Visualisering af cellulære elektriske aktivitet i zebrafisk tidlige embryoner og tumorer
Summary
Her, vi viser processen med at skabe en cellulær elektrisk spænding reporter zebrafisk linje for at visualisere fosterudviklingen, bevægelse, og fisk tumor celler i vivo.
Abstract
Bioelektromagnetisme, endogene elektrisk signalering medieret af ionkanaler og pumper beliggende på cellemembranen, spiller vigtige roller i signalering processer af overgearet neuronal og muskuløs celler og mange andre biologiske processer, såsom embryonale udviklingsmæssige mønstre. Der er imidlertid behov for i vivo elektriske aktivitetsovervågning i hvirveldyr embryogenese. Fremskridt i genetisk kodet fluorescerende spænding indikatorer (GEVIs) har gjort det muligt at give en løsning på denne udfordring. Her, vi beskriver, hvordan du opretter en transgene spænding indikator zebrafisk ved hjælp af etablerede spænding indikator, ASAP1 (accelereret Sensor af handling potentialer 1), som et eksempel. Tol2 kit og en allestedsnærværende zebrafisk promotor, ubi, blev valgt i denne undersøgelse. Vi forklarer også processerne af Gateway lokationsspecifikke kloning, Tol2 transposon-baserede zebrafisk transgenese og billedprocessen for tidligt fisk embryoner og fisk tumorer ved hjælp af regelmæssig epifluorescerende mikroskoper. Bruger denne fisk linje, fandt vi, at der er cellulære elektrisk spændingsændringer under zebrafisk embryogenese og fisk larve bevægelse. Det konstateredes desuden, at tumor celler var generelt polariseret i et par zebrafisk maligne perifere nerve kappe tumorer, i forhold til det omgivende normale væv.
Introduction
Bioelektromagnetisme refererer til endogene elektrisk signalering medieret af ionkanaler og pumper beliggende på cellemembranen1. Ionisk udvekslinger på tværs af den cellulære membran, og de koblede elektriske potentielle og aktuelle ændringer, er afgørende for signalering processer af overgearet neuronal og muskuløs celler. Bioelektromagnetisme og ion forløb har derudover en række andre vigtige biologiske funktioner herunder energilagring, biosyntese og metabolitten transport. Bioelektriske signaler blev også opdaget som en regulator af embryonale mønster dannelse, som kroppen akser, celle cyklus og celle differentiering1. Det er således afgørende for at forstå mange menneskelige medfødte sygdomme, der skyldes mis forordning af denne type signalering. Selvom patch klemme har været almindeligt brugt til registrering af enkelt celler, er det stadig langt fra ideel til samtidig overvågning af flere celler under fosterudviklingen in vivo. Desuden er spænding følsomme små molekyler også ikke ideel til i vivo ansøgninger på grund af deres særlige karakteristika, følsomheder og toksicitet.
Oprettelsen af en række genetisk kodet fluorescerende spænding indikatorer (GEVIs) tilbyder en ny mekanisme til at afhjælpe dette problem, og giver mulighed for nem anvendelse til at studere embryonale udvikling, selv om de var oprindeligt beregnet til overvågning neurale celler2,3. En af de foreliggende GEVIs er accelereret Sensor af handling potentialer 1 (ASAP1)4. Det er sammensat af en ekstracellulære loop af en spænding-sensing domæne af spænding følsomme fosfatase og et cirkulært den ombyttede grøn fluorescerende proteiner. Derfor, ASAP1 giver mulighed for visualisering af cellulære elektriske potentielle ændringer (polarisering: lys grøn, depolarisering: mørk grøn). ASAP1 har 2 ms tænd og sluk kinetik, og kan spore subthreshold potentielle ændring4. Således, denne genetiske værktøj giver mulighed for et nyt niveau af effektivitet i real-time bioelektrisk overvågning i levende celler. Yderligere forståelse af rollerne som bioelektromagnetisme i embryonale udvikling og mange menneskelige sygdomme, såsom kræft, vil kaste nyt lys over de underliggende mekanismer, som er kritiske for sygdom behandling og forebyggelse.
Zebrafisk har bevist en stærk dyremodel til at studere udviklingsmæssige biologi og humane sygdomme herunder kræft5,6. De deler 70% orthologous gener med mennesker, og de har lignende hvirveldyr biologi7. Zebrafisk giver relativt nem pleje, en stor kobling størrelse af æg, tractable genetik, let transgenese og gennemsigtig eksterne embryonale udvikling, hvilket gør dem en overlegen system til i vivo billeddannelse5,6. Med en stor kilde til mutant fisk linjer allerede er til stede og en fuldt sekventeret genom, vil zebrafisk give en relativt ubegrænset vifte af videnskabelige opdagelser.
For at undersøge den i vivo real-time elektriske aktivitet i cellerne, drage vi fordel af zebrafisk modelsystem og ASAP1. I dette papir, vi beskriver, hvordan at indarbejde zebrafisk genom ved hjælp af Tol2 transposon transgenese fluorescerende spænding biosensor ASAP1 og visualisere cellulære elektriske aktivitet under fosterudviklingen, fisk larve bevægelse, og i levende tumor .
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om de cellulære og væv niveau elektrisk aktiviteter under fosterudviklingen og menneskelig sygdom blev opdaget en lang tid siden, i vivo dynamiske elektriske ændringer og deres biologiske roller er stadig stort set ukendt. En af de største udfordringer er at visualisere og kvantificere de elektriske ændringer. Patch klemme teknologi er et gennembrud for sporing af enkelt celler, men dens anvendelse til hvirveldyr embryoner er begrænset, fordi de er sammensat af mange celler. De nuværende kemiske spæ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningsarbejdet rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Award nummer R35GM124913, Purdue University PI4D incitamentsaflønningsprogram og PVM interne konkurrencedygtige Grundforskning midler programmet. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af de finansiering agenter. Vi takker Koichi Kawakami for Tol2 konstruktionen, Michael Lin for ASAP1 konstruktion, og Leonard Zon for ubi promotor konstruere gennem Addgene.
Materials
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector mm33 rechts | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
