Summary

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Published: April 25, 2018
doi:

Summary

Aquí, mostramos el proceso de crear una línea de pez cebra de reportero de tensión eléctrica celular para visualizar el desarrollo embrionario, movimiento, y las células de tumor de peces en vivo.

Abstract

Bioelectricidad, señalización eléctrica endógena mediada por canales iónicos y bombas situadas en la membrana celular, juega un papel importante en la señalización de los procesos de las células neuronales y musculares excitables y muchos otros procesos biológicos, tales como embrionarias patrones del desarrollo. Sin embargo, es necesario para en vivo monitoreo de la actividad eléctrica en la embriogénesis vertebrados. Los avances de los indicadores de voltaje fluorescente genéticamente codificados (GEVIs) han hecho posible dar una solución para este desafío. Aquí, describimos cómo crear un indicador de voltaje transgénicos pez cebra utilizando el indicador de tensión establecido, ASAP1 (acelerado Sensor de potenciales de acción 1), por ejemplo. El kit de Tol2 y un promotor de pez cebra ubicuo, ubi, fueron escogidos en este estudio. También explicamos los procesos de clonación de puerta de enlace específica, Tol2 pez cebra basada en transposon transgénesis y el proceso de proyección de imagen de incipiente peces peces y embriones los tumores utilizando microscopios regulares epifluorescente. Usando esta línea de peces, encontramos que hay cambios de voltaje eléctrico celular durante la embriogénesis de pez cebra y movimiento de larvas de peces. Además, se observó que en unos tumores de la vaina del nervio periférico maligno de pez cebra, el tumor de células generalmente fueron polarizadas en comparación con los tejidos normales circundantes.

Introduction

Bioelectricidad se refiere a señalización eléctrica endógena mediada por canales iónicos y bombas situadas en la membrana de la célula1. Intercambio iónico a través de la membrana celular y el acoplado cambios actuales y potenciales eléctricos, es esencial para la señalización de los procesos de las células neuronales y musculares excitables. Además, la bioelectricidad y los gradientes de iones tienen una variedad de otras funciones biológicas importantes como almacenamiento de energía, biosíntesis y transporte de metabolitos. Señalización bioeléctrica también fue descubierto como un regulador de la formación embrionaria, como ejes del cuerpo, el ciclo celular y diferenciación de células1. Por lo tanto, es fundamental para la comprensión de muchas enfermedades congénitas humanas que resultan de la mala regulación de este tipo de señalización. Aunque abrazadera del remiendo ha sido ampliamente utilizada para la grabación de las células, está todavía lejos de ser ideal para el control simultáneo de múltiples células durante el desarrollo embrionario en vivo. Además, moléculas pequeñas sensibles de tensión no son también ideales para aplicaciones en vivo debido a su toxicidad, especificidades y sensibilidades.

La creación de una variedad de genéticamente codificado voltaje fluorescente indicadores (GEVIs) ofrece un nuevo mecanismo para resolver este problema y permite la fácil aplicación para el estudio de desarrollo embrionario, a pesar de que originalmente estaban destinados para el control neural células de2,3. Uno de los GEVIs actualmente disponibles es el Sensor acelerado de potenciales de acción 1 (ASAP1)4. Se compone de un lazo extracelular de un dominio de detección de tensión de voltaje sensibles fosfatasa y una proteína fluorescente verde permutada circularmente. Por lo tanto, ASAP1 permite la visualización de los cambios de potencial eléctricos celulares (polarización: verde brillante, despolarización: verde oscuro). ASAP1 tiene 2 ms on y off cinética y puede realizar un seguimiento de cambio potencial subliminal4. Así, esta herramienta genética permite un nuevo nivel de eficacia en bioeléctrica de la supervisión en tiempo real en células vivas. Mayor comprensión de los roles de la bioelectricidad en muchas enfermedades humanas, como el cáncer y el desarrollo embrionario se arroja nueva luz sobre los mecanismos subyacentes, que es fundamental para la prevención y tratamiento de la enfermedad.

Pez cebra se ha demostrado un potente modelo animal para estudiar la biología del desarrollo y enfermedades humanas incluyendo cáncer5,6. Comparten el 70% orthologous genes con los seres humanos, y tienen Biología vertebrado similar7. Pez cebra proporcionan cuidado relativamente fácil, un tamaño grande de huevos, manejable genética, transgénesis fácil y desarrollo embrionario externo transparente, que las hacen un sistema superior en vivo imagen5,6. Con una fuente grande de líneas de peces mutantes ya presentes y un genoma completamente secuenciado, pez cebra ofrecerá una gama relativamente ilimitada de los descubrimientos científicos.

Para investigar la en vivo en tiempo real actividad eléctrica de las células, aprovechamos el sistema de modelo de pez cebra y ASAP1. En este papel, describimos cómo incorporar el biosensor fluorescente tensión ASAP1 en el genoma del pez cebra con Tol2 transposon transgénesis y visualizar actividad eléctrica celular durante el desarrollo embrionario, larval de peces movimiento y el tumor vivo .

Protocol

El pez cebra se encuentran en un centro de animales aprobados por AAALAC, y todos los experimentos se llevaron a cabo según los protocolos aprobados por el cuidado de animales de Purdue y uso Comité (PACUC). 1. Tol2 Transposon plásmido construcción preparación Nota: Tol2, un transposón que fue descubierto en los peces medaka, ha sido ampliamente utilizado en el pez cebra investigación comunidad8,9. Ha s…

Representative Results

En una inyección exitosa, más que embriones de pescado 50% inyectado mostrará cierta fluorescencia verde en las células somáticas, y la mayoría de ellos será positiva por análisis de impuestos sobre el consumo de transposon de Tol2 (figura 2). Después de 2-4 generaciones de hacia fuera-Cruz con peces de tipo salvaje (hasta que los peces fluorescentes alcanzan 50%, la proporción mendeliana esperada), los peces transgénicos se utilizaron para el expe…

Discussion

Aunque las actividades eléctricas nivel celular y tejidos durante el desarrollo embrionario y la enfermedad humana fueron descubiertas hace mucho tiempo, los en vivo eléctrica cambios dinámicos y sus papeles biológicos siguen siendo en gran parte desconocidos. Uno de los mayores retos es visualizar y cuantificar los cambios eléctricos. Tecnología de abrazadera del remiendo es una brecha para el seguimiento de las células, pero su aplicación en embriones vertebrados es limitada porque se componen de mucha…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo de investigación en esta publicación fue apoyado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número R35GM124913, programa de incentivos de la Universidad de Purdue PI4D y PVM interno competitivo Programa de fondos de investigación básica. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los agentes de financiación. Agradecemos a Koichi Kawakami para la construcción de Tol2, Michael Lin para la construcción de ASAP1, y Leonard Zon para el promotor ubi construir a través de Addgene.

Materials

14mL cell culture tubes VWR 60818-725 E.Coli culture
Agarose electrophoresis tank Thermo Scientific Owl B2 DNA eletrophoresis
Agarose RA Amresco N605-500G For making the injection gels
Attb1-ASAP1-F primer IDT DNA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA ASAP1 coding region amplification for subcloning
Attb2-ASAP1-R primer IDT DNA GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA ASAP1 coding region amplification for subcloning
Bright field dissection scope Nikon SMZ 745 Dechorionation, microinjection, mounting
Color camera Zeiss AxioCam MRc Fish embryo image recording
Concave slide VWR 48336-001 For holding fish embryos during imaging process
Disposable transfer pipette 3.4 ml Thermo Scientific 13-711-9AM Fish embryos and water transfer
Endonuclease enzyme, Not I NEB R0189L For linearizing plasmid DNA
Epifuorescent compound scope Zeiss Axio Imager.A2 Fish embryo imaging
Epifuorescent stereo dissection scope Zeiss Stereo Discovery.V12 Fish embryo imaging
Fluorescent light source Lumen dynamics X-cite seris 120 Light source for fluorescence microscopes
Forceps #5 WPI 500342 Dechorionation and needle breaking
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Scientific 11789020 Gateway BP recombination cloning
Gateway LR Clonase II Plus enzyme Thermo Scientific 12538120 Gateway LR recombination cloning
Gel DNA Recovery Kit Zymo Research D4002 DNA gel purification
Loading tip Eppendorf 930001007 For loading injection solution into capilary needles
Methylcellulose (1600cPs) Alfa Aesar 43146 Fish embryo mounting
Methylene blue Sigma-Aldrich M9140 Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes
Microinjection mold Adaptive Science Tools TU-1 To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection
Microinjector WPI Pneumatic Picopump PV820 Microinjection injector
Micro-manipulator WPI Microinjector mm33 rechts Microinjection operation
Micropipette puller Sutter instrument P-1000 For preparing capillary needle
Mineral oil Amresco J217-500ml For calibrating injection volume
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Thermo Scientific AM1340 mRNA in vitro transcription
Monocolor camera Zeiss AxioCam MRm Fish embryo image recording
Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4020 Prepare small amount of plasmid DNA
Plastic Petri dishes VWR 25384-088 For holding fish or fish embryos during imaging process
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015 mRNA cleaning after in vitro transcription
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000 For measuring DNA and RNA concentrations
Stage Micrometer Am Scope MR100 Microinjection volume calibration
Thermocycler Bio-Rad T100 DNA amplification for gene cloning
Thin wall glass capillaries WPI TW100F-4 Raw glass for making cappilary needle
Tol2-exL1 primer IDT DNA GCACAACACCAGAAATGCCCTC Tol2 excise assay
Tol2-exR primer IDT DNA ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG Tol2 excise assay
TOP10 Chemically Competent E. coli Thermo Scientific C404006 Used for transformation during gene cloning
Tricaine mesylate Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing fish or fish embryos
UV trans-illuminator 302nm UVP M-20V DNA visualization
Water bath Thermo Scientific 2853 For transformation process of gene cloning

References

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Cite This Article
Silic, M. R., Zhang, G. Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors. J. Vis. Exp. (134), e57330, doi:10.3791/57330 (2018).

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