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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos: técnicas para identificação e quantificação

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/57322
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

Summary

Este protocolo permite que o leitor a analisar a formação de biofilme induzida por sais biliares em patógenos entéricos, usando uma abordagem multifacetada para capturar a natureza dinâmica dos biofilmes bacterianos avaliando aderência, formação de matriz extracelular de substâncias poliméricas, e dispersão.

Abstract

Formação de biofilme é um processo dinâmico, vários estágios que ocorre em bactérias sob condições ambientais adversas ou momentos de estresse. Para patógenos entéricos, uma resposta de estresse significativo é induzida durante o trânsito gastrointestinal e após a exposição de bile, um componente normal da digestão humana. Para ultrapassar os efeitos bactericidos da bile, muitos patógenos entéricos formam um biofilme hipótese para permitir a sobrevivência, quando em trânsito através do intestino. Aqui nós apresentamos metodologias para definir a formação de biofilme por meio de ensaios de fase sólida aderência bem como deteção de matriz de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e visualização. Além disso, a avaliação da dispersão de biofilme é apresentada para imitar a análise de eventos, desencadeando a liberação de bactérias durante o processo de infecção. Coloração violeta cristal é usado para detectar bactérias aderentes em um ensaio de aderência de placa de 96 poços de alta produtividade. Avaliação de produção de EPS é determinada por dois ensaios, nomeadamente microscopia coloração da matriz EPS e análise semi-quantitativa com uma lectina de ligação de polissacarídeo conjugado fluorescente. Finalmente, dispersão de biofilme é medido através de contagens de colônia e chapeamento. Dados positivos de vários ensaios apoiar a caracterização de biofilmes e podem ser utilizados para identificar a formação de biofilme induzida por sais biliares em outras cepas bacterianas.

Introduction

Formação de biofilme é uma estratégia de sobrevivência bacteriana importante induzida durante condições ambientais adversas. Exposição aos compostos bactericidas como antibióticos ou alterações nos nutrientes ou disponibilidade de oxigênio induz um estado estressado em bactérias que podem ser aliviados através da formação de biofilme. Um biofilme é caracterizado pela fixação bacteriana de uma superfície ou outras bactérias e é acompanhado pela secreção de uma matriz EPS, composto principalmente de polissacarídeos1,2,3. Formação de biofilme é um processo dinâmico, no qual uma cascata de eventos culmina na formação de uma comunidade bacteriana aderente maduro1,2,3. As bactérias produzem adesinas para facilitar a fixação cedo enquanto deslocamento adesina perfis de expressão de gene para fortalecer o acessório durante a maturação do biofilme. Simultaneamente, a produção de EPS ocorre ao brasão da comunidade bacteriana em uma matriz para proteger as células contra o estressor inicial. Contido dentro do biofilme de bactérias são de crescimento lento; e como tal, a maioria dos antibióticos processa ineficaz. Além disso, o crescimento lento economiza energia até que as condições mudam para favorecer o crescimento bacteriano1,2,3. Depois de tem passado as duras condições, bactérias dispersarem o biofilme e retomar um lifestyle planctônicos1,2,3. Tradicionalmente, os biofilmes são observados em superfícies e representam um desafio clínico persistente devido a reservatórios de infecção presentes em cateteres e dispositivos de em-moradia a1,2,3.

Formação de biofilme foi recentemente descrita por vários patógenos entéricos; bactérias que infectam o intestino delgado ou cólon4. Para espécies de Shigella , , a infecção ocorre no cólon humano após um trânsito através da maioria do tracto gastrointestinal. Durante a passagem através do intestino, Shigella é exposto a bílis; um detergente degradante de lipídios secretado no intestino para facilitar a digestão de lipídios enquanto simultaneamente mata a maioria das bactérias5. Patógenos entéricos têm uma capacidade única de resistir os efeitos bactericidos da bile6. Nossa análise recente utilizado na vivo-como combinações de glicose e de sais biliares para demonstrar a formação de biofilme robusto em S. flexneri , bem como outras espécies de Shigella, patogênica Escherichia colie Salmonela4. Anteriormente, a Salmonella enterica sorovar Typhi mostrou-se para formar um biofilme induzida por bile devido à colonização exclusivo da vesícula biliar durante a infecção crônica7,8,9, 10. Além disso, pesquisas anteriores com Vibrio11e Campylobacter12 demonstraram a formação de biofilme em resposta a bile. Portanto, as análises estendido as observações de formação de biofilme induzida por bile para outros patógenos e ajudam a estabelecer a demonstração de uma resposta de patógeno entérico conservada a bile. Ao contrário de biofilmes crônicas em que transcrição do gene bacteriano é limitada e senescência celular pode ocorrer1,2,3, propomos que o biofilme induzida por bile entérico é mais transitório na natureza. Este transiente, virulenta biofilme é caracteriza por uma rápida desmontagem (como visto no ensaio de dispersão) e reforçada a expressao de genes de virulência observado no biofilme população4,6. 

Como formação de biofilme é um processo dinâmico, multifacetado e o uso de sais biliares, como um fator primário só foi recentemente descrito por patógenos entéricos mais, as ferramentas e técnicas utilizadas são únicas e criativas aplicações dos métodos tradicionais. Assim, aqui apresentados são três estratégias complementares para quantificar várias características importantes da formação de biofilme induzida por sais biliares, incluindo a aderência bacteriana, produção da matriz EPS e a dispersão de bactérias viáveis desde o biofilme. Estas técnicas têm sido utilizadas principalmente para pesquisa com Shigella; e, por conseguinte, a avaliação de outros patógenos entéricos pode exigir otimização. No entanto, dados positivos de todos os três ensaios apoiar a identificação de biofilmes e estabelecer protocolos podem ser reproduzidos para a formação de biofilme induzida por sais biliares.

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Protocol

1. preparação dos reagentes

  1. Médio de sais biliares: para preparar o caldo tryptic soja (TSB) contendo 0,4% (peso/volume) de sais biliares, resuspenda 200 mg de sais biliares em 50ml TSB autoclavado. Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Fazer meio fresco semanalmente.
    Notas: Os sais biliares rotineiramente utilizados é uma mistura 1:1 de colato de sódio e sódio Deoxycholate do isolado de vesículas de ovinos e bovinas. Como demonstrado anteriormente4, a presença de glicose foi necessária para a formação de biofilme induzida por sais biliares. TSB tem adicionado glicose em relação ao caldo de Luria-Bertani (LB); e, por conseguinte, foi suficiente para induzir a formação de biofilme em Shigella e outros patógenos entéricos analisados. Dependendo as bactérias a serem analisados, podem ser necessária a concentrações diferentes de glicose ou açúcar diferentes exigências.
  2. 0,5 violeta de cristal % p/v em água: dissolver 2,5 g de cristal violeta em 500 mL de água destilada. Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm.
  3. Concanavalina A (ConA) conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC): reconstituir o estoque em 1X PBS. Diluir o estoque de 10 mg de concentrado com 400 μL de 1X PBS a uma concentração final de 25 µ g/mL e proteger da luz.
  4. PBS + glicose: Dissolver glicose 0,2 g em 10 mL 1X PBS (glicose 2% w/v final). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso.
  5. PBS + sais biliares: Dissolver 40 mg em 10 mL 1X PBS (0,4% w/v de sais biliares finais). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso.
  6. PBS + glicose e sais biliares: dissolver 40 mg de sais biliares e glicose 0,2 g em 10 mL 1X PBS (0,4% w/v de sais biliares e 2% p/v glucose final). Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,22 µm. Certifique-se fresco no dia do uso.
  7. Prepare-se placas de ágar LB.
  8. Correção de formaldeído/glutaraldeído: 810 adicione formaldeído de µ l (solução-mãe de 37%, 3% de concentração final) e 125 µ l o glutaraldeído (solução estoque de 25%, 0,25% de concentração final) para 14 mL 1X PBS. Misture bem e armazenar a 4 ° C. A correção deve ser fria para o uso adequado.
    Atenção: A correção é tóxica e requer a eliminação de resíduos perigosos.
  9. Solução para montagem antidesgaste: usar antidesgaste para montagem solução contendo 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) mancha para inibir fotobranqueamento de amostras de microscopia de imunofluorescência, enquanto o ADN das bactérias de coloração fluorescente.

2. preparação de bactérias

  1. Cresce durante a noite culturas das cepas bacterianas para ser testado por inocular 3 mL de TSB com uma colônia única, bem isolada em um tubo estéril de cultura. Incube a 37 ° C com agitação a 225 rpm para incubação overnight (16-24 h).
    Nota: Cepas devem ser restreaked dos estoques de congelador cada 2 a 4 semanas e mantida em placas não mais de 2 semanas de idade.

3. fase sólida aderência ensaio

Nota: Este teste quantifica bactérias aderentes, usando um método de placa de 96 poços. As bactérias são crescidas estaticamente em placas de fundo plano. Lavar roupa é realizada para remover as bactérias não-aderentes e aderentes bactérias são coradas com violeta de cristal. A mancha de violeta cristal vincula peptidoglicano na parede celular bacteriana e pode ser solubilizada usando etanol. O número de bactérias aderentes é determinado com base na retenção de violeta cristal.

  1. Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + sais biliares (BS).
  2. Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.
  3. Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição).
  4. Em uma placa de 96 poços estéril, clara, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de mídia (TSB e TSB + BS) para ser testado.
  5. Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado em três poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado.
  6. Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente.
  7. Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como 'em branco'. Confirme que o meio de controle é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados se existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias.
  8. Remova o meio de cultura usando uma linha de vácuo, inclinar suavemente a placa e lentamente por aspiração do meio na borda inferior do poço. Não se esqueça de coletar todos os meio de cultura sem interromper a população bacteriana aderente localizada na superfície de plástico. Se a matriz EPS foi produzido durante o tempo de incubação, a matriz será ser visualizada como um precipitado branco. Não perturbe a matriz EPS.
  9. Delicadamente lave os poços uma vez com 200 µ l de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.
  10. Inverta a placa para secar. Permita um mínimo de 20 min para secar.
    Nota: Uma vez que o biofilme deve ser secado completamente antes de coloração, o protocolo pode ser pausado neste passo por algumas horas ou até mesmo durante a noite. O tempo de secagem adicionado não irá alterar o procedimento de coloração enquanto Secagem incompleta afetarão a quantificação dos resultados e reprodutibilidade.
  11. Adicione 150 µ l de violeta de cristal de 0,5% para cada experimental e controle bem.
  12. Incube durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
  13. Lave os poços uma vez com 400 µ l de água destilada. O volume adicionado ajuda a remover a mancha violeta de cristal residual dos lados dos poços. Remova a lavagem com a linha de vácuo.
  14. Lave os poços cinco vezes com 200 µ l de água destilada. Remova a lavagem com a linha de vácuo.
    Nota: A lavagem completa é importante para a quantificação. Quando os poços em branco são clara da água destilada e não contêm qualquer mancha residual violeta de cristal, prossiga para a próxima etapa.
  15. Inverta a placa para seco, protegido da luz. Certifique-se de secagem completa da placa conforme mencionado acima.
  16. Destain os poços com 200 µ l de etanol a 95%. Incube a placa no agitador por 30 min. Para evitar a evaporação, particularmente em umas mais altas temperaturas, execute esta etapa a 4 ° C.
  17. Usando um leitor de placas, registo o OD540.
    Nota: O comprimento de onda de absorbância máxima de violeta cristal está perto de 590 nm. A literatura relata uma faixa de OD540 - OD5954,13,14,15,16 de absorvância de cristal violeta; assim, escolha um comprimento de onda disponível com base no leitor.

4. deteção de Matrix EPS

Nota: Estes ensaios complementares quantificar e visualizar o EPS. Em ambos, EPS é detectada usando uma lectina vincular polissacarídeos. A proteína fluorescente conjugado permite a quantificação (passo 4.1) ou visualização (etapa 4.2).

  1. Detecção semi-quantitativa de EPS
    1. Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS.
    2. Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.
    3. Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (um 01:50 diluição).
    4. Em uma placa de 96 poços estéril, preta, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio a ser testado. Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado nos poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado.
    5. Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente.
    6. Transfira o meio de cultura para uma placa de 96 poços claros com uma pipeta, idealmente uma pipeta multicanal. Seja cauteloso para coletar todo o meio de cultura sem interromper a população aderente e/ou o EPS localizado na superfície de plástico. Posta de lado.
    7. Fixe a placa preta para 15 min RT usando 200 µ l/poço do formaldeído/glutaraldeído em 1X PBS.
    8. Enquanto a população aderente é fixação, avalie a fração sobrenadante da etapa 4.1.6. Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como 'em branco'. Confirme que o meio de controle é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento.
      1. Alternativamente, o ensaio inteiro pode ser executado em um prato fundo preto transparente. Nessas circunstâncias, os valores de600 OD podem ser gravados e o meio de cultura pode ser posteriormente descartado antes de prosseguir para a etapa 4.1.7. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados no caso, existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias.
    9. Remover a correção e eliminação de resíduos perigosos.
    10. Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo por inclinar suavemente a placa e aspirando lentamente a lavagem na borda inferior do poço.
    11. Adicionar 150 µ l/poço de 25 µ g/mL ConA-FITC e incube por 15 min no RT
    12. Delicadamente, lave duas vezes com 200 µ l de PBS.
    13. Adicione 150 µ l de PBS a cada poço. Gravar a fluorescência em 488 nm.
  2. Visualização de microscopia confocal da produção de EPS e cálculo da espessura do biofilme
    1. Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS.
    2. Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.
    3. Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição).
    4. Configure uma placa de 24 estéril com 12 mm estéril ronda as lamelas de vidro. Adicione 400 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de meio a ser testado.
    5. Adicionar 400 µ l de cultura inoculada poços em duplicado e repita até que todas as condições experimentais são banhadas.
    6. Incube durante 4-24 h a 37 ° C estaticamente.
    7. Confirme visualmente crescimento na condição TSB, crescimento e precipitado EPS (branco) no TSB + condição de BS e não há crescimento e/ou precipitado branco em poços de controle estéril. Remova os sobrenadantes.
    8. Correção para 15 min em RT usando 200 µ l/poço de solução de formaldeído/glutaraldeído em 1X PBS.
    9. Remova a correção e descarte de resíduos perigosos.
    10. Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.
    11. Adicionar 150 µ l/poço de 25 µ g/mL ConA-FITC e incube por 15 min no RT
    12. Delicadamente, lave duas vezes com 200 µ l/poço de PBS.
    13. Montar com solução de antidesgaste para montagem com DAPI.
      Nota: A solução é uma solução de montagem de ready-made, com base em glicerol contendo DAPI para preservar a etiqueta fluorescente enquanto simultaneamente a coloração do DNA em células bacterianas para visualização como um corante de contraste. Siga as direções e recomendações do kit para tempos de incubação antes da imagem latente de amostras. O DAPI mancham o procedimento pode ser realizado antes da aplicação de solução de antidesgaste para montagem que não contenha DAPI.
    14. Avalie pela microscopia confocal. Em um microscópio confocal, defina o laser para 495 nm/519 nm excitação/emissão para visualização FITC. Como um segundo laser 360 nm/460 nm excitação/emissão de Visualizar DAPI. Localize o biofilme, centrando-se no canal DAPI. Usar canais da DAPI e FITC para determinar a espessura total e definir a parte superior e inferior da imagem latente as fronteiras. Grave imagens de toda a sua espessura Z-pilha capturando imagens cada 0,25 µm após definir perímetros para a parte superior e inferior da pilha-z. Para obter mais informações sobre microscopia confocal, consulte publicações pelo Paddock et al 17 , 18 , 19 , 20
    15. Reconstrua as imagens 3D no ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) para visualizar a formação de biofilme completo e calcular a espessura do biofilme. A espessura média obtida para S. flexneri sais biliares induzidos biofilmes foi 14 µm4.

5. ensaio de dispersão

Nota: Neste ensaio, a desmontagem do biofilme através de dispersão bacteriana é detectada. Aqui, biofilmes maduros são estabelecidos e posteriormente (normalmente no dia seguinte), os meios de comunicação são substituídos com PBS ou completadas PBS. O componente sobrenadante é então avaliado para quantificar o número de bactérias que podem ter dissociada do biofilme.

  1. Configure dois tubos de 1,5 mL. Etiqueta com TSB ou TSB + BS.
  2. Adicione 1 mL de TSB ou TSB + BS para os respectivos tubos.
  3. Inocular tubos com 20 µ l de cultura durante a noite (em um 01:50 diluição).
  4. Em uma placa de 96 poços estéril, clara, fundo chato, cultura de tecidos tratados, adicione 130 µ l/poço de mídia não inoculado controle três poços para servir como o controle em branco. Configure três poços de controle para cada tipo de mídia a ser testado.
  5. Adicionar 130 µ l/poço de cultura inoculado três poços e repita até que todas as condições experimentais são banhadas em triplicado.
  6. Incube a placa para 4-24 h a 37 ° C estaticamente.
  7. Antes de continuar, aquecer a PBS, PBS glicose, PBS + sais biliares e PBS + sais biliares + glicose a 37 ° C. Prepare estas diariamente frescos de reagentes.
  8. Usando um leitor de placas, registo o OD600. Definir os poços de controle como 'em branco'. Confirme que o meio é claro sem evidência de turbidez. Se for detectada qualquer turbidez, descarte o experimento. Os valores de600 OD podem ser usados para normalizar os dados se existem diferenças significativas na taxa de crescimento entre estirpes de bactérias.
  9. Remova o meio de cultura usando uma linha de vácuo. Não se esqueça de coletar todos os meio de cultura sem interromper a população aderente localizada na superfície de plástico.
  10. Delicadamente lave os poços duas vezes com 200 µ l/poço de PBS estéril. Remova a lavagem PBS usando a linha de vácuo.
  11. Substituir a lavagem com 130 µ l/poço das seguintes três poços cada: PBS, PBS glicose, PBS + sais biliares e PBS + sais biliares + glicose. Estes reagentes devem ser pré-aquecido a 37 ° C.
  12. Incubar a placa por 30 min a 37 ° C.
  13. Retire cuidadosamente a placa de incubadora a 37 ° C. Transferi os sobrenadantes para uma placa de 96 poços fresca, estéril.
  14. Usando um bloco de 96 poços placa ou diluição, preparar o 10-fold (01:10) diluições em série do líquido sobrenadante em PBS estéril.
    Nota: A série de diluição deve variar de não diluída a 10-6 , dependendo da estirpe bacteriana a ser testado. Experiências piloto podem ser realizadas para determinar o intervalo ideal de diluição.
  15. Detectar a placa de 5 µ l de cada diluição em ágar LB usando uma pipeta multicanal. Incube a 37 ° C durante a noite. Contagem das colónias no próximo dia e conta para o factor de diluição, ao determinar a recuperação unidades formadoras (CFU). Para calcular a dispersão por cento em relação a 1 x controle de PBS (fixado em 100%), divida a recuperação CFU de cada condição de tratamento da recuperação CFU das amostras de controlo de PBS 1x.
    Nota: As placas de mídia de rotina para a estirpe bacteriana de interesse também podem ser usadas. Por exemplo, Shigella pode ser revestido em placas de vermelho Congo. Certifique-se que as placas estão secas por técnicas adequadas de ponto-chapeamento.

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Representative Results

Na Figura 1, a formação de biofilme é induzida na maior parte do crescimento de seguir testadas seis patógenos entéricos em meios contendo sais biliares. Um aumento significativo de bactérias aderentes após exposição de sais biliares é observada em quase todas as cepas testadas. A exceção é enteroaggregative e. coli (CEEA); no entanto, observe a observação induzida do Δaaf mutante4. Os resultados indicam que os mecanismos adicionais de aderência são induzidos pela exposição de sais biliares no CEEA na ausência de pré-enriquecimento aggregative aderência eu (AAF / eu)21. Para tirar conclusões a partir deste conjunto de dados, plotar os valores de540 OD para cada tipo de tensão e mídia testado. Comparando os valores de cada estirpe no controle de mídia (-BS) em relação à mídia contendo sais biliares determinará se sais biliares significativamente induzir a formação de biofilme. As comparações entre estirpes bacterianas e/ou mutantes também podem ser realizadas para outras análises de caracterização.

A avaliação de ConA-FITC do EPS é apresentada na Figura 2. Figura 2A representa a avaliação semi-quantitativa da produção de EPS em que ConA-FITC é usado para manchar os biofilmes. A ConA vincula os polissacarídeos na matriz EPS e o montante retido é detectado por um leitor de placa fluorescente. Para apresentar os dados, traçar as unidades de média de fluorescência para cada condição e comparar as condições de biofilme de indução ao controle negativo. Além disso, as comparações entre estirpes bacterianas ou mutantes podem ser executadas. É fundamental para analisar um controle negativo, somente meios para determinar a quantidade de fluorescência de ConA-FITC que ocorre para a placa de fundo. A condição TSB não foi significativamente diferente do controle de mídia, enquanto a fluorescência leituras significativamente aumento seguintes sais biliares da exposição. Os dados confirmam que a produção de EPS é indicativa de formação de biofilme e não ocorre na ausência de sais biliares para S. flexneri. As imagens de biofilmes induzida por sais biliares, em S. flexneri é representado na Figura 2B. ConA-FITC é usado para manchar polissacarídeos na matriz EPS, enquanto um corante de contraste DAPI é usado para visualizar as bactérias pela coloração do DNA. Para bactérias não expostas a sais biliares (controle negativo), é detectada somente DAPI. Notavelmente, a densidade de bactérias é muito menor do que na condição de sais biliares. Um plano de fundo claro no canal FITC é obtido para indicar a falta de produção de EPS. Como esperado, os dados demonstram que a produção de EPS está correlacionada com biofilme formação1,2,3 após a exposição de sais biliares. A - ConA que mancha controle nas amostras tratadas sais biliares é fornecido para demonstrar a especificidade da fluorescência FITC. Para essas imagens, 1X PBS foi usado no lugar de ConA-FITC e manteve-se o corante de contraste DAPI. Imagem latente pode ser realizada com um microscópio confocal para avaliar a espessura dos biofilmes com o EPS-positivo amostras4.

Dispersão bacteriana de biofilmes na Figura 3 é detectado pela incubação biofilmes estabelecidos em PBS ou complementado PBS. Fisiologicamente, bile é reabsorvida em circulação no intestino delgado e apenas 5% da bile entra o cólon5. Como Shigella invade o epitélio do cólon, podemos teorizar que reabsorção da bile é um sinal importante para a dispersão de biofilme. Nesta figura, a dispersão ocorre em biofilmes expostos a PBS ou PBS + glicose; no entanto, a dispersão é inibida em PBS + sais biliares, independentemente da presença de glicose. Os dados demonstram que a remoção de sais biliares é necessária e suficiente para induzir a dispersão de S. flexneri de biofilmes induzida por sais biliares4. Para plotar os dados, ou o CFU recuperado das bactérias ou a porcentagem relativa ao controle (como mostrado aqui) pode ser plotada.

Figure 1
Figura 1: sais biliares induzir a formação de biofilme em patógenos entéricos. 18 h biofilmes foram cultivadas em placas de 96 poços-cultura de tecidos Tratado ou TSB ou TSB + 0,4% sais biliares mídia e corados com violeta de cristal de 0,5%. Valores quantitativos de solubilização de etanol da mancha violeta de cristal foram determinados por espectrofotometria a OD540. Exposição de sais biliares aumentou significativamente a formação de biofilme em Shigella flexneri, S. dysenteriae, enteropatogênica Escherichia coli, Salmonella enterica sorovar Typhi e S. enterica sorovar Typhimurium. Significância estatística foi determinada pelo teste-T de student para cada estirpe, comparando o tratamento de sais biliares para o controle de mídia. O erro padrão da média (SEM) é representado pelas barras de erro. Todos os p-valores são < 0,0001. Dados mostrados são de um (n = 3) experiência representativa, com um conjunto completo de dados fornecidos em um anterior publicação4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: formação de biofilme induzida por sais biliares é caracterizada pela produção de uma matriz EPS que é detectada com FITC-rotulado Concanavalina A. (A) estéril preta, placa de 96 poços foram semeadas com S. flexneri em um 01:50 diluição em TSB ou TSB + sais biliares e cresceu para 18 h. biofilmes foram fixados, cuidadosamente lavado e manchado com ConA-FITC. A quantidade de retenção Concanavalin-A FITC foi determinada por um leitor de placa fluorescente. Os valores plotados demonstram quantificação de EPS, seguindo o crescimento de s. flexneri cultivadas em TSB ou TSB-contendo sais biliares. Significância foi determinada por One-Way ANOVA e p -valores são < 0,01. O SEM é representado pelas barras de erro. Dados mostrados são de um (n = 3) experiência representativa, com um conjunto completo de dados fornecidos em um anterior publicação4. (B) microscopia imagens de um biofilme de Shigella induzida por sais biliares. Lamínulas estéreis foram semeadas com S. flexneri em um 01:50 diluição em TSB ou TSB + sais biliares e cresceu para 18 h. As lamelas foram posteriormente corrigidas e manchadas com ConA-FITC e/ou counterstained com DAPI. ConA-FITC foi detectado somente na condição de sais biliares, devido à presença da matriz EPS. Uma lamela manchada apenas com DAPI no TSB + sais biliares tratamento foi usada para demonstrar a fluorescência de fundo mínimo a fixação FITC em microscópio confocal. Imagens para cada canal de comprimento de onda e uma sobreposição de composto são fornecidas para todas as condições de tratamento. Barras de escala indicam que 10 µm. dados mostrados são de um (n = 3) experiência representativa, com um conjunto completo de dados fornecidos em um anterior publicação4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: análise de dispersão bacteriana de biofilmes induzida por sais biliares. 18 h induzida por sais biliares Shigella flexneri biofilmes foram expostos à PBS ou PBS suplementado com glicose, sais biliares ou uma combinação de glicose e sais biliares. O sobrenadante foi posteriormente serialmente diluído e chapeado em placas de ágar para enumerar as unidades (CFUs) que dispersaram o biofilme de formadoras. O número de bactérias recuperado foi plotado em relação ao controle de PBS. Bactérias dispersaram do biofilme no PBS ou PBS + glicose condições, mas a presença de sais biliares foi suficiente para inibir a dispersão bacteriana do biofilme. Dados mostrados são de um (n = 3) experiência representativa, com um conjunto completo de dados fornecidos em um anterior publicação4. Para referência, 100 vezes mais bactérias foram rotineiramente recuperou o tratamento de controle de PBS (aproximadamente 7 x 107 UFC) em comparação com o PBS + tratamento de sais biliares (aproximadamente 7 x 105 UFC). Significância foi determinada por One-Way ANOVA e p -valores são < 0,0001. O SEM é representado pelas barras de erro.

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Discussion

Análise da formação de biofilme é um desafio devido a natureza dinâmica dos biofilmes e a variabilidade entre as cepas, materiais, laboratórios e ensaios. Aqui, apresentam-se várias estratégias para determinar a formação de biofilme em patógenos entéricos, após exposição de sais biliares, com uma visão experimental fornecida para promover a reprodutibilidade. Existem considerações adicionais para garantir a reprodutibilidade. Primeiro e acima de tudo, recomendamos executar independente de pelo menos três experiências de cada um com técnica triplica para confirmar as observações e significância estatística devido à variação que pode ocorrer. Em segundo lugar, o uso de controles positivos e negativos é vital para garantir a reprodutibilidade do ensaio. É altamente recomendável usar a estirpe selvagem tipo como um controle positivo ao avaliar os mutantes para a formação de biofilme. Além disso, como são identificados os genes que são importantes para a formação de biofilmes (ver por exemplo, Escherichia coli23,24,25, Salmonella7e Vibrio22), o uso de mutantes de biofilme como controles negativos irão validar a reprodutibilidade do ensaio. Em terceiro lugar, os métodos acima são baseados em pesquisa focalizada com Shigella e S. flexneri, em particular. Ajustes para os protocolos podem ser necessários dependendo das exigências de crescimento de cada patógeno entérico avaliada. Em quarto lugar, os ensaios de medem uma resposta ao estresse bacteriano; e, portanto, é fundamental trabalhar com bactérias adequadamente mantidas de estoques congelados (-80 ° C) ou placas de armazenamento mantidas sob refrigeração (máxima de 4 ° C) por não mais de duas semanas. É importante notar que algumas bactérias incluindo os patógenos entéricos do gênero Yersinia são psychrotrophs que podem crescer em temperaturas perto de 0 ° C26. Uma vez que o armazenamento em temperaturas refrigeradas pode alterar a fisiologia bacteriana e possivelmente resultar em genotípico ou fenotípica turnos27,28,29, é altamente recomendável para preparar alíquotas do cultura de estoque a-80 ° C para rotina inoculação em culturas de acionador de partida. Além disso, trabalhar com isolados clínicos requer mais frequentes restreaks de estoques-80 ° C que mudanças genéticas sejam observadas rapidamente quando uma estirpe bacteriana clinicamente-derivado, transita para o laboratório, definindo30,31 . Especialmente trabalhando com Shigella Isola, estirpes rapidamente se adaptar e fenótipo mudanças ocorrem frequentemente32,33. Recomenda-se bactérias restreak das existências do congelador de uma vez por mês e restreak o estoque da placa a cada duas semanas.

Outro fator importante para garantir a reprodutibilidade é fresca preparação dos sais biliares meios para limitar a variabilidade do ensaio. Mídia de sais biliares mais de 1 semana impactado negativamente o robusto fenótipo observado com preparação de mídia fresco. Além disso, dependendo do patógeno e do tipo de exposição a ser analisado (intestino contra dois pontos), diferentes fontes e misturas de sais biliares podem ser necessárias. Por exemplo, individuais de sais biliares, conjugados e conjugados de fontes, ou extratos de bile bruto que incluem componentes adicionais de bile, como colesterol e bilirrubina podem ser utilizaram5,6. Análises de Shigella centraram-se na adaptação bacteriana para o host durante o trânsito do intestino delgado antes da infecção no cólon. Portanto, o uso de uma mistura de colato e Deoxycholate do imita as condições do intestino5,6,34. Também no que diz respeito ao ensaio de dispersão (secção 5), está especificado que os reagentes PBS-suplementado devem ser feitas diariamente fresco e pré aquecido a 37 ° C antes do ensaio. Quando foram utilizados reagentes mais de alguns dias, a reprodutibilidade do ensaio foi severamente comprometida. Também foi crítico para pré-aquecer estes reagentes a 37 ° C, como a dispersão não ocorreu prontamente com os reagentes de temperatura. Finalmente, métodos de dispersão para avaliação de enumeração completa sendo o título do biofilme podem ser usados, que incluem sonication35,36 ou digestão enzimática37. A abordagem para o ensaio de dispersão foi direcionada para avaliar o efeito de reabsorção de sais biliares como Shigella trânsitos de íleo terminal e no cólon. A análise baseou-se as hipóteses de que a perda de sais biliares permitiria a dispersão do biofilme transitório e que a Shigella devem dispersar o biofilme antes causando infecção no epitélio do cólon4,5 . Condições tais como sonication e digestão enzimática representam liberação total da massa microbiana do biofilme, enquanto a estratégia aqui apresentada emula o íleo a transição cólon para capturar um fenótipo fisiológico para Shigella. Dependendo das condições experimentais desejadas, métodos adicionais para a enumeração de análise ou biofilme de dispersão podem ser necessários.

Os ensaios são projetados para serem moderadamente alta produtividade com o uso de placas de 96 poços para permitir testes de várias estirpes bacterianas e/ou condições. Para garantir ainda mais a reprodutibilidade da formação de biofilmes, utilizaram-se placas de fundo chato, 96 poços que foram tratada de cultura de tecidos. Por razões técnicas, os leitores de placa não podem medir com precisão absorvância ou fluorescência em placas de fundo redondo. Além disso, não revestidos de placas ofereceram perfis de aderência variável em Shigella, que é uma avenida de investigação atual. Os ensaios podem ser escalados para formatos bem maiores, proporcionalmente, mas exigirão as alterações ao protocolo que podem reduzir a eficiência experimental. Por exemplo, os meios de cultura precisa ser transferido para cubetas para gravar os valores de600 OD com um espectrofotômetro. Além disso, o biofilme manchadas de violeta cristal pode ser raspado após uma incubação de 30 a 60 min em etanol a 95% destain passo e o conteúdo pode ser transferido para uma cubeta para leituras de espectrofotômetro no OD540. Deve ter cuidado ao desmantelamento o conteúdo do biofilme em cada poço para evitar salpicos, e achamos que a demolição é mais fácil após uma incubação de 60 min.

Análise com Shigella, Salmonella e patogênicas Escherichia coli4 demonstrou uma observação repetida, que ocorre a formação de biofilme em uma escala de tempo acelerado (dentro de 24 h) para patógenos entéricos expostos a sais biliares. Ao contrário de outras bactérias que necessitam de 48 a 72 h para observar a formação de biofilme em condições normais, induzida por sais biliares entérico biofilme começa logo em 4h com a fase de aderência inicial. Posteriormente, formação de matriz EPS é evidente por 6h, e maturação ocorre por 24 h. Como tal, o fenótipo de aderência em 24 h pode ser muito robusto para decifrar o papel dos fatores de aderência diferente na formação de biofilmes. Realizar análises iniciais, por exemplo logo em 4h, permite para a identificação de fatores importante na formação de biofilme inicial que caso contrário iria ser desperdiçada em um momento posterior do tempo. Finalmente e como mencionado acima, as etapas do protocolo, a formação de biofilme induzida por sais biliares para Shigella não foi detectada na ausência de glicose4. Desde que a matriz de EPS é composta principalmente de polissacarídeos e é um passo fundamental na formação de biofilmes para a maioria das bactérias38, a presença de glicose ou outros açúcares na mídia é provavelmente mais importante para observar a formação de biofilme. Dependendo o patógeno bacteriano analisado, formulações diferentes mídias base podem ser necessárias.

Formação de biofilme é um processo de várias camado que muitas vezes ocorre em um sistema aberto onde o fluxo de nutrientes e movimento fluido ocorrerem prontamente1,2,3. Os métodos são limitados pela cultura fechada e às necessidades de crescimento estático; no entanto, os métodos permitem a avaliação da formação de biofilme no cenário de laboratório. Após identificação do fenótipo biofilme, mais experimentos utilizando células de líquido ou de estratégias de cultura contínua39de40,,41 pode fornecer adicionais mecanicista insights fisiológico ou clínico importância da formação de biofilme. Para identificação da matriz EPS, os protocolos usam a lectina ligadora de polissacarídeo ConA. ConA vincula resíduos de α-D-glucosyl ou estericamente-aparentados42. Lectinas diferentes podem ser necessárias, dependendo do tipo de EPS produzidos por diferentes géneros ou espécies. Uma estratégia alternativa para identificar a produção do EPS é espectrometria de massa, que irá fornecer ambos verificação que o EPS é produzido e determinar a composição da matriz EPS43,44. Além disso, o uso de corante de contraste o DAPI pode resultar em brilho significativo, dado o número de bactérias do biofilme ou a ocorrência de DNA extracelular que está frequentemente presente na matriz EPS45,46.

Existem alternativas para os métodos acima descritos na literatura. Por exemplo, o ensaio de fase sólida ligação tem sido relatado para uso em outros patógenos (por exemplo, referências4,25,47,,48,49). Há modificações no protocolo entre publicações; e, por conseguinte, as estratégias apresentadas aqui são um formato de fácil-para-replicar. É importante observar que os protocolos especificar biofilmes secando antes da coloração (etapa 3.10), enquanto alguns grupos preferem corrigir biofilmes. As duas abordagens diferentes podem representar diferentes estratégias específicas do patógeno. Além disso, elaborando a mancha violeta de cristal na água, foi detectado um fenótipo de formação de biofilme consistente. Outros grupos usam etanol para solubilizar a violeta de cristal; que para Shigella, levou à desestabilização de biofilmes e comprometida a reprodutibilidade. Estamos atualmente investigando os fatores que podem ser etanol solúvel no biofilme de Shigella . Outro exemplo é a quantificação da produção EPS pela coloração de ConA. Um método de deteção fluorescente placa de 96 poços (passo 4.1) é apresentado para determinar valores semi-quantitativa, refletindo a quantidade de ConA de conjugado FITC ligação para o biofilme. A nosso conhecimento, o método é a primeira vez que esta estratégia tem sido relatada. Detecção de EPS através do exame microscópico é aceito na literatura e permite uma estratégia diferente, mas complementar Visualizar EPS. A deteção de fluorescência semi-quantitativa, combinada com a detecção microscópica confocal de EPS certamente fortaleceu os dados, especialmente tendo em conta as limitações do procedimento DAPI corante de contraste na análise de microscopia descrita acima. Ao todo, uma força significativa no conjunto de ensaios aqui descritos é que cada técnica complementa a outra abordagem para dar origem a uma avaliação dinâmica de formação de biofilmes induzida por sais biliares em patógenos entéricos.

Como sais biliares e virulentos biofilmes são incorporados o paradigma da patogênese bacteriana entérica, prevê-se que esses métodos serão usados para validar modelos, identificar funções de genes específicos, identificar genes de função desconhecida e fornecer Caracterização geral das estirpes clínicas. Esta abordagem multifacetada permite a identificação de genes importantes em um aspecto da formação de biofilme que pode ser perdido, uma vez, o biofilme maduro é estabelecida, o que, portanto, permite a identificação de funções especializadas de cada componente bacteriano do biofilme. Além disso, como é evidente pelo fato de que a adaptação do patógeno dentro do intestino humano é um fenômeno rapidamente, o papel da formação de biofilmes induzida por sais biliares é um exemplo de um fenômeno recentemente apreciado, conservado e crítico que ocorre em Shigella infecção, bem como patógenos entéricos adicionais.

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Disclosures

Os autores têm sem divulgações.

Acknowledgments

Agradecemos a Rachael B. Chanin e Alejandro Llanos-cocho para assistência técnica. Agradecemos a Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski e Bobby Cherayil para as estirpes utilizadas neste estudo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de alergia e K22AI104755 de Grant de doenças infecciosas (serologia). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One 655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000

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