Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/57322
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Division of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School

Summary

Bu iletişim kuralı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu enterik patojenler bağlılık, hücre dışı polimer madde matris oluşumu değerlendirmek tarafından bakteriyel biyofilmler dinamik doğası yakalamak için çok yönlü bir yaklaşım kullanarak analiz okuyucu sağlar, ve dağılım.

Abstract

Biyofilm oluşumu bakteri sert çevre koşulları veya stresli zamanlarda altında oluşan dinamik, çok aşamalı bir süreçtir. Enterik patojenler için önemli stres tepkisi gastrointestinal transit sırasında ve safra maruz, insan sindirim normal bir bileşeni üzerine indüklenen. Safra bakteri yok edici etkilerini aşmak için birçok enterik patojenler ince bağırsak transit zaman hayatta kalma izni olan bir biyofilm oluştururlar. Burada metodolojileri biyofilm oluşumu katı fazlı bağlılık deneyleri gibi hücre dışı polimer madde (EPS) matris algılama ve görselleştirme ile tanımlamak için mevcut. Ayrıca, biyofilm dağılım değerlendirme serbest bırakmak-in bakteri enfeksiyonu işlemi sırasında tetikleme olayları analiz taklit etmek için sunulmaktadır. Kristal violet boyama bir yüksek-den geçerek 96-şey plaka bağlılık tahlil yapisan bakteri tespit etmek için kullanılır. EPS üretim değerlendirme iki deneyleri tarafından belirlenir Yani mikroskobu EPS matris ve yarı kantitatif analiz fluorescently Birleşik polisakkarit bağlayıcı lektin ile boyama. Son olarak, biyofilm dağılım koloni sayıları ve kaplama ile ölçülür. Birden çok testleri pozitif verilerden biyofilmler karakterizasyonu destek ve diğer bakteri suşları safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu tanımlamak için kullanılabilir.

Introduction

Biyofilm oluşumu sırasında sert çevre koşullarına bağlı bir önemli bakteriyel hayatta kalma stratejisidir. Bakteri yok edici bileşikler maruz gibi antibiyotikler veya besin değişimler ya da oksijen durumu biyofilm oluşumu ile hafifletti bakteri stresli bir durumda neden olmaktadır. Bir biyofilm bakteri eki bir yüzey veya diğer bakteri ile karakterizedir ve öncelikle polisakkaritler1,2,3oluşan bir EPS matris salgı tarafından eşlik eder. Biyofilm oluşumu olayları bir çağlayan bir olgun yapisan bakteriyel topluluk1,2,3oluşumunda culminates dinamik bir süreçtir. Bakteri adhesin gen ifade profilleri eki biyofilm olgunlaşma sırasında güçlendirmek için değişen süre erken ek kolaylaştırmak için adhesins üretir. Aynı anda, EPS üretim kat ilk tetikleyici hücreleri korumak için bir matris bakteriyel toplumda için oluşur. Biyofilm içinde bulunan bakteriler yavaş büyüyen vardır; ve bu nedenle, en antibiyotikler etkisiz vermektedir. Ayrıca, yavaş büyüme Bakteriyel büyüme1,2,3iyilik için koşullar değiştirene kadar enerji tasarruf sağlar. Sert koşulları geçtikten sonra bakteri biyofilm dağıtmak ve planktonik yaşam tarzı1,2,3devam edin. Geleneksel olarak, biyofilmler yüzeylerinde gözlenen ve kalıcı bir klinik meydan okuma nedeniyle enfeksiyon rezervuarlar Kateterler ve konut cihazlar1,2,3mevcut temsil eder.

Biyofilm oluşumu son zamanlarda birkaç enterik patojenler için tanımlanmıştır; ince bağırsak veya iki nokta üst üste4bulaştırmak bakteri. Shigella türleri, enfeksiyonu gastrointestinal sistem çoğunluğu üzerinden transit sonra insan kolonda oluşur. İnce bağırsak yoluyla geçiş sırasında Shigella safra için maruz kalmaktadır; aynı anda birçok bakteri5öldürme süre lipidler hazım kolaylaştırmak için bağırsak içine salgılanan lipid aşağılayıcı deterjan. Enterik patojenler safra6bakteri yok edici etkileri karşı koymak için eşsiz bir yeteneği var. Bizim son analiz vivo içindekullanılan-hangi tarihlerde glikoz ve S. flexneri sağlam biyofilm oluşumu göstermek için safra tuzları birleşimleri yanı sıra diğer türler, Shigella, patojenik Escherichia colive Salmonella4. Daha önce Salmonella enterica serovar Typhi safra kaynaklı bir biyofilm safra kesesi benzersiz kolonizasyon kronik enfeksiyon7,8,9, sırasında nedeniyle oluşturmak için gösterildi 10. Ayrıca, Vibrio11ve Campylobacter12 ile önceki araştırma biyofilm oluşumu yanıt safra olarak gösterdi. Bu nedenle, analizler safra kaynaklı biyofilm oluşumu gözlemler diğer patojenler için genişletilmiş ve safra korunmuş enterik patojen yanıt bir gösteri kurmak için yardım. Bakteriyel gen transkripsiyonu sınırlıdır ve hücre yaşlanma1,2,3oluşabilir kronik biyofilmler enterik safra kaynaklı biyofilm doğada daha geçici öneriyorum. Bu geçici öldürücü biyofilm tarafından hızlı sökme (dağılım assay olarak görüldüğü gibi) hallmarked ve biyofilm nüfus4,6' gözlenen virülans gen ekspresyonu gelişmiş. 

Başlatan bir faktör sadece son zamanlarda en enterik patojenler açıklandığı olduğu gibi çok yönlü, dinamik bir süreç ve safra tuzları kullanımı biyofilm oluşumu olduğu gibi araçları ve teknikleri kullanılan eşsiz ve yaratıcı uygulamalar geleneksel yöntemler vardır. Böylece, burada sunulan üç ücretsiz stratejileri safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu, bakteriyel bağlılık, EPS matris üretimini ve canlı bakteri dağılımı biyofilm üzerinden de dahil olmak üzere birçok önemli özelliklerini ölçmek için vardır. Bu teknikler öncelikle Shigellaile araştırma için kullanılmıştır; ve bu nedenle, en iyi duruma getirme diğer enterik patojenler değerlendirilmesi gerekebilir. Yine de, tüm üç deneyleri olumlu veri tanımlaması biyofilmler destek ve safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu için tekrarlanabilir iletişim kuralları kurmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlanması reaktifler

  1. Safra tuzları orta: % 0.4 safra tuzları (ağırlık/hacim) içeren tryptic soya suyu (TSB) hazırlamak için safra tuzları 200 mg 50 mL resuspend autoclaved tekerlekli sandalye Basketbolu. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Taze orta haftalık olun.
    Notlar: Safra tuzları rutin olarak kullanılan sodyum cholate ve sodyum deoxycholate ovine ve sığır gallbladders izole bir 1:1 karışımı var. Daha önce4gösterildiği, glikoz varlığı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu için gerekli idi. Tekerlekli sandalye Basketbolu glikoz göre Luria-Bertani (LB) suyu ekledi; ve bu nedenle, Shigella ve analiz diğer enterik patojenler biyofilm oluşumu ikna etmek yeterliydi. Analiz edilebilir bakteri bağlı olarak, farklı glikoz konsantrasyonu veya farklı şeker gereksinimleri gerekli olabilir.
  2. %0,5 w/v kristal violet su: 2.5 g kristal violet 500 mL distile suda çözülür. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak.
  3. Concanavalin A (ConA) Birleşik floresein isothiocyanate (FITC): 1 x PBS stokta Reconstitute. 25 µg/mL nihai bir konsantrasyon PBS'ye 1 x 400 μL ile 10 mg konsantre stok sulandırmak ve ışıktan korumak.
  4. PBS + glikoz: 10 mL 1 x PBS (%2 w/v glikoz son) 0.2 g glikoz geçiyoruz. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.
  5. PBS + safra tuzları: 40 mg 10 mL 1 x PBS çözülür (% 0,4 w/v safra tuzları son). Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.
  6. PBS + glikoz ve safra tuzları: 40 mg safra tuzları ve 10 mL 1 x PBS (% 0,4 w/v safra tuzları ve % 2 w/v glikoz son) 0.2 g glikoz geçiyoruz. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.
  7. LB Ağar kaplamalar hazırlayın.
  8. Formaldehit/oxazolidin düzeltme: ekleme 810 µL formaldehit (% 37 hisse senedi çözüm, % 3 son konsantrasyonu) ve 125 µL oxazolidin (% 25 hisse senedi çözüm, %0.25 son konsantrasyonu) 14 mL 1 x PBS için. İyice karıştırın ve 4 ° C'de depolayın Belgili tanımlık saptamak için doğru kullanımı soğuk olmalıdır.
    Dikkat: Belgili tanımlık saptamak zehirli ve tehlikeli atık bertaraf gerektirir.
  9. Antifade mountant çözüm: 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) leke içeren antifade mountant çözüm photobleaching immünfloresan mikroskobu örneklerinin fluorescently bakteri DNA boyama sırasında inhibe için kullanın.

2. bakteri hazırlanması

  1. TSB 3 mL steril kültür tüp içinde bir tek, iyi izole koloni ile aşı test edilecek bakteri suşlarının gecelik kültürler büyümek. 37 ° C'de gecede kuluçka (16-24 h) için 225 rpm'de sallayarak ile kuluçkaya.
    Not: Suşları dondurucu stokları her 2 4 hafta ve üzerinde tutulan plakaları Hayır 2 haftadan fazla restreaked.

3. katı faz bağlılık tahlil

Not: Bu tahlil yapisan bakteri bir 96-şey plaka yöntemi kullanarak quantifies. Bakteri statik olarak düz dipli levha yetiştirilmektedir. Yapisan bakteri kristal violet ile lekeli ve çamaşır yapışık olmayan bakteriler kaldırmak için gerçekleştirilir. Kristal mor leke peptidoglikan bakteriyel hücre duvarı bağlar ve etanol kullanarak çözündürüldükten. Yapisan bakteri sayısı kristal violet saklama üzerinde bağlı olarak belirlenir.

  1. İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + safra tuzları (BS) ile.
  2. TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.
  3. Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).
  4. Bir steril, temiz, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim wells (TSB ve tekerlekli sandalye Basketbolu + BS) test edilecek her ortam türü için ayarlayın.
  5. 130 µL/iyi kültürü aşılamak üç kuyu ekleyin ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar yineleyin.
  6. 4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.
  7. Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Denetim orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. OD600 değerleri büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir.
  8. Kültür plaka hafifçe eğerek ve yavaş yavaş kuyu alt kenarına orta aspirating bir vakum hattı kullanan orta kaldırın. Plastik yüzeyde bulunan yapisan bakteriyel nüfus aksatmadan kültür orta toplamak emin olun. EPS matris kuluçka döneminde üretilen, matris beyaz çökelti görüntülenir. EPS matris rahatsız etmeyin.
  9. Yavaşça wells bir kez 200 µL steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.
  10. Kuru için plaka tersine çevirin. En az 20 dk kurumaya izin.
    Not: biyofilm iyice boyama önce kurutulmuş gerekir beri Protokolü birkaç saat için bu adım, duraklatılmış veya bile gece olabilir. Eksik kurutma sonuçları ve tekrarlanabilirlik miktar etkiler iken eklenen kuruma süresi boyama yordamı değiştirmez.
  11. %150 0.5 kristal violet için her deneysel µL ve denetimi de ekleyin.
  12. (RT) oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  13. Wells bir kez 400 µL distile su ile yıkayın. Eklenen birim artık kristal mor leke kuyuları taraftan kaldırmak için yardımcı olur. Yıkama vakum hattı ile kaldırın.
  14. Wells beş kez 200 µL distile su ile yıkayın. Yıkama vakum hattı ile kaldırın.
    Not: Ayrıntılı çamaşır miktar için önemlidir. Ne zaman boş wells distile su açık ve herhangi bir kalıntı kristal mor leke içermeyen, sonraki adıma geçin.
  15. Kuru için plaka ışıktan korunan tersine çevirin. Yukarıda da belirtildiği gibi plaka tam kurutma emin olun.
  16. Wells 200 µL % 95 etanol ile destain. Plaka için 30 dk shaker üzerinde kuluçkaya. Özellikle yüksek sıcaklıkta buharlaşma önlemek için bu adım 4 ° C'de uygulayın
  17. Bir plaka okuyucu kullanarak, OD540kaydedin.
    Not: Kristal violet maksimum Absorbans için dalga boyu 590 olduğunu nm. Belgeleri OD540 - kristal violet Absorbans için OD5954,13,14,15,16 Aralık raporları; Böylece bir dalga boyu kullanılabilir plaka okuyucu göre seçin.

4. EPS matris algılama

Not: Bu ücretsiz deneyleri ölçmek ve aka görselleştirin. İkimiz de EPS polisakkaritler bağlamak için bir lektin kullanılarak algılanır. Fluorescently Birleşik protein miktar (Adım 4.1) ve görsel öğeler (Adım 4.2) sağlar.

  1. EPS yarı kantitatif tespiti
    1. İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.
    2. TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.
    3. Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).
    4. Bir steril, siyah, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyular test edilecek her ortam türü için ayarlayın. 130 µL/iyi kültürü aşılamak için kuyu eklemek ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar tekrarlayın.
    5. 4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.
    6. Kültür orta açık 96-şey plaka bir pipet, ideal olarak bir çok kanallı pipet ile aktarın. Yapisan nüfus ve/veya plastik yüzeyde bulunan EPS aksatmadan kültür orta toplamak için dikkatli olun. Bir kenara koyun.
    7. 15 dakika siyah plaka RT 200 µL/kuyu formaldehit/oxazolidin 1 x PBS kullanarak düzeltmek.
    8. Yapisan nüfus tespit ederken, adım 4.1.6 süpernatant kesir değerlendirin. Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Denetim orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın.
      1. Alternatif olarak, tüm tahlil bir siyah açık alt plaka gerçekleştirilebilir. Bu gibi durumlarda aşırı doz600 değerleri kaydedilebilir ve kültür orta daha sonra 4.1.7 adıma devam etmeden önce iptal edilecek. OD600 değerleri verileri normalleştirmek için kullanılabilir durumda büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar vardır.
    9. Düzeltmeyi kaldırmak ve tehlikeli atık bertaraf.
    10. Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama hafifçe eğerek plaka ve yavaş yavaş kuyu alt kenarına yıkamada aspirating vakum satırını kullanarak kaldırın.
    11. 150 µL/iyi olarak 25 µg/mL ConA-FITC ekleyin ve 15 dakika RT., kuluçkaya
    12. Yavaşça iki kez 200 µL PBS ile yıkayın.
    13. PBS 150 µL her şey için ekleyin. 488, Floresans kaydetmek nm.
  2. Confocal mikroskobu görselleştirme EPS üretim ve biyofilm kalınlığı hesaplanması
    1. İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.
    2. TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.
    3. Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).
    4. Steril bir 24-şey plaka ile 12 mm cam coverslips steril ayarlayın. Boş denetimi hizmet için üç kuyu 400 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyular test edilecek her ortam türü için ayarlayın.
    5. Yinelenen wells aşısını kültürünün 400 µL eklemek ve tüm deneysel koşullar kaplama kadar tekrarlayın.
    6. 4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.
    7. Görsel olarak TSB koşulu, büyüme ve EPS çökelti (TSB beyaz) + BS koşulu, büyüme ve hiçbir büyüme ve/veya steril kontrol Wells beyaz çökelti onaylayın. Supernatants kaldırın.
    8. RT 200 µL/iyi formaldehit/oxazolidin çözüm 1 x PBS kullanarak, 15 dk fix.
    9. Düzeltmeyi kaldırmak ve tehlikeli atık bertaraf.
    10. Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.
    11. 150 µL/iyi olarak 25 µg/mL ConA-FITC ekleyin ve 15 dakika RT., kuluçkaya
    12. Yavaşça iki kez 200 µL/kuyu ile PBS yıkayın.
    13. Antifade mountant çözüm DAPI ile bağlayın.
      Not: Aynı anda bir counterstain olarak görselleştirme için bakteri hücrelerindeki DNA boyama sırasında floresan etiket korumak için DAPI içeren bir hazır, gliserol tabanlı bağlama çözüm çözümdür. Kit'in yönergeleri ve önerileri örnekleri Imaging önce kuluçka süreleri için izleyin. Yordam boyama DAPI DAPI içermiyor antifade mountant çözüm uygulanmadan önce gerçekleştirilir.
    14. Tarafından confocal mikroskobu değerlendirin. Confocal mikroskobunun lazer 495 nm/519 nm uyarma/emisyon FITC görselleştirme için ayarlayın. İkinci bir lazer 360 nm/460 nm uyarma/DAPI görselleştirmek için emisyon için ayarlayın. Biyofilm DAPI kanal üzerinde odaklanarak bulun. DAPI ve FITC kanalları tam kalınlıkta belirlemek ve üst ayarlamak için kullanın ve alt kenarlıklarını görüntüleme. Tam kalınlıkta Z-yığın görüntüleri tarafından esir alma imge her 0.25 µm z yığının altında ve üst için parametreleri ayarladıktan sonra kaydedin. Confocal mikroskobu hakkında daha fazla bilgi için lütfen yayınlar için Paddock ve ark. tarafından bakın. 17 , 18 , 19 , 20
    15. Tam biyofilm oluşumu görselleştirmek ve biyofilm kalınlığı hesaplamak için ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) 3D görüntülerde yeniden. S. flexneri safra-tuz indüklenen biyofilmler için elde edilen ortalama kalınlık 14 µm4oldu.

5. dağılım tahlil

Not: Bu tahlil biyofilm bakteri dağılımı ile sökme algılanır. Burada, olgun biyofilmler kurulan ve daha sonra (genellikle ertesi gün), medya PBS ile değiştirilir veya PBS desteklenmiştir. Süpernatant bileşeni sonra biyofilm ayrışmış bakteri sayısı quantitate için tabi.

  1. İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.
  2. TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.
  3. Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).
  4. Bir steril, temiz, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyu test edilecek her ortam türü için ayarlayın.
  5. 130 µL/iyi kültürü aşılamak için üç kuyular ekleyin ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar yineleyin.
  6. 4-24 h 37 ° C'de plaka statik olarak kuluçkaya.
  7. Devam etmeden önce sıcak PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + 37 ° c glikoz Bu reaktifler taze günlük hazırlayın.
  8. Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. OD600 değerleri büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir.
  9. Kültür bir vakum hattı kullanan orta kaldırın. Plastik yüzeyde bulunan yapisan nüfus aksatmadan kültür orta toplamak emin olun.
  10. Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.
  11. Aşağıdaki üç kuyu içine 130 µL/iyi yıkamak yerine: PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + glikoz. Bu reaktifler 37 ° C'ye Önceden ısıtılmış olmalıdır
  12. 37 ° C'de 30 dk plaka kuluçkaya
  13. Dikkatli bir şekilde plaka 37 ° C kuluçka çıkarın. Supernatants bir taze, steril 96-şey tabağa aktarın.
  14. 96-iyi blok, levha veya seyreltme kullanarak hazırlamak 10 kat (1:10) steril PBS içine süpernatant, seri dilutions.
    Not: Seyreltme serisi su katılmamış 10-6 bağlı olarak test edilecek bakteriyel zorlanma alanı. Pilot deneyler en uygun seyreltme aralığı belirlemek için gerçekleştirilebilir.
  15. Plaka 5 µL üzerine bir çok kanallı pipet kullanarak LB agar her seyreltme, nokta. 37 ° C'de gecede kuluçkaya. Koloniler ertesi gün ve seyreltme faktörü hesaba birimleri (CFU) oluşturan kurtarma koloni belirlerken güvenirim. 1 x PBS denetimi (% 100 ayarlamak) göre yüzde dağılımı hesaplamak için 1 x PBS denetimi örneğini kurtarma CFU tarafından her tedavi durum CFU kurtarma bölün.
    Not: Rutin medya plakaları bakteriyel zorlanma ilgi için de kullanılabilir. Örneğin, Shigella Kongo kırmızısı Tabaklarda kaplama. Tabakları için uygun yer kaplama teknikleri kuru olduğundan emin olun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1' de, altı enterik patojenler sınanan aşağıdaki büyüme medyada safra tuzları içeren çoğunda biyofilm oluşumu indüklenen. Safra tuzları pozlama neredeyse tüm suşların görülmektedir sonra yapisan bakteri önemli bir artış test. İstisnadır enteroaggregative E. coli (olursa); ancak, Δaaf mutant4indüklenen gözlenmesi unutmayın. Ek bağlılık mekanizmaları olursa safra tuzları pozlama aggregative bağlılık aktarılmasını yokluğunda tarafından indüklenir sonuçlar gösterir ben (AAF / ı)21. Bu veri kümesinden sonuçlara ulaşmak için OD540 değerleri test her zorlanma ve ortam türü için arsa. Her zorlanma medya denetimdeki değerleri karşılaştırmak (-BS) medya göre safra tuzları içeren safra tuzları önemli ölçüde biyofilm oluşumu teşvik belirleyecek. Bakteri suşları ve/veya mutantlar arasında karşılaştırmalar da daha fazla karakterizasyonu analizleri için gerçekleştirilebilir.

EPS ConA-FITC değerlendirilmesi Şekil 2' de sunulmuştur. Şekil 2A yarı kantitatif değerlendirmesi, EPS üretim ConA-FITC biyofilmler leke için kullanılan gösterir. EPS matristeki polisakkaritler ConA bağlar ve muhafaza tutar bir floresan plaka okuyucu tarafından algılanır. Verileri sunmak için her koşul için ortalama Floresans adet arsa ve biyofilm indükleyici koşulları negatif kontrol için karşılaştırın. Ayrıca, bakteri suşları veya mutantlar arasında karşılaştırmaları gerçekleştirilir. Arka plaka oluşur ConA-FITC Floresans miktarını belirlemek için yalnızca medya, negatif bir denetim analiz etmek için önemlidir. Tekerlekli sandalye Basketbolu durumu önemli ölçüde farklı medya denetiminden Floresans okuma önemli ölçüde artış aşağıdaki safra tuzları pozlama sırasında değildi. Verileri EPS üretim biyofilm oluşumu göstergesidir ve safra tuzları, yokluğunda S. flexneriiçin oluşmaz emin olun. S. flexneri safra tuzu kaynaklı biyofilmler görüntülerini şekil 2B. temsil ConA-FITC DAPI counterstain bakteri DNA boyama tarafından görselleştirmek için kullanılırken EPS matristeki polisakkaritler leke için kullanılır. Safra tuzları (negatif kontrol) maruz bırakılmamalıdır bakteri için sadece DAPI algılanır. Özellikle, bakteri yoğunluğu safra tuzları durumda çok daha düşüktür. Açık bir arka plan üzerinde FITC kanal EPS üretim eksikliği göstermek için elde edilir. Beklendiği gibi EPS üretim safra tuzları pozlama takip biyofilm oluşumu1,2,3 ile ilişkili verileri göstermek. Safra tuzu tedavi örnekleri denetiminde boyama ConA - FITC Floresans özgüllük göstermek için sağlanmıştır. Bu görüntüler için 1 x PBS ConA-FITC yerine kullanılan ve DAPI counterstain devam edildi. Görüntüleme biyofilmler EPS-pozitif örnekleri4kalınlığı değerlendirmek için confocal mikroskop ile yapılabilir.

Bakteriyel dağılım şekil 3 ' te biyofilmler üzerinden kurulan biyofilmler kuluçka PBS veya ilave PBS tarafından algılanır. Fizyolojik olarak, safra ince bağırsak dolaşımda içine emilir ve safra sadece % 5 iki nokta üst üste5girer. Shigella kolon epiteli istila gibi biz bu hipotez emiliminin safra biyofilm dağılım için önemli bir sinyal olduğunu. Bu şekilde dağılım biyofilmler maruz için PBS veya PBS + glikoz oluşur; Ancak, dağılım inhibe PBS + safra tuzları glikoz varlığı ne olursa olsun. Verileri safra tuzları kaldırılması gerekli ve S. flexneri dağılım safra tuzu kaynaklı biyofilmler4ikna etmek yeterli olduğunu ispat. Verileri çizmek için kurtarılan CFU bakteri ya da göreli yüzde (burada görüldüğü gibi) denetlemek için çizilebilir.

Figure 1
Şekil 1: safra tuzları neden enterik patojenler biyofilm oluşumu. 18 h biyofilmler doku kültürü tedavi 96-şey plakalar TSB veya TSB + % 0,4 safra tuzları medya üzerinde büyüdü ve % 0,5 kristal violet ile lekeli. Etanol solubilization kristal mor leke nicel değerleri spectrophotometry, OD540tarafından belirlendi. Safra tuzları pozlama anlamlı bir artış biyofilm oluşumu Shigella flexneri, S. dysenteriae, enteropathogenic Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhi ve S. enterica serovar Typhimurium. İstatistiksel anlamlılık öğrenci T-testi ortam denetimi safra tuzları tedaviye karşılaştırma her zorlanma için tarafından tespit edilmiştir. Ortalama (SEM) standart hatası hata çubukları tarafından temsil edilir. Bütün p-değerler < 0,0001. Gösterilen veriler vardır birinden (n = 3) bir önceki yayın4' te sağlanan verileri tam bir set ile temsilcisi deneme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu tespit bir EPS matris üretimi FITC etiketli Concanavalin A. ile karakterize (A)steril siyah, 96-şey plaka numaralı seribaşı S. flexneri ile 1:50, seyreltme TSB veya TSB + safra tuzları içine ve 18 h. biyofilmler sabit için hafifçe yıkanmış ve lekeli ile ConA FITC büyüdü. Tutulan Concanavalin-A FITC miktarı bir floresan plaka okuyucu tarafından tespit edilmiştir. Çizilen değerlerinin EPS miktar TSB veya TSB içeren safra tuzları yetiştirilen flexneri S. büyüme takip göstermektedir. Önemi tarafından tek yönlü ANOVA kararlı ve p -değerler < 0,01. SEM hata çubukları tarafından temsil edilir. Gösterilen veriler vardır birinden (n = 3) bir önceki yayın4' te sağlanan verileri tam bir set ile temsilcisi deneme. (B) mikroskopi safra tuzu kaynaklı Shigella biyofilm görüntüleri. Steril coverslips numaralı seribaşı S. flexneri ile 1:50, seyreltme TSB veya TSB + safra tuzları ve 18 h için büyüdü. Coverslips daha sonra sabit ve ConA-FITC ile lekeli ve/veya DAPI ile counterstained. ConA-FITC sadece EPS matris varlığı nedeniyle safra tuzları durumu algılandı. Sadece DAPI TSB + safra tuzları tedavi ile lekeli bir coverslip en az arka plan floresan confocal mikroskop FITC ayarda için göstermek için kullanıldı. Her dalga boyu kanal ve bir bileşik kaplaması için görüntüler için tüm tedavi şartlar sağlanır. Ölçek Çubuklarõn 10 µm. gösterilen veriler vardır birinden (n = 3) bir önceki yayın4' te sağlanan verileri tam bir set ile temsilcisi deneme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: safra tuzu kaynaklı biyofilmler üzerinden bakteriyel dağılım analizi. 18 h safra tuzu kaynaklı Shigella flexneri biyofilmler PBS veya glikoz, safra tuzları veya glikoz ve safra tuzları ile desteklenmiş PBS maruz kalan. Süpernatant daha sonra seri olarak seyreltilmiş ve biyofilm dağılan birimleri (CFUs) oluşturan colony Numaralandırılacak agar Tabaklarda kaplama. Kurtarılan bakteri sayısı PBS denetimi göre çizildi. Koşullar üzerinden PBS veya PBS + glikoz biyofilm bakteri dağınık ama safra tuzları varlığı üzerinden biyofilm bakteri dağılımı etkisizleştirmek yeterli idi. Gösterilen veriler vardır birinden (n = 3) bir önceki yayın4' te sağlanan verileri tam bir set ile temsilcisi deneme. Başvuru için 100-fold daha fazla bakteri rutin olarak karşılaştırıldığında PBS + safra tuzları tedavi (yaklaşık 7 x 105 CFU) için PBS kontrol tedavi (yaklaşık 7 x 107 CFU) ele geçirildi. Önemi tarafından tek yönlü ANOVA kararlı ve p -değerler < 0,0001. SEM hata çubukları tarafından temsil edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biyofilm oluşumu analizini biyofilmler ve suşları, malzemeleri, laboratuar ve deneyleri arasında değişkenlik dinamik doğası nedeniyle zordur. Burada, çeşitli stratejiler enterik patojenler safra tuzları pozlama deneysel fikir tekrarlanabilirlik tanıtmak için sağlanan takip biyofilm oluşumu belirlemek için sunulmuştur. Tekrarlanabilirlik emin olmak için ek konuları vardır. Her şeyden önce en az üç bağımsız gerçekleştirme her gözlem ve istatistiksel önemi nedeniyle oluşabilir değişim onaylamak için teknik triplicates ile deneyler öneririz. İkinci olarak, pozitif ve negatif denetimlerini tekrarlanabilirlik testin sağlamak için önemlidir. Mutantlar biyofilm oluşumu için değerlendirirken vahşi türü zorlanma olumlu bir denetim olarak kullanılacak önerilir. Ayrıca, biyofilm oluşumu için önemli genler tanımlanır (örneğin, Vibrio22, Salmonella7ve E. coli23,24,25bakınız), kullanımı biyofilm mutantlar negatif denetimleri olarak tahlil tekrarlanabilirlik doğrular. Üçüncü olarak, belgili tanımlık yukarıda yöntem odaklı araştırma Shigella ve S. flexneri, özellikle temel alır. Protokoller için ayarlamalar değerlendirilen her enterik patojen büyüme gereksinimlerine bağlı olarak gerekli olabilir. Dördüncü olarak, deneyleri bir bakteriyel stres tepkisi ölçün; ve bu nedenle, uygun şekilde muhafaza bakterilerden donmuş hisse senedi (-80 ° C) veya depolama plakalar soğutma (en fazla 4 ° C) altında iki hafta için sürekli çalışmak önemlidir. Yersinia cins enterik patojenler dahil olmak üzere bazı bakteriler 0 ° C26yakın ısılarda büyüyebilir psychrotrophs olduğunu unutmamak gerekir. Buzdolabında sıcaklıklarda depolama bakteri fizyolojisi alter ve muhtemelen genotypic neden veya fenotipik vardiya27,28,29, son derece tavsiye edilir, aliquots hazırlamak için beri hisse senedi kültür-80 ° c starter kültürler içine rutin aşılama için. Ayrıca, klinik yalıtır ile çalışma daha sık restreaks-80 ° C hisse senetleri gelen genetik vardiya hızla bir klinik olarak türetilmiş bakteriyel yük30,31 ayarlama laboratuvar haline geçiş zaman gözlenir gerektirir . Özellikle Shigella ile çekim izole, suşlarının hızla uyum ve fenotip vardiya kez32,33oluşur. Bir kez bir ay ve restreak hisse senedi iki haftada plaka bu dondurucu stokları restreak bakteri için tavsiye edilir.

Tekrarlanabilirlik emin olmak için bir başka önemli faktör tahlil değişkenliği sınırlamak için taze safra tuzları medya hazırlıktır. Safra tuzları medya 1 haftadan büyük taze medya hazırlıkla gözlenen güçlü fenotip olumsuz etkiledi. Ayrıca, patojen ve analiz (ince bağırsak kolon karşı) olmak pozlama türüne bağlı olarak farklı kaynaklardan ve safra tuzları karışımları gerekli olabilir. Örneğin, bireysel safra tuzları, Birleşik ve kaynakları de-Birleşik ya da kolesterol ve bilirubin olabilir gibi ek safra bileşenleri içeren ham safra özleri5,6kullanılmıştır. Shigella analizleri bakteriyel uyarlaması ana bilgisayara transit sırasında ince bağırsak enfeksiyonu kolon önce üzerinde odaklanmıştır. Bu nedenle, cholate ve deoxycholate karışımı kullanımı ince bağırsak5,6,34koşullarını taklit eder. Ayrıca dağılım yöntemi (Bölüm 5) açısından, PBS takıma reaktifler taze günlük yapılacak ve 37 ° C önceden tahlil için önceden ısınmış üzeresiniz belirtilir. Reaktifler birkaç günden daha eski kullanıldığında, tekrarlanabilirlik testin ciddi bir şekilde tehlikeye girdi. Dağılım kolayca oda sıcaklığında reaktifleri ile meydana gelmedi gibi bu reaktifler 37 ° c önceden ısıtmak için önemliydi. Son olarak, hangi katmak sonication35,36 veya Enzimatik sindirim37dağılım yöntemleri biyofilm numaralandırılmasına tam titresi değerlendirilmesi için kullanılabilir. Dağılım tahlil için yaklaşım Shigella transit terminal ileum ve kolon içine olarak safra tuzu emiliminin etkisini değerlendirmek doğru yönetildi. Analizi hipotezler safra tuzları kaybı geçici biyofilm dağılımını sağlayacak ve Shigella kolon epiteli4' te,5 neden enfeksiyonu önce biyofilm dağıtmak gerekir dayalı . Burada sunulan strateji fizyolojik bir fenotip Shigellaiçin yakalamak için iki nokta üst üste geçiş ileum öykünür ederken sonication ve Enzimatik sindirim gibi koşullar biyofilm mikrobiyal kütlesinin toplam yayın temsil eder. İstenen deneysel koşullarına bağlı olarak, ek yöntemleri dağılım analizi veya biyofilm numaralandırma için gerekli olabilir.

Deneyleri orta yüksek-den geçerek birden çok bakteri suşları ve/veya koşulları test etkinleştirmek için 96-şey plakaları kullanımı ile olacak şekilde tasarlanmıştır. Daha fazla tekrarlanabilirlik biyofilm oluşumu emin olmak için doku kültürü tedavi edildi düz oturaklı, 96-da kaplamalar kullanıldı. Teknik nedenlerden dolayı plaka okuyucu doğru Absorbans veya floresan yuvarlak alt tabak içinde ölçemezsiniz. Ayrıca, kaplamasız plakaları Shigella, şu anki soruşturmanın bir cadde olan değişken bağlılık profillerinde teklif etti. Deneyleri büyük iyi formatları için orantılı olarak ölçeklendirilebilir, ama deneysel verimliliği azaltan protokolü için değişiklik gerektirecektir. Örneğin, kültür medya cuvettes OD600 değerlerini bir Spektrofotometre ile kaydetmek için transfer gerekir. Ayrıca, kristal violet lekeli biyofilm alıntı % 95 etanol içinde 30-60 dk kuluçka takip adım destain ve içeriği OD540Spektrofotometre kaynaklar için bir küvet için transfer edilebilir. Bakım ne zaman her şey biyofilm içeriğini hurdaya sıçramasına önlemek için alınması gereken ve hurdaya 60 dk kuluçka takip daha kolay olduğunu bulduk.

Analiz , Salmonella, Shigella ve patojenik E. coliile4 biyofilm oluşumu için enterik patojenler için safra tuzları maruz bir hızlandırılmış zaman ölçeği (24 saat içinde) oluşur tekrarlanan bir gözlem gösterdi. 48 ila 72 biyofilm oluşumu normal şartlar altında gözlemlemek için h gerektiren diğer bakteri aksine, enterik biyofilm safra tuzu kaynaklı 4 h ilk bağlılık faz ile olduğu kadar erken başlar. Daha sonra EPS matris oluşumu 6 h tarafından belirgindir ve olgunlaşma tarafından 24 h oluşur. Bu nedenle, 24 h bağlılık fenotip biyofilm oluşumu farklı bağlılık faktörlerin rolü çözmeye çok güçlü olabilir. Erken analizleri yapmadan örneğin 4 h, gibi erken faktörler tanımlanması için daha sonraki bir saat aşamada kaçırılmaması erken biyofilm oluşumu önemli olanağı sağlar. Son olarak ve yukarıda da belirttiğimiz gibi protokol adımda Shigella için safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu glikoz4yokluğunda algılanmadı. EPS matris öncelikle polisakkaritler oluşan ve biyofilm oluşumu çoğu bakteri38için kritik bir adımdır olduğundan, glikoz veya diğer şeker medya varlığı büyük olasılıkla biyofilm oluşumu gözlemlemek önemlidir. Analiz bakteriyel pathogen bağlı olarak farklı temel medya formülasyonları gerekli olabilir.

Biyofilm oluşumu kez açık bir sistemde oluşan bir çok katmanlı besin akı ve sıvı hareket kolayca1,2,3gerçekleştiği işlemidir. Yöntemler sınırlı kapalı kültür ve statik hacmindeki; Ancak, yöntemleri değerlendirme biyofilm oluşumu laboratuvar ayarı etkinleştirin. Biyofilm fenotip kimlik, daha fazla sıvı hücreleri veya sürekli kültür stratejileri39kullanarak deneyler,40,41 fizyolojik veya klinik ek mekanik içgörü sağlamak biyofilm oluşumu önemi. EPS matris tanımlaması için polisakkarit bağlayıcı lektin ConA iletişim kurallarını kullanın. ConA α-D-glucosyl veya sterically yakından ilgili artıkları42bağlar. Farklı lektinlerinin farklı cins veya türler için üretilen EPS türüne bağlı olarak gerekli olabilir. EPS üretim tanımlamak için bir alternatif her iki doğrulama EPS üretilir ve EPS matris43,44kompozisyonu belirlemek sağlayacaktır kütle spektrometresi stratejisidir. Ayrıca, DAPI counterstain kullanımı önemli parlaklık biyofilm veya kez EPS matris45,46yılında mevcut hücre dışı DNA örneğini bakteri sayısı göz önüne alındığında, neden olabilir.

Literatürde açıklanan yukarıda yöntem alternatifi vardır. Örneğin, katı fazlı bağlama tahlil kullanılmak üzere diğer patojenler (örneğin, başvurular4,25,47,48,49) bildirilmiştir. Yayınlar arasında protokol değişiklikler vardır; ve bu nedenle, burada sunulan stratejileri çoğaltılır kolay biçimi. İletişim kurallarını biyofilmler düzeltmek bazı gruplar tercih ederken (Adım 3.10) boyama önce air-drying biyofilmler belirtmek unutmamak gerekir. İki farklı yaklaşım patojen özgü stratejileri değişen temsil edebilir. Ayrıca, kristal mor leke su hazırlayarak, tutarlı biyofilm oluşumu fenotip algılandı. Diğer gruplar etanol kristal violet solubilize için kullanın; kendisi için Shigella, tekrarlanabilirlik tehlikeye ve biyofilmler of destabilization yol açtı. Şu anda etanol Shigella biyofilm çözünür olabilir faktörler araştırıyoruz. Miktar EPS ürün ConA boyama tarafından başka bir örnektir. 96-şey plaka floresan algılama yöntemi (Adım 4.1) biyofilm FITC Birleşik ConA bağlama miktarını yansıtan yarı nicel değerler belirlemek için sunulmaktadır. Bilgimizi, ilk kez bu strateji bildirilmiştir yöntemidir. EPS algılama mikroskobik inceleme ile literatürde kabul edilir ve EPS görselleştirmek farklı ancak tamamlayıcı, strateji sağlar. EPS confocal mikroskobik algılama ile kombine yarı kantitatif floresan algılama kesinlikle özellikle yukarıda açıklanan mikroskobu analizde DAPI counterstain yordam sınırlamaları verilen veriler güçlendirdi. Toplamda, bir önemli burada açıklanan deneyleri kümesindeki her tekniği başka bir yaklaşım enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu dinamik bir değerlendirme ortaya çıkmasına tamamlar güçtür.

Safra tuzları ve öldürücü biyofilmler enterik bakteri Escherichia türleri paradigma dahil edilmiştir gibi bu yöntemler modelleri doğrulamak, rolleri belirli genlerin tanımlamak, genler bilinmeyen işlev tanımlamak ve sağlamak için kullanılacak tahmin edilmektedir Klinik suşları genel karakterizasyonu. Genler olgun biyofilm kaybediyordum biyofilm oluşumu bir yönü olarak önemli tanımlaması kurulmuş, bu nedenle tanımlaması bakteriyel her bileşenin özel işlevler sağlayan çok yönlü bir yaklaşım sağlar biyofilm. Ayrıca, patojen adaptasyon insan bağırsak içinde hızla meydana gelen bir olgu olması ile belirgin olarak safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu rolü içinde oluşur yeni korunmuş, takdir ve kritik bir olgu, bir örnektir Shigella enfeksiyon yanı sıra ek enterik patojenler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Acknowledgments

Biz Rachael B. Chanin ve Alejandro Llanos-Chea teknik yardım için teşekkür ederim. Biz Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski ve Bobby Cherayil bu çalışmada kullanılan suşları için teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar Grant K22AI104755 (C.S.F.) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
Crystal Violet Sigma C6158-50
Concanavalin-A FITC Sigma C7642-10mg
Glucose Sigma G7021-1KG
Bile Salts Sigma B8756-100G
LB Agar Sigma L7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile Fisher 14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPI Vector Laboratories H-1500
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635-500
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich G6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear) TPP 92696
Flat-bottomed 96-well plates (black) Greiner Bio-One 655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear) TPP 92424
Glass coverslips 12mm, round Fisher 08-774-383
96-well plate reader Spectramax
Flourescent plate reader Biotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent Microscope Nikon A1 confocal microscope
37°C Shaking Incubator New Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate Incubator Thermolyne Series 5000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joo, H. -S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. delaL., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), 992-6, 998-1002, 1004 (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-4, 646, 648 (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis? Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , Elsevier Science. (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
  48. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sorunu 135 biyofilm oluşumu enterik patojenler Shigella safra safra tuzları EPS matris dağılım
Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nickerson, K. P., Faherty, C. S.… More

Nickerson, K. P., Faherty, C. S. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (135), e57322, doi:10.3791/57322 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter