Vi beskriver bruken av optogenetics og elektrofysiologiske innspillinger for selektiv manipulasjoner av hippocampus theta svingninger (5-10 Hz) i oppfører mus. Effekten av rytme entrainment overvåkes ved hjelp av lokale feltet potensial. En kombinasjon av opto- og farmakogenetiske hemming adresser er efferent avlesning hippocampus synkronisering.
Omfattende data om forholdet mellom nettverk svingninger virkemåten og organisering av neuronal utslipp i hjernen regioner krever nye verktøy for å selektivt manipulere hjernen rytmer. Her beskriver vi tilnærming kombinere projeksjon spesifikke optogenetics med ekstracellulære elektrofysiologi for Hi-Fi-kontroll av hippocampus theta svingninger (5-10 Hz) i oppfører mus. Spesifisiteten av optogenetic entrainment oppnås ved målretting channelrhodopsin-2 (ChR2) til GABAergic befolkningen i mediale septal celler, avgjørende involvert i generasjon hippocampus theta svingninger, og en lokal synkronisert aktivisering av et delsett av hemmende septal afferente prefiks. Effekten av optogenetic rytmen kontrollen er bekreftet av en samtidige overvåking av lokale feltet potensielle (LFP) over lamina av området CA1 og/eller neuronal utslipp. Bruke dette lett iverksettes preparatet viser vi effekten av ulike optogenetic stimulering protokoller for induksjon av theta svingninger og manipulering av frekvens og regularitet. Til slutt, en kombinasjon av theta rytmen kontrollen med projeksjon-spesifikk hemming adresser er avlesning av bestemte aspekter av hippocampus synkroniseringen av efferent regioner.
Neuronal aktivitet i pattedyr koordineres av nettverket svingninger, som hjelper overføring av informasjon i og mellom hjernen regioner1,2,3,4. Hjernen rytmer inkluderer svingninger fra veldig treg ( 200 Hz) frekvensene. En stor mengde bevis støtter involvering av nettverket svingninger i ulike hjernefunksjoner, inkludert kognisjon5,6,7,8,9,10 , medfødte atferd11,12 samt nevropsykiatriske lidelser som Parkinsons sykdom og epilepsi13,14,15. Selektiv og timelig presise metoder eksperimentelle manipulering av nettverket svingninger er derfor viktig for utviklingen av fysiologisk plausibel modeller av synkronisering og etablere årsakssammenhenger med atferd.
Nettverksynkronisering er formidlet av ulike biologiske substratene og prosesser, spenner fra molekylær identiteten til ionekanaler og deres kinetics neuromodulation excitability og nettverkstilkobling. Biologiske utformingen av rytme generatorer16 har blitt avslørt for mange hjernen rytmer, forskjellige aspekter av hvilke (f.eks, frekvens, amplitude) er ofte forårsaket av dynamikken i forskjellige celletyper og nettverk. For eksempel er hemmende interneurons målretting somata viktigste celler de viktigste aktørene over frekvensbånd og hjernen regioner17,18, inkludert theta19,20, gamma20 , 21og rippel (140-200 Hz)22 svingninger. I sin tur er fase synkronisering av fjerne celler sikret av robust feed-forward signalering pyramideformet celler, som tilbakestiller avfyring av interneurons. En viktig parameter av svingninger, størrelsen på synkroniserte neuronal befolkningen, er nært knyttet til målt LFP oscillation’s amplitude og minst rask svingninger, avhenger eksitatoriske stasjonen på interneurons2. I kontrast, tregere svingninger, som delta og theta rytmer, genereres av langtrekkende innkommende looper, dannet av cortico-thalamic23,24 og hippocampus mediale septal anslag25, 26,27, henholdsvis. Svingninger i slike kretser er forårsaket av interaksjoner av signalet overføring forsinkelser, nervøs svar og deres frekvens preferanse i deltakende celler28,29,30, 31 , 32. hemmende anslag fra GABAergic parvalbumin (PV)-positive celler av den mediale septum (MS) til interneurons i hippocampus25,33, parahippocampal regioner og entorhinal cortex26 viktig for generering av theta svingninger i den mediale tinninglappen. Dermed kan fysiologiske mekanismene nettverk svingninger og neuronal synkronisering manipuleres med optogenetics med en real-time presisjon.
Celle type-spesifikk optogenetic manipulasjoner er brukt for studier av hippocampus og kortikale svingninger i vitro34,35,36,37,38 og i vivo30,39,40,41,42,43,44,45, inkludert funksjonelle undersøkelser av gamma5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52 og rippel svingninger40,53,54 og søvn spindler55,56. Nylig uttrykte vi grobunn-avhengige ChR2 virus i MS, et viktig område for generering av hippocampus theta rytme, PV-grobunn mus. Bruker dette preparatet, var funksjonene i hippocampus theta svingninger (hyppighet og tidsmessige stabilitet) kontrollert av optogenetic stimulering av hemmende anslag av MS i hippocampus11. Videre fremkalt theta-frekvens optogenetic stimulering av hemmende septo-hippocampus anslag theta rytme under våken ubevegelighet. Optogenetically entrained theta rytme vises egenskapene til spontan theta svingninger i musen LFP og neuronal aktivitetsnivå.
Nøkkel vise egenskaper av denne protokollen inkludere: (1) utnyttelse av en hemmende sti som er fysiologisk kritisk for spontane theta svingninger og unngå uspesifikke effekter på hippocampus excitability; (2) axonal, dvs, projeksjon spesifikke stimulering å minimere en direkte påvirkning på ikke-hippocampus MS efferents; (3) lokale theta-rytmiske lys stimulering, sikrer en minimal direkte innblanding theta-rytmiske septo-hippocampus dynamikk og en global bilaterale entrainment av theta svingninger; (4) parametrisk kontroll av theta svingninger frekvens og regularitet; og (5) kvantifisering av entrainment gjengivelse med timelige høyoppløselig bruker LFP aktivere kvantitative kausalitet analyse i oppføre dyr. Siden dette preparatet egentlig kapitaliserer på en velkjent rollen septo-hippocampus disinhibition i theta generasjon25,30, kan robust kontroll over flere parametere av theta svingninger i oppfører mus. Studier hvor andre mindre undersøkte stier og celletyper av septo-hippocampus kretsene ble manipulert38,,39,,47,,49,,50,,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 avsløre ytterligere mekanismer for theta rytmen.
Her presentert vi en allment tilgjengelig metode entrain og framprovosere hippocampus theta svingninger i oppfører dyr. Denne tilnærmingen kan være nyttig for studier av theta rytme funksjoner i informasjonsbehandling og atferd. Viktige sider ved denne metoden inkluderer: (1) valg av opsin og målretting av ChR2 til axons av MS celler i hippocampus, (2) robuste optisk og elektriske funksjoner av implantert optisk fiber-wire matrise samlinger å sikre kontinuerlig stimulering og LFP opptak i oppfører seg mus, (3) bruk…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Maria Gorbati etter eksperthjelp med dataanalyse og Jennifer Kupferman for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Exc 257 NeuroCure, TK og AP; Prioritet programmet 1665, 1799/1-1(2), Heisenberg program, 1799/2-1, AP), tysk-israelske grunnlaget for forskning og utvikling (GIF; Jeg-1326-421.13/2015, TK) og menneskelige grensen Science programmet (HFSP; RGY0076/2012, TK).
PV-Cre mice | The Jackson Laboratory | B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgery | |||
Stereotaxis | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | Model 963 | Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Drill bits, 0.8 mm | Bijoutil, Allschwil, Switzerland | 49080HM | |
0.01-1 ml syringe | Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | |
Sterican cannulas | Braun | 26 G, 0.45×25 mm BL/LB | |
Fine and sharp scissors | Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canada | 14060-09 | |
Forceps | Fine Science Tools Inc. | 11210-10 | Dumont AA – Epoxy Coated Forceps |
Blunt stainless steel scissors | Fine Science Tools Inc. | 14018-14 | |
Soldering station | Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany | WSD 81 | |
Erythromycin | Rotexmedica GmbH, Trittau, Germany | PZN: 10823932 | 1g Powder for Solution for Infusion |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Optogenetics | |||
Hamilton pump | PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | model 703008 | PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism |
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gauge | PHD Ultra, Harvard Apparatus | Model 75 RN SYR | |
Hamilton 5 µL Plunger | PHD Ultra, Harvard Apparatus | Model 75 RN SYR | |
Tubing | Fisher Scientific, Pittsburgh, USA | PE 20 | Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043") |
Sterican cannulas | Braun, Melsungen, Germany | 27 G, 25×0.40 mm, blunt | |
Precision drill/grinder | Proxxon, Wecker, Luxemburg | fbs 240/e | |
Cutting disks | Proxxon | NO 28812 | |
Cre dependent channelrhodopsin | Penn Vector Core, Philadelphia, PA, USA | AV-1-18917P | Contruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42×1013 vg/ml |
Cam kinase dependent halorhodopsin | Penn Vector Core | AV-1-26971P | Construct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml |
Multimode optic fiber | ThorLabs, Dachau, Germany | FG105LCA | 0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 – 2400 nm |
Ceramic stick ferrule | Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA | CFLC126 | Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um |
Polishing paper | Thorlabs | LF3D | 6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet |
Power meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD |
Multimode fiber optic coupler | Thorlabs | FCMM50-50A-FC | 1×2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC |
Fiberoptic patch cord | Thorlabs | FG105LCA CUSTOM-MUC | custom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule |
Sleeve | Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA | ADAL1 | Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules |
473 nm DPSS laser | Laserglow Technologies, Toronto, ON, Canada | R471005FX | LRS-0473 Series |
593 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | R591005FX | LRS-0594 Series |
MC_Stimulus II | Multichannel Systems, Reutlingen, Germany | STG 4004 | |
Impedance conditioning module | Neural microTargeting worldwide, Bowdoin, USA | ICM | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Electrophysiology | |||
Tungsten wires | California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USA | CFW0010954 | 40 µm, 99.95% |
Capillary tubing | Optronics | 1068150020 | ID: 100.4 µm |
Omnetics nanoconnector | Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, USA | A79038-001 | |
Screws | Bilaney, Düsseldorf, Germany | 00-96×1/16 | stainless-steel |
Silicone probe | NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USA | B32 | |
Headstage | Neuralynx, Bozeman, Montana USA | HS-8 | miniature headstage unity gain preamplifiers |
Silver conductive paint | Conrad electronics, Germany | 530042 | |
Liquid flux | Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germany | Lötöl ST | DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11) |
LED | Neuralynx | HS-LED-Red-omni-10V | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | ||
MC_Stimulus software | Multichannel, Systems | ||
Neurophysiological Data Manager | NDManager, http://neurosuite.sourceforge.net | ||
Klusters | http://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006 | ||
Software of the recording system | Neuralynx | Cheetah | https://neuralynx.com/software/cheetah |
Multi-channel data analysis software | Cambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GB | Spike2 |