Vi beskriver användningen av optogenetik och elektrofysiologiska inspelningar för selektiv manipulationer av hippocampus theta svängningar (5-10 Hz) i beter sig möss. Effekten av den rytm övningsprovet kontrolleras med hjälp av lokala fältet potential. En kombination av opto- och farmakogenetiska hämning adresser den efferent avläsningen av hippocampus synkronisering.
Omfattande uppgifter om relationer av neurala nätverk svängningar till beteende och organisationen av neuronala urladdning i hjärnregioner kräver nya verktyg att selektivt manipulera hjärnan rytmer. Här beskriver vi en strategi som kombinerar projektion-specifika optogenetik med extracellulära elektrofysiologi för HiFi-kontroll av hippocampus theta svängningar (5-10 Hz) i beter sig möss. Specificiteten för den optogenetic övningsprovet uppnås genom att rikta channelrhodopsin-2 (ChR2) till GABAergic befolkningen av mediala septal celler, avgörande involverade i generation av hippocampus theta svängningar, och en lokal synkroniseras aktivering av en delmängd av hämmande septal afferenter i hippocampus. Effekten av optogenetic rytm kontrollen verifieras av en samtidig övervakning av lokala fältet potentiella (LFP) över lamina av området CA1 eller neuronala ansvarsfrihet. Med denna lätt genomförbara förberedelse visar vi effekten av olika optogenetic stimulering protokoll för induktion av theta svängningar och manipulering av deras frekvens och regelbundenhet. Slutligen, en kombination av theta rytm kontrollen med projektion-specifika hämning adresser avläsningen av särskilda aspekter av hippocampus synkroniseringen av efferent regioner.
Neuronal aktivitet i däggdjur samordnas av nätverket svängningar, som biträder informationsöverföring inom och mellan hjärnan regioner1,2,3,4. Hjärnans rytmer inkluderar svängningar alltifrån mycket långsam ( 200 Hz) frekvenser. En stor mängd bevis stöder medverkan av nätverket svängningar i olika hjärnfunktioner, inklusive kognition5,6,7,8,9,10 , medfödda beteenden11,12 samt neuropsykiatriska sjukdomar såsom Parkinsons sjukdom, epilepsi13,14,15. Selektiv och temporally precisa metoder för experimentell manipulation av nätverket svängningar är därför viktiga för utvecklingen av fysiologiskt rimliga modeller av synkronisering och för att fastställa orsakssamband med beteende.
Nätverk synkronisering medieras av olika biologiskt substrat och processer, alltifrån molekylär identitet av jonkanaler och deras kinetik till neuromodulation retbarhet och nätverksanslutning. Biologiska utformningen av rytm generatorer16 har avslöjats för många hjärnan rytmer, skilda aspekter av som (t.ex., frekvens, amplitud) är ofta till följd av dynamiken i olika celltyper och nätverk. Exempelvis är hämmande interneuroner inriktning i somata av huvudsakliga celler de viktigaste aktörerna över frekvensband och hjärnan regioner17,18, inklusive theta19,20, gamma20 , 21och rippel (140-200 Hz)22 svängningar. I sin tur säkerställs fas synkronisering av avlägsna celler genom robust feed-forward signalering av pyramidala celler, som återställer bränning av interneuroner. En avgörande parameter för svängningar, storleken på synkroniserade neuronala befolkningen, är nära besläktad med den uppmätta LFP svängningens amplitud och, åtminstone för snabba svängningar, beror på den excitatoriska enheten på interneuroner2. Däremot långsammare svängningar, som delta och theta rytmer, genereras av långväga reentrant loopar, bildas av cortico-thalamic23,24 och Hippocampus-mediala septal prognoser25, 26,27, respektive. Svängningar i sådana kretsar är följd av interaktioner av signalen förökning förseningar, hetsiga svaren och deras frekvens preferens i deltagande celler28,29,30, 31 , 32. hämmande prognoser från GABAergic parvalbumin (PV)-positiva celler av mediala septum (MS) till interneuroner i hippocampus25,33, parahippocampal regioner och entorhinal cortex26 är väsentliga för generering av theta svängningar i den mediala temporalloben. Således, fysiologiska mekanismer av nätverket svängningar och neuronala synkronisering kan manipuleras med optogenetik med en realtid precision.
Cell typspecifika optogenetic manipulationer har tillämpats för studier av hippocampus och kortikala svängningar i vitro34,35,36,37,38 och invivo30,39,40,41,42,43,44,45, inklusive funktionella utredningar av gamma5,12,36,46,47,48,49,50, 51,52 och rippel svängningar40,53,54 och sömn spindlar55,56. Nyligen uttryckte vi ett Cre-beroende ChR2 virus i MS, en nyckelregion för generering av hippocampus theta rytmen, PV-Cre möss. Använder detta preparat, kontrollerades dragen av hippocampus theta svängningarna (frekvens och tidsmässiga stabilitet) av optogenetic stimulering av hämmande prognoser av MS i hippocampus11. Dessutom frammanade theta frekvens optogenetic stimulering av hämmande septo-Hippocampus prognoser theta rytm under vaken orörlighet. Optogenetically fångas upp theta rytm visas egenskaperna för spontana theta svängningar i musen på LFP och neuronal aktivitetsnivå.
Viktiga funktioner i detta protokoll: (1) utnyttjande av ett hämmande väg som är fysiologiskt kritiska för spontana theta svängningar samtidigt undvika ospecifika effekter på Hippocampus retbarhet; (2) axonal, dvs, projektion-specifika stimulering att minimera en direkt påverkan på icke-Hippocampus MS efferents; (3) lokala theta-rytmiska ljus stimulans, säkerställer en minimal direkt inblandning med theta-rytmiska septo-Hippocampus dynamik och en global bilaterala övningsprovet av theta svängningar; (4) parametrisk kontroll av theta svängningar frekvens och korrekthet. och (5) kvantifiering av övningsprovet trohet med hög temporal upplösning använder LFP för att möjliggöra kvantitativa kausalitet analys i beter sig djur. Eftersom denna beredning i huvudsak kapitaliserar på en välkänd roll av den septo-Hippocampus avhämning i theta generation25,30, gör det robust kontroll över flera parametrar av theta svängningar i beter sig möss. Studier där andra mindre undersökta spridningsvägar och celltyper av septo-Hippocampus kretsen var manipulerade38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 avslöja ytterligare mekanismer av theta rytmen.
Här presenterade vi en lättillgänglig metod för att stiga på tåg och framkalla Hippocampus theta svängningar i beter sig djuret. Detta tillvägagångssätt kan vara användbar för studier av theta rytms funktioner i informationsbehandling och beteende. Kritiska aspekter av denna metod inkluderar: (1) val av opsin och inriktning av ChR2 axoner av MS celler i hippocampus, (2) robusta optiska och elektriska funktioner av implanterade optic fiber-tråd matris församlingar att säkerställa kontinuerlig stimulering o…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Maria Gorbati för experthjälp med dataanalys och Jennifer Kupferman för synpunkter på manuskriptet. Detta arbete stöds av Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG; EXC 257 NeuroCure, TK och AP; Prioriterade Program 1665, 1799/1-1(2), Heisenberg programmet, 1799/2-1, AP), Tysk-israeliska grunden för vetenskaplig forskning och utveckling (GIF; Jag-1326-421.13/2015, TK) och Human Frontier Science-programmet (HFSP; RGY0076/2012, TK).
PV-Cre mice | The Jackson Laboratory | B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgery | |||
Stereotaxis | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | Model 963 | Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Drill bits, 0.8 mm | Bijoutil, Allschwil, Switzerland | 49080HM | |
0.01-1 ml syringe | Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | |
Sterican cannulas | Braun | 26 G, 0.45×25 mm BL/LB | |
Fine and sharp scissors | Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canada | 14060-09 | |
Forceps | Fine Science Tools Inc. | 11210-10 | Dumont AA – Epoxy Coated Forceps |
Blunt stainless steel scissors | Fine Science Tools Inc. | 14018-14 | |
Soldering station | Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany | WSD 81 | |
Erythromycin | Rotexmedica GmbH, Trittau, Germany | PZN: 10823932 | 1g Powder for Solution for Infusion |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Optogenetics | |||
Hamilton pump | PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | model 703008 | PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism |
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gauge | PHD Ultra, Harvard Apparatus | Model 75 RN SYR | |
Hamilton 5 µL Plunger | PHD Ultra, Harvard Apparatus | Model 75 RN SYR | |
Tubing | Fisher Scientific, Pittsburgh, USA | PE 20 | Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043") |
Sterican cannulas | Braun, Melsungen, Germany | 27 G, 25×0.40 mm, blunt | |
Precision drill/grinder | Proxxon, Wecker, Luxemburg | fbs 240/e | |
Cutting disks | Proxxon | NO 28812 | |
Cre dependent channelrhodopsin | Penn Vector Core, Philadelphia, PA, USA | AV-1-18917P | Contruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42×1013 vg/ml |
Cam kinase dependent halorhodopsin | Penn Vector Core | AV-1-26971P | Construct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml |
Multimode optic fiber | ThorLabs, Dachau, Germany | FG105LCA | 0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 – 2400 nm |
Ceramic stick ferrule | Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA | CFLC126 | Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um |
Polishing paper | Thorlabs | LF3D | 6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet |
Power meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD |
Multimode fiber optic coupler | Thorlabs | FCMM50-50A-FC | 1×2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC |
Fiberoptic patch cord | Thorlabs | FG105LCA CUSTOM-MUC | custom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule |
Sleeve | Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA | ADAL1 | Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules |
473 nm DPSS laser | Laserglow Technologies, Toronto, ON, Canada | R471005FX | LRS-0473 Series |
593 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | R591005FX | LRS-0594 Series |
MC_Stimulus II | Multichannel Systems, Reutlingen, Germany | STG 4004 | |
Impedance conditioning module | Neural microTargeting worldwide, Bowdoin, USA | ICM | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Electrophysiology | |||
Tungsten wires | California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USA | CFW0010954 | 40 µm, 99.95% |
Capillary tubing | Optronics | 1068150020 | ID: 100.4 µm |
Omnetics nanoconnector | Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, USA | A79038-001 | |
Screws | Bilaney, Düsseldorf, Germany | 00-96×1/16 | stainless-steel |
Silicone probe | NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USA | B32 | |
Headstage | Neuralynx, Bozeman, Montana USA | HS-8 | miniature headstage unity gain preamplifiers |
Silver conductive paint | Conrad electronics, Germany | 530042 | |
Liquid flux | Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germany | Lötöl ST | DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11) |
LED | Neuralynx | HS-LED-Red-omni-10V | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | ||
MC_Stimulus software | Multichannel, Systems | ||
Neurophysiological Data Manager | NDManager, http://neurosuite.sourceforge.net | ||
Klusters | http://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006 | ||
Software of the recording system | Neuralynx | Cheetah | https://neuralynx.com/software/cheetah |
Multi-channel data analysis software | Cambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GB | Spike2 |