمثابة عنصر التحكم فارغاً. قم بإعداد ثلاثة آبار مراقبة لكل نوع الوسيطة لفحصها. إضافة 130 ميليلتر/جيدا من الثقافة الملقحين للآبار، وكرر حتى يتم مطلي بكافة الشروط التجريبية في ثلاث نسخ.
- احتضانها ح 4-24 في 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
- نقل متوسطة الثقافة إلى لوحة واضحة 96-جيدا مع ماصة، مثالي الأقنية ماصة. كن حذراً لجمع جميع المتوسط الثقافة دون تعطيل السكان ملتصقة و/أو العائد على السهم الموجود على سطح البلاستيك. توضع جانبا.
- إصلاح اللوحة السوداء لمدة 15 دقيقة في استخدام من الفورمالدهايد/glutaraldehyde 200 ميليلتر/جيدا في برنامج تلفزيوني x 1 RT.
- بينما يتم تحديد السكان ملتصقة، تقييم الكسر طافية من الخطوة 4.1.6. استخدام قارئ لوحة، سجل OD600. آبار مراقبة ك 'فارغة'. تأكيد المتوسطة التحكم الواضح مع أي دليل على التعكر. إذا تم الكشف عن أي التعكر، تجاهل هذه التجربة.
- وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء فحص كامل في لوحة سوداء أسفل واضحة. في ظل هذه الظروف، يمكن تسجيل قيم600 OD ويمكن التخلص المتوسطة الثقافة في وقت لاحق قبل المتابعة إلى الخطوة 4.1.7. يمكن استخدام قيم600 OD تطبيع البيانات في الحالة، هناك اختلافات كبيرة في معدل النمو بين السلالات البكتيرية.
- إزالة الإصلاح والتصرف في النفايات الخطرة.
- تغسل برفق الآبار مرتين مع 200 ميليلتر/بئر PBS العقيمة. قم بإزالة برنامج تلفزيوني الغسيل باستخدام خط فراغ بإمالة اللوحة بلطف وبطء يسفط الغسيل عند الحافة السفلي من البئر.
- إضافة من 25 ميكروغرام/مل كونا فيتك 150 ميليلتر/جيدا، واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت
- تغسل بلطف مرتين مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
- إضافة 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. تسجيل الأسفار في 488 نانومتر.
- التصور مجهرية [كنفوكل] إنتاج EPS وحساب سمك بيوفيلم
- إعداد أنبوبين 1.5 مل. التسمية مع لجان أو لجان + BS.
- أضف 1 مل من لجان أو لجان + بكالوريوس للأنابيب الخاصة بكل منها.
- تلقيح الأنابيب مع 20 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها (في 01:50 إضعاف).
- إعداد لوحة 24-جيدا عقيمة مع 12 مم العقيمة جولة كوفيرسليبس الزجاج. إضافة 400 ميليلتر/جيدا لمراقبة أونينوكولاتيد وسائل الإعلام إلى ثلاثة آبار ليكون بمثابة عنصر التحكم فارغاً. قم بإعداد ثلاثة آبار مراقبة لكل نوع الوسيطة لفحصها.
- إضافة 400 ميليلتر للثقافة الملقحين للآبار في التكرارات، وكرر حتى يتم مطلي بجميع الظروف التجريبية.
- احتضانها ح 4-24 في 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
- وتؤكد بصريا النمو في حالة TSB، النمو ومتسرعا EPS (أبيض) في TSB + شرط درجة البكالوريوس، ولا النمو و/أو ترسبات بيضاء في آبار مراقبة عقيمة. قم بإزالة في سوبيرناتانتس.
- إصلاح لمدة 15 دقيقة في استخدام من حل فورمالدهايد/glutaraldehyde 200 ميليلتر/جيدا في برنامج تلفزيوني x 1 RT.
- إزالة الإصلاح والتصرف في النفايات الخطرة.
- تغسل برفق الآبار مرتين مع 200 ميليلتر/بئر PBS العقيمة. قم بإزالة برنامج تلفزيوني الغسيل باستخدام خط فراغ.
- إضافة من 25 ميكروغرام/مل كونا فيتك 150 ميليلتر/جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت
- تغسل بلطف مرتين مع 200 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني.
- جبل مع الحل مونتانت أنتيفادي مع DAPI.
ملاحظة: الحل حل جبل الجاهزة، على أساس والغليسيرول تتضمن DAPI للحفاظ على التسمية الفلورسنت مع تلطيخ الحمض النووي في الخلايا البكتيرية للتصور كونتيرستين في وقت واحد. اتبع كيت التوجيهات والتوصيات لأوقات الاحتضان قبل التصوير عينات. يمكن أن يؤديها DAPI تلطيخ الإجراء قبل تطبيق الحل مونتانت أنتيفادي التي لا تحتوي على DAPI. - تقييم عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل]. مجهر [كنفوكل]، تعيين الليزر لشمال البحر الأبيض المتوسط/519 495 نانومتر الإثارة/الانبعاثات للتصور فيتك. تعيين ليزر ثانية إلى 360 نيوتن متر/460 نانومتر الإثارة الانبعاثات/تصور DAPI. حدد موقع في بيوفيلم بالتركيز على قناة DAPI. استخدام القنوات DAPI وفيتك معا لتحديد سمك كامل وتعيين العلوي والسفلي التصوير الحدود. تسجيل صور سمك كامل زي مكدس بالتقاط الصور كل 0.25 ميكرون بعد وضع حدود لأعلى وأسفل z-المكدس. لمزيد من المعلومات حول الفحص المجهري [كنفوكل]، يرجى الرجوع إلى المنشورات بترويض et al. 17 , 18 , 19 , 20
- إعادة بناء الصور الثلاثية الأبعاد في إيماجيج (https://imagej.nih.gov/ij/) لتصور تشكيل بيوفيلم الكامل وحساب سمك بيوفيلم. وكان متوسط سمك الحصول على فليكسنيري س. الملح الصفراوية المستحث الأغشية الحيوية 14 ميكرومتر4.
5-التشتت بالانزيم
ملاحظة: في هذا التحليل، هو اكتشاف تفكيك بيوفيلم من خلال تشتت البكتيرية. هنا، يتم إنشاء الأغشية الحيوية الناضجة ولاحقا (عادة في اليوم التالي)، وسائط الإعلام يتم استبدالها ببرنامج تلفزيوني أو استكمال برنامج تلفزيوني. ثم يتم تقييم المكون طافية كوانتيتاتي العدد من البكتيريا التي قد ينفصل عن بيوفيلم.
- إعداد أنبوبين 1.5 مل. التسمية مع لجان أو لجان + BS.
- أضف 1 مل من لجان أو لجان + بكالوريوس للأنابيب الخاصة بكل منها.
- تلقيح الأنابيب مع 20 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها (في 01:50 إضعاف).
- في صفيحة 96-جيدا العقيمة، واضحة، مغلوطاً، المعالجة بزراعة الأنسجة، إضافة 130 ميليلتر/جيدا لمراقبة أونينوكولاتيد وسائل الإعلام إلى ثلاثة آبار ليكون بمثابة عنصر التحكم فارغاً. قم بإعداد ثلاثة آبار مراقبة لكل نوع من الوسائط التي يتم اختبارها.
- إضافة 130 ميليلتر/جيدا من الثقافة الملقحين لثلاثة آبار، وكرر حتى يتم مطلي بكافة الشروط التجريبية في ثلاث نسخ.
- احتضان لوحة ح 4-24 في 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
- قبل المتابعة، الحارة برنامج تلفزيوني، وبرنامج تلفزيوني الجلوكوز، برنامج تلفزيوني أملاح الصفراء، وبرنامج تلفزيوني + الأملاح الصفراوية + الجلوكوز إلى 37 درجة مئوية. تعد هذه الكواشف اليومية الطازجة.
- استخدام قارئ لوحة، سجل OD600. آبار مراقبة ك 'فارغة'. تأكيد المتوسطة الواضح مع أي دليل على التعكر. إذا تم الكشف عن أي التعكر، تجاهل هذه التجربة. يمكن استخدام قيم600 OD تطبيع البيانات إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في معدل النمو بين السلالات البكتيرية.
- إزالة المتوسطة ثقافة استخدام سطر فراغ. تأكد من جمع جميع المتوسط الثقافة دون تعطيل السكان ملتصقة الموجود على سطح البلاستيك.
- تغسل برفق الآبار مرتين مع 200 ميليلتر/بئر PBS العقيمة. قم بإزالة برنامج تلفزيوني الغسيل باستخدام خط فراغ.
- يستعاض عن الغسيل ميليلتر 130/بئر في ثلاثة آبار في كل ما يلي: برنامج تلفزيوني، برنامج تلفزيوني + الجلوكوز، برنامج تلفزيوني + أملاح الصفراء، وبرنامج تلفزيوني + أملاح الصفراوية + الجلوكوز. يجب أن تكون هذه الكواشف المعالجون مسبقاً إلى 37 درجة مئوية.
- احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- بعناية إزالة اللوحة من حاضنة 37 درجة مئوية. نقل سوبيرناتانتس إلى لوحة 96-بئر جديدة, عقيمة.
- استخدام كتلة لوحة أو تمييع 96، حسنا، إعداد 10 إضعاف (01:10) تخفيف المسلسل من المادة طافية في برنامج تلفزيوني العقيمة.
ملاحظة: يجب أن تتراوح سلسلة تمييع من غير مخفف إلى 10-6 اعتماداً على سلالة البكتيريا لفحصها. يمكن إجراء تجارب رائدة لتحديد نطاق تمييع الأمثل. - لوحة سبوت 5 ميليلتر لتمييع كل على أجار رطل استخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. عد المستعمرات في اليوم التالي ومراعاة لعامل إضعاف عند تحديد استرداد المستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي). لحساب التشتت في المائة بالنسبة إلى 1 x التحكم برنامج تلفزيوني (تعيين نسبة 100%)، تقسيم الانتعاش زيمبابوي من كل شرط المعاملة باسترداد زيمبابوي من نموذج عنصر تحكم برنامج تلفزيوني 1 x.
ملاحظة: روتين الإعلام لوحات للسلالة البكتيرية من الفائدة يمكن أيضا استخدامها. على سبيل المثال، يمكن مطلي دوسنتاريا على ألواح أحمر الكونغو. ضمان اللوحات جافة للتقنيات المناسبة لبقعة الطلاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 1، هو فعل تشكيل بيوفيلم في معظم نمو مسببات الأمراض المعوية ستة التالية تم اختبارها في الوسائط التي تحتوي على أملاح الصفراء. زيادة كبيرة في البكتيريا ملتصقة بعد أن لوحظ أن التعرض لأملاح الصفراء في ما يقرب من جميع سلالات اختبارها. والاستثناء انتيرواجريجاتيفي كولاي (الجماعة)؛ بيد الملاحظة المستحث متحولةالمنتدى الآسيوي 4Δ. وتشير النتائج إلى أن آليات الانضمام الإضافية هي الناجمة عن التعرض لأملاح الصفراء في الجماعة في غياب الالتزام التجميعية fimbriae أنا (المنتدى الآسيوي/أنا)21. استخلاص استنتاجات من مجموعة البيانات هذه، مؤامرة القيم540 التطوير التنظيمي لكل نوع الوسائط وسلالة اختبارها. مقارنة القيم من كل سلالة في مراقبة وسائل الإعلام (-بكالوريوس) بالنسبة لوسائل الإعلام التي تحتوي على أملاح الصفراء سوف تحدد إذا أملاح الصفراوية تحفز إلى حد كبير تشكيل بيوفيلم. يمكن أيضا إجراء مقارنات عبر السلالات البكتيرية و/أو طفرات لمزيد من توصيف التحليلات.
ويرد في الشكل 2تقييم كونا فيتك EPS. يمثل الشكل 2A التقييم الكمي شبه لإنتاج EPS التي يستخدم فيها كونا فيتك وصمة عار الأغشية الحيوية. كونا بربط السكريات في مصفوفة EPS والكشف عن المبلغ المحتفظ به بواسطة قارئ لوحة نيون. لعرض البيانات، ارسم وحدات fluorescence متوسط لكل شرط ومقارنة الظروف بيوفيلم المسببة لمراقبة سلبية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء مقارنات عبر السلالات البكتيرية أو طفرات. من المهم تحليل عنصر تحكم وسائل الإعلام فقط، والسلبية لتحديد مقدار الخلفية الفلورية كونا فيتك الذي يحدث اللوحة. ولم تختلف اختلافاً كبيرا من السيطرة على وسائل الإعلام، بينما التعرض الأملاح الصفراوية التالية زيادة كبيرة بين الأسفار قراءات الشرط TSB. وتؤكد البيانات أن إنتاج EPS يدل على تشكيل بيوفيلم ولا يحدث في حالة عدم وجود أملاح الصفراء ل . س. فليكسنيري. صور الأغشية الحيوية التي يسببها الملح الصفراوية في فليكسنيري س. يتم تمثيل في الشكل 2. كونا-فيتك يستخدم لوصمة عار السكريات في مصفوفة EPS، بينما يستخدم كونتيرستاين DAPI لتصور البكتيريا تلطيخ الحمض النووي. للبكتيريا التي لا تتعرض لأملاح الصفراء (المراقبة السلبية)، يتم الكشف عن فقط DAPI. جدير بالذكر أن كثافة البكتيريا أقل بكثير من حالة الأملاح الصفراوية. يتم الحصول على خلفية واضحة على قناة فيتك للإشارة إلى عدم وجود إنتاج EPS. كما هو متوقع، وتظهر البيانات أن إنتاج EPS يرتبط مع بيوفيلم تشكيل1،،من23 عقب التعرض لأملاح الصفراء. كونا-تلطيخ التحكم في العينات المعالجة بالملح الصفراوية يتم توفيرها لإثبات خصوصية fluorescence فيتك. لهذه الصور، واستخدمت 1 x PBS بدلاً من كونا-فيتك وأبقى على كونتيرستين DAPI. يمكن إجراء التصوير مجهر [كنفوكل] لتقييم سمك الأغشية الحيوية مع عينات إيجابية EPS4.
تم الكشف عن تشتت البكتيرية من الأغشية الحيوية في الشكل 3 من تحضين الأغشية الحيوية المحددة في برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني المكملة. فسيولوجيا، هو إعادة استيعاب الصفراء في الدورة الدموية في الأمعاء ويدخل 5% فقط من الصفراء القولون5. كما يغزو دوسنتاريا ظهارة colonic، نحن افترض أن إعادة استيعاب الصفراوية إشارة هامة تشتت بيوفيلم. في هذا الشكل، حدوث تشتت في الأغشية الحيوية تتعرض لبرنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني + الجلوكوز؛ ومع ذلك، تحول دون تشتت في برنامج تلفزيوني + الأملاح الصفراوية بغض النظر عن وجود الجلوكوز. وتظهر البيانات أن إزالة الأملاح الصفراوية أمر ضروري وكاف للحث على تشتت س. فليكسنيري من الأغشية الحيوية التي يسببها الملح الصفراوية4. لرسم البيانات، يمكن رسم زيمبابوي المستردة من البكتيريا أو النسبة المئوية النسبية لعنصر التحكم (كما هو موضح هنا).
رقم 1: أملاح الصفراوية تحفز تشكيل بيوفيلم في مسببات الأمراض المعوية. ح 18 الأغشية الحيوية المزروعة في زراعة الأنسجة تعامل 96-جيدا لوحات في أما لجان أو لجان + 0.4% أملاح الصفراء وسائل الإعلام والملون مع 0.5% الكريستال البنفسجي. تم تحديد قيم كمية من الإيثانول solubilization وصمة عار الكريستال البنفسجي التي كانت في التطوير التنظيمي540. التعرض لأملاح الصفراوية زيادة كبيرة في تشكيل بيوفيلم في فليكسنيري دوسنتاريا، س. الزحارية، enteropathogenic سرفار الإشريكيّة القولونية، انتيريكا السالمونيلا التيفية، وسرفار انتيريكا S. Typhimurium. دلالة إحصائية مصممة باختبار T للطالب لكل سلالة مقارنة علاج أملاح الصفراوية لمراقبة وسائل الإعلام. الخطأ المعياري للوسط (SEM) تمثل مجالات الخطأ. كل ف-قيم < 0.0001. البيانات المعروضة من واحدة (n = 3) التجربة التمثيلية، مع مجموعة كاملة من البيانات الواردة في منشور سابق4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تكوين بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراء تتميز بإنتاج مصفوفة EPS التي تم الكشف عنها بالمسمى فيتك كونكانافالين ألف ستيريل (A) الأسود، كانت تبذر لوحة 96-جيدا مع فليكسنيري س في 01:50 إضعاف إلى لجان أو لجان + أملاح الصفراء ونمت عن 18 h. الأغشية الحيوية كانت ثابتة، فيتك كونا غسلها بلطف والملون مع. كان يحدد مبلغ المحتفظ بها "كونكانافالينا فيتك" بقارئ لوحة نيون. إظهار القيم المرسومة الكمي EPS عقب نمو س. فليكسنيري تزرع في الأملاح الصفراوية TSB أو المحتوية على لجان. أهمية يحدده ANOVA أحادي الاتجاه و فقيم < 0.01. ويمثل وزارة شؤون المرأة مجالات الخطأ. البيانات المعروضة من واحدة (n = 3) التجربة التمثيلية، مع مجموعة كاملة من البيانات الواردة في منشور سابق4. (ب) الفحص المجهري الصور من بيوفيلم دوسنتاريا المستحثة بالملح الصفراوية. كانت تبذر كوفيرسليبس العقيمة مع فليكسنيري س في 01:50 تمييع في لجان أو لجان + أملاح الصفراء ونمت عن ح 18. كانت كوفيرسليبس لاحقاً ثابتة والملون مع كونا فيتك أو كونتيرستينيد مع DAPI. كونا-فيتك اكتشفت فقط في حالة أملاح الصفراوية بسبب الوجود مصفوفة EPS. واستخدمت ساترة الملون فقط مع DAPI في TSB + علاج الأملاح الصفراوية تثبت fluorescence خلفية الحد الأدنى للإعداد فيتك في المجهر [كنفوكل]. يتم توفير الصور لكل قناة الطول الموجي، وتغشية مركب لجميع الظروف معاملة. أشرطة مقياس تشير إلى 10 ميكرون. البيانات المعروضة من واحدة (n = 3) التجربة التمثيلية، مع مجموعة كاملة من البيانات الواردة في منشور سابق4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: تحليل التشتت البكتيرية من الأغشية الحيوية التي يسببها الملح الصفراوية. ح 18 التي يسببها الملح الصفراوية فليكسنيري دوسنتاريا الأغشية الحيوية تتعرض لبرنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني وتستكمل مع السكر أو الأملاح الصفراوية أو مزيج من السكر والأملاح الصفراوية. المادة طافية في وقت لاحق متسلسل المخفف ومطلي على ألواح أجار تعداد المستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) التي فرقت في بيوفيلم. كان رسم العدد من البكتيريا التي استعادت نسبة إلى عنصر التحكم في برنامج تلفزيوني. فرقت البكتيريا من بيوفيلم في برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني + الجلوكوز الظروف، لكن وجود أملاح الصفراء كانت كافية لتحول دون تشتت البكتيرية من بيوفيلم. البيانات المعروضة من واحدة (n = 3) التجربة التمثيلية، مع مجموعة كاملة من البيانات الواردة في منشور سابق4. للإشارة، استعيدت البكتيريا أكثر 100-fold بشكل روتيني من العلاج التحكم برنامج تلفزيوني (حوالي 7 × 107 زيمبابوي) مقارنة ببرنامج تلفزيوني + علاج الأملاح الصفراوية (حوالي 7 × 105 زيمبابوي). أهمية يحدده ANOVA أحادي الاتجاه و فقيم < 0.0001. ويمثل وزارة شؤون المرأة مجالات الخطأ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل تكوين بيوفيلم يشكل تحديا نظراً للطابع الدينامي للأغشية الحيوية والتباين بين السلالات، والمواد والمختبرات وفحوصات. هنا، يتم عرض عدة استراتيجيات لتحديد تكوين بيوفيلم في مسببات الأمراض المعوية عقب التعرض لأملاح الصفراوية مع البصيرة التجريبية المقدمة لتعزيز إمكانية تكرار نتائج. هناك اعتبارات إضافية لضمان إمكانية تكرار نتائج. أولاً وقبل كل شيء، نوصي بإجراء مستقل على الأقل ثلاث تجارب مع تريبليكاتيس التقنية لتأكيد الملاحظات ودلالة إحصائية بسبب التباين الذي يمكن أن يحدث كل. ثانيا، استخدام عناصر إيجابية وسلبية أمر حيوي لضمان إمكانية تكرار نتائج للمقايسة. فإنه ينصح بشدة استخدام سلالة نوع البرية كعنصر إيجابي عند تقييم طفرات لتشكيل بيوفيلم. وعلاوة على ذلك، كما يتم التعرف على الجينات التي تعتبر مهمة لتكوين بيوفيلم (انظر على سبيل المثال، الضمة22 والسالمونيلا7 وكولاي23،،من2425)، الاستخدام بيوفيلم طفرات كعناصر سلبية سيتم التحقق من صحة إمكانية تكرار نتائج للمقايسة. ثالثا، الأساليب المذكورة أعلاه تقوم على بحوث مركزة مع دوسنتاريا وس. فليكسنيري، خاصة. وقد يلزم إدخال تعديلات على البروتوكولات تبعاً لمتطلبات النمو لكل مسببات الأمراض المعوية تقييمها. رابعا، فحوصات قياس استجابة ضغط بكتيرية؛ وعليه، من الأهمية بمكان للعمل مع البكتيريا المحتفظ بها على نحو مناسب من الأرصدة المجمدة (-80 درجة مئوية) أو ألواح التخزين أبقى تحت التبريد (الحد الأقصى 4 درجة مئوية) لمدة لا تزيد عن أسبوعين. من المهم أن نلاحظ أن بعض أنواع البكتيريا بما فيها مسببات الأمراض المعوية في جنس واليرسينيا بسيتشروتروفس التي يمكن أن تنمو في درجات حرارة قريبة من 0 ° ج26. منذ التخزين في درجات حرارة مبردة يمكن تغيير فسيولوجيا البكتيريا وربما تسفر أوضح أو التحولات المظهرية27،،من2829، يوصي بشدة أن تعد مختبرين ثقافة الأسهم في-80 درجة مئوية للتطعيم الروتيني في البداية الثقافات. وعلاوة على ذلك، يتطلب العمل مع يعزل السريرية ريستريكس أكثر تواترا من الأرصدة-80 درجة مئوية كما هي سرعة لاحظ التحولات الجينية عند الانتقال سلالة بكتيرية المستمدة من سريرياً في المختبر وضع30،31 . خاصة تعمل مع دوسنتاريا يعزل وسرعة التكيف مع الضغوط والتحولات النمط الظاهري تحدث غالباً32،33. من المستحسن للبكتيريا ريسترياك من الأرصدة المجمد مرة واحدة في الشهر، وريسترياك الأسهم لوحة كل أسبوعين.
عامل مهم آخر لضمان إمكانية تكرار نتائج إعداد جديدة وسائط الإعلام أملاح الصفراوية للحد من تقلب المقايسة. الأملاح الصفراء وسائل الإعلام الأقدم من أسبوع واحد سلبي النمط الظاهري قوية ولاحظت مع إعداد وسائط جديدة. وعلاوة على ذلك، تبعاً لمسببات المرض والنوع من التعرض ليتم تحليلها (الأمعاء مقابل نقطتين)، مصادر مختلفة، وخليط من الأملاح الصفراوية قد يكون مطلوباً. على سبيل المثال، أملاح الصفراء، الفردية ومترافق وشطب مترافق المصادر، أو مقتطفات الصفراوية الخام التي تتضمن مكونات الصفراء إضافية مثل الكولسترول والبيليروبين قد تكون استخدمت5،6. وقد ركزت التحليلات دوسنتاريا البكتيرية التكيف مع البلد المضيف أثناء العبور للامعاء قبل الإصابة في القولون. ولذلك، استخدام خليط كوليت و deoxycholate يحاكي ظروف6،،من5الأمعاء الدقيقة34. أيضا فيما يتعلق بتحليل التشتت (القسم 5)، يتم تحديده أن الكواشف استكمال برنامج تلفزيوني يتم يوميا طازجة واستعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية قبل الاعتداء. عندما استخدمت الكواشف التي مضى عليها أكثر من بضعة أيام، تعرض للخطر إمكانية تكرار نتائج للفحص شدة. من المهم أيضا قبل الحارة هذه الكواشف إلى 37 درجة مئوية كما لم يحدث تشتت سهولة مع الكواشف درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، يمكن استخدام أساليب التشتت لتقييم التعداد عيار كاملة بيوفيلم، التي تشمل35،sonication36 أو الهضم الأنزيمي37. نهج المقايسة تشتت كان موجها نحو تقييم الأثر لإعادة استيعاب الملح الصفراوية كعبور دوسنتاريا من الدقاق المحطة الطرفية وفي القولون. التحليل يستند إلى فرضيات أن فقدان الأملاح الصفراوية سيمكن تشتت بيوفيلم عابرة وأن دوسنتاريا يجب تفريق بيوفيلم قبل تسبب العدوى في ظهارة colonic4،5 . تمثل الظروف مثل سونيكاتيون والهضم الأنزيمي الإفراج عن إجمالي الكتلة الميكروبية من بيوفيلم بينما الاستراتيجية المعروضة هنا يحاكي الدقاق القولون الانتقال إلى القبض النمط الظاهري فسيولوجية دوسنتاريا. تبعاً لظروف تجريبية المرجوة، قد يلزم أساليب إضافية للتشتت التحليل أو بيوفيلم التعداد.
فحوصات صممت لتكون معتدلة الفائق باستخدام لوحات 96-جيدا لتمكين اختبار السلالات البكتيرية و/أو شروط متعددة. لضمان إمكانية تكرار نتائج تشكيل بيوفيلم، استخدمت لوحات مغلوطاً، 96-حسنا أن كانت زراعة الأنسجة المعالجة. لأسباب فنية، لا يمكن بدقة قياس القراء لوحة امتصاص أو الأسفار في جولة أسفل لوحات. بالإضافة إلى ذلك، عرضت لوحات غير المصقول ملامح الالتزام متغير في دوسنتاريا، الذي وسيلة للتحقيق الجاري. فحوصات يمكن تحجيمها إلى أكبر الأشكال جيدا نسبيا، ولكن سيتطلب التعديلات للبروتوكول التي يمكن أن تقلل من كفاءة التجريبية. على سبيل المثال، سوف تحتاج وسائل الإعلام ثقافة ستنقل إلى الترعة لتسجيل قيم600 OD مع جهاز المطياف الضوئي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن كشط بيوفيلم الملون البنفسجي كريستال عقب حضانة 30-60 دقيقة في الإيثانول 95% ديستين خطوة ويمكن نقل المحتويات إلى ومبومو لقراءات جهاز المطياف الضوئي في التطوير التنظيمي540. يجب توخي الحذر عند التخلص من محتويات بيوفيلم في كل بئر لتجنب الرش، ولقد وجدنا أن تخريد السفن أسهل بعد حضانة 60 دقيقة.
تحليل دوسنتاريا، السالمونيلا، والمسببة للأمراض كولاي4 أظهرت مراقبة متكررة أن تشكيل بيوفيلم يحدث في مقياس وقت المعجل (خلال 24 ساعة) لمسببات الأمراض المعوية المعرضة للاملاح الصفراوية. خلافا لغيرها البكتيريا التي تتطلب ح 48 إلى 72 لمراقبة تشكيل بيوفيلم في ظل الظروف العادية، يبدأ بيوفيلم المعوية التي يسببها الملح الصفراوية أقرب وقت ح 4 مع المرحلة الأولى التقيد. في وقت لاحق، تكوين مصفوفة EPS واضح من ح 6، ونضج يحدث خلال 24 ساعة. على هذا النحو، قد يكون النمط الظاهري التقيد في ح 24 قوية جداً لفك دور العوامل المختلفة الانضمام في تشكيل بيوفيلم. إجراء التحليلات المبكرة، على سبيل المثال أقرب وقت ح 4، يسمح للتعرف على العوامل الهامة في تشكيل بيوفيلم المبكر الذي ستفتقده إلا في مرحلة لاحقة في وقت. وأخيراً، وكما ذكر أعلاه في خطوات البروتوكول، لم يتم الكشف عن تشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية دوسنتاريا في غياب الجلوكوز4. منذ المصفوفة EPS تتألف أساسا من السكريات وهو خطوة حاسمة في تشكيل بيوفيلم لمعظم البكتيريا38، وجود الجلوكوز أو السكر الأخرى في وسائل الإعلام على الأرجح من المهم مراقبة تشكيل بيوفيلم. اعتماداً على مسببات المرض البكتيري تحليلها، تركيبات مختلفة قاعدة الوسائط قد يكون مطلوباً.
تشكيل بيوفيلم هو عملية متعددة الطبقات التي غالباً ما يحدث في نظام مفتوح حيث تدفق المغذيات وحركة السوائل يحدث سهولة1،،من23. الأساليب محدودة بسبب ثقافة مغلقة ومتطلبات النمو ثابتة؛ ومع ذلك، تمكين الأساليب التقييم لتشكيل بيوفيلم في إنشاء مختبر. عند تحديد النمط الظاهري بيوفيلم، كذلك تجارب باستخدام خلايا السائل أو الثقافة المستمر استراتيجيات3940،،41 قد التبصير إضافية الميكانيكية الفسيولوجية أو السريرية أهمية تشكيل بيوفيلم. لتحديد هوية مصفوفة EPS، استخدام البروتوكولات يكتين السكاريد ملزم كونا. كونا تربط بقايا α-د-جلوكوسيل أو ستيريكالي--وثيقة الصلة42. قد يلزم lectins مختلفة تبعاً لنوع EPS المنتجة لأجناس مختلفة أو الأنواع. استراتيجية بديلة لتحديد إنتاج EPS هو الكتلي، التي ستوفر كل التحقق أن EPS يتم إنتاجه وتحديد تكوين43،مصفوفة EPS44. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي استخدام كونتيرستين DAPI السطوع الكبير نظراً للعدد من البكتيريا في بيوفيلم أو حدوث الحمض النووي خارج الخلية التي غالباً ما تكون موجودة في ال45،مصفوفة EPS46.
وهناك بدائل للأساليب المذكورة أعلاه ووصف في الأدب. على سبيل المثال، أبلغ مقايسة ربط المرحلة الصلبة للاستخدام في مسببات الأمراض الأخرى (على سبيل المثال، مراجع4،25،47،،من4849). وهناك تعديلات على البروتوكول بين المنشورات؛ وبالتالي فإن الاستراتيجيات المعروضة هنا صيغة سهلة لتكرار. من المهم ملاحظة أن تحديد البروتوكولات عصوية الأغشية الحيوية قبل تلطيخ (الخطوة 3، 10) في حين تفضل بعض الجماعات لإصلاح الأغشية الحيوية. وقد تمثل نهجين مختلفين اختلاف الاستراتيجيات الخاصة بالعوامل الممرضة. بالإضافة إلى ذلك، اكتشفت قبل إعداد وصمة الكريستال البنفسجي في المياه، النمط الظاهري تشكيل بيوفيلم متسقة. مجموعات أخرى استخدام الإيثانول لجعل الكريستال البنفسجي؛ الذي عن دوسنتاريا، أدت إلى زعزعة الاستقرار في الأغشية الحيوية وإمكانية تكرار نتائج لما يثير الشبهة. أننا نحقق حاليا العوامل التي قد تكون قابلة للذوبان في بيوفيلم دوسنتاريا الإيثانول. وثمة مثال آخر هو التحديد الكمي لإنتاج EPS تلطيخ كونا. ويرد أسلوب كشف فلورسنت لوحة 96-جيدا (الخطوة 4، 1) لتحديد القيم شبه كمي يعكس مقدار كونا مترافق FITC ملزمة بيوفيلم. على حد علمنا، الأسلوب هو المرة الأولى التي أبلغ عن هذه الاستراتيجية. EPS الكشف عن طريق الفحص المجهري قبلت في الأدب، ويسمح لاستراتيجية مختلفة، ولكن المجاملة، تصور EPS. كشف fluorescence شبه كمي جنبا إلى جنب مع الكشف المجهري [كنفوكل] من EPS التأكيد عززت البيانات، خاصة في ضوء القيود المفروضة على الإجراء كونتيرستين DAPI التحليل المجهري الموصوفة أعلاه. في كل شيء، قوة هامة في مجموعة الاختبارات الموصوفة هنا أن كل تقنية يكمل نهج آخر لأن تؤدي إلى إجراء تقييم ديناميكي لتشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في مسببات الأمراض المعوية.
كما أدرجت أملاح الصفراء وضراوة الأغشية الحيوية في نموذج المرضية البكتيرية المعوية، فمن المتوقع أنه سيتم استخدام هذه الأساليب للتحقق من صحة نماذج وتحديد أدوار جينات محددة، وتحديد الجينات لدالة غير معروفة وتوفير العامة توصيف سلالات السريرية. ويسمح هذا النهج المتعدد الأوجه المنشأة تحديد الجينات الهامة في جانب واحد من تشكيل بيوفيلم التي قد تكون فقدت مرة بيوفيلم ناضجة، الذي ولذلك يمكن تحديد الوظائف المتخصصة لكل مكون من مكونات البكتيريا بيوفيلم. وعلاوة على ذلك، كما يتضح من حقيقة أن التكيف الممرض داخل الأمعاء البشرية ظاهرة تحدث بسرعة، دور تشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية هو مثال على ظاهرة حديثا عن تقديره والمصانة والحرجة التي تحدث في دوسنتاريا العدوى، فضلا عن مسببات الأمراض المعوية إضافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا الكشف.
Acknowledgments
ونحن نشكر راشيل باء كنين واليخاندرو يانوس-شيا للمساعدة التقنية. ونحن نشكر أنطوني ت. مورلي، هيرلي ص بريان، اليسيو Fasano، سويركزيوسكي هاء بريت وشيريل بوبي للسلالات المستخدمة في هذه الدراسة. كان يدعمها هذا العمل "المعهد الوطني للحساسية" والأمراض المعدية منحة K22AI104755 (C.S.F.). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| Crystal Violet | Sigma | C6158-50 | |
| Concanavalin-A FITC | Sigma | C7642-10mg | |
| Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Bile Salts | Sigma | B8756-100G | |
| LB Agar | Sigma | L7533-1KG | |
| 14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile | Fisher | 14-959-11B | |
| Vectashield hard-set antifade with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635-500 | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (clear) | TPP | 92696 | |
| Flat-bottomed 96-well plates (black) | Greiner Bio-One | 655076 | |
| Flat-bottomed 24-well plates (clear) | TPP | 92424 | |
| Glass coverslips 12mm, round | Fisher | 08-774-383 | |
| 96-well plate reader | Spectramax | ||
| Flourescent plate reader | Biotek Synergy 2 | ||
| Confocal or Fluorescent Microscope | Nikon A1 confocal microscope | ||
| 37°C Shaking Incubator | New Brunswick Scientific Excella E25 | ||
| 37°C Plate Incubator | Thermolyne Series 5000 |
References
- Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
- Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
- Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
- Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
- Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
- Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
- Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
- Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. delaL., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
- Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
- Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
- Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
- Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
- Paddock, S. W.
- Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
- Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-4, 646, 648 (2008).
- Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
- Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L.
- Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
- Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
- Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
- Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
- Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
- Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
- Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
- Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis? Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
- Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
- Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
- Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
- Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
- Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
- de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
- Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
- Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
- Huang, R., Li, M., Gregory, R. L.
- Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
- McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
- Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
- Liener, I. The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , Elsevier Science. (1986).
- Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
- Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
- Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
- Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
- Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).
