Hög känslighet detektion av Micrometastases genereras av GFP Lentivirus-sensorik Organoids odlade från en patientderiverade kolon tumör
Summary
För att möjliggöra mycket känslig detektion av sprida mänskliga kolorektal cancer (CRC) celler kolonisera vävnader, visar vi häri ett protokoll för effektiv transduktion av grönt fluorescerande protein (GFP) lentiviral partiklar i PDX-derived CRC organoid celler före sin injektion i mottagarens möss, med stereo-fluorescens mikroskopisk observation.
Abstract
Trots nuvarande framsteg inom behandling av mänskliga kolorektal cancer (CRC) är några radikala behandlingar effektiva för sena stadier av CRC. För att övervinna detta kliniska utmaningen, tumör xenograft musmodeller med väletablerade mänskliga cancer cellinjer och många transgena musmodeller med tumörer har utvecklats som prekliniska modeller. De efterliknar delvis funktionerna i mänskliga carcinom, men misslyckas ofta med att sammanfatta de viktigaste aspekterna av mänsklig maligniteter inklusive invasion och metastasering. Således, alternativa modeller som bättre representerar den malign progressionen i mänskliga CRC har varit efterlängtade.
Vi visar häri generation av patientderiverade tumör xenograft (PDXs) av subkutan implantation av små CRC fragment kirurgiskt dissekeras från en patient. Kolon PDXs utveckla och histopatologiskt likna CRC hos patienten. Men är några spontana micrometastases detekterbara i konventionella tvärsnitt av påverkade avlägsna organ i PDX-modellen. För att underlätta upptäckt av metastatisk spridning till avlägsna organ, vi extraherade organoid tumörcellerna från de kolon PDXs i kultur och smittade dem med GFP lentivirus före injektion i starkt nedsatt immunförsvar nicka/Shi-scid IL2Rγnull (NOG) möss. Orthotopically injiceras PDX-derived CRC organoid celler konsekvent form primära tumörer positivt för god Jordbrukarsed i mottagarens möss. Dessutom utvecklar spontant micrometastatic kolonier uttrycker GFP upptäcks särskilt i lungorna hos dessa möss genom fluorescensmikroskopi. Dessutom producerar intrasplenic injektion av CRC organoids ofta nedsatt colonization. Sammantaget tyder dessa fynd GFP-märkta PDX-derived CRC organoid celler att upptäckas visuellt under en process kallas invasion-metastaser kaskad. Beskrivna protokollen omfattar upprättandet av PDXs på mänskliga CRC och 3D kultur av motsvarande CRC organoid celler sensorik av GFP lentiviral partiklar.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) är den näst vanligaste orsaken till cancer dödsfall världen över1. Den otillräckligt svaren på konventionell behandling av patienter med framskriden sjukdom visar hur ineffektiva försök att radikalt bota CRC. För att utveckla mer effektiva behandlingsmetoder, har olika prekliniska musmodeller av cancer som efterliknar det som kännetecknen CRC fastställts. Olika CRC cellinjer har använts att generera tumör xenograft på grund av sin bekvämlighet och enkelhet av manipulation. Långtidsodling av cancer cellinjer, som dock ofta orsakar urval av unika cellpopulationer som är ganska proliferativ under en viss kultur tillstånd, vilket resulterar i opålitliga utfall och avgörande begränsningar i prekliniska drog utveckling.
Utan att vara odlade i vitro, har patientderiverade tumör xenograft (PDXs) också genererats genom implantering i djurmodeller av mänskliga CRC vävnader kirurgiskt dissekeras från patienter2,3,4. PDXs är allmänt erkänd som går igenom de viktigaste histopatologiska funktionerna och genetiska förändringar finns ursprungligen i tumörer av patienterna från vilken de härrör. Dessutom består patientderiverade tumör organoids av tumör cell kluster fastställdes genom kultur 3D villkor som nära härmade biologiska egenskaper för den ursprungliga tumörer5,6. Dessa tumör organoids tillämpades även på hög genomströmning drogkontroll, vilket gör att anpassade behandlingar vara utformade5. Dock markant heterogena CRC populationer antas vara närvarande inom en tumör massa. Viss CRC populationer kan selektivt föröka sig och expandera under in vivo och in vitro- serien av passager av PDX och tumör organoids, respektive. Detta kan också den övergripande gen uttryck profiler och epi/genetiska status för drabbade CRC ändra, vilket resulterar i minimal likhet med föräldrarnas CRC.
Patientderiverade CRC organoids och de extraherade från noncancerous mänskliga colon konstruerad till hamnen kombinationer av onkogena mutationer har också använts för att undersöka kännetecken för mänskliga tumörceller som exemplifieras av tumör invasionen och metastas 6,7,8,9. Dock har den mycket låga förekomsten av spontana metastaser uppkommer ortotop implantation av patientderiverade CRC i nedsatt immunförsvar möss, gjort det svårt att studera utgångsämnet processen i invasion-metastaser kaskad som inkluderar lokala invasion, intravasation, transport i blodomloppet, extravasering och koloniseringen av avlägsna organ4,10. Micrometastasis som representeras av tumör cell nedfall av ≤2 mm, bildas av patientderiverade CRC organoids, har ofta förbisetts på histopatologisk analys av sektioner från påverkade avlägsna organ i experimentell musmodeller. Visualisering av spontana micrometastases har också varit minimal i vivo på grund av svårigheten att effektivt införa fluorescerande markörer i tumörceller organoid före deras injektion i mottagarens möss. I denna studie utvecklade vi ett protokoll att effektivt transduce GFP lentivirus i PDX-derived CRC organoid celler i 3D kultur före injektion i mottagarens möss och tillåta mycket känslig detektion, anställa stereo-fluorescensmikroskopi, av deras koloniseringen av olika organ till formuläret micrometastases.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om den CRC PDX-modellen har varit allmänt anställd att studera primär tumörtillväxt, om denna modell är också tillämpliga på utreda tumör metastaser har inte ännu helt klarlagd. Spontan metastaser var också knappt detekterbara i lever och lungor av olika rapporterade kolon PDX modeller4,10. För att upptäcka micrometastases med hög känslighet, utvecklade vi ett protokoll för transducing GFP lentiviral partiklar i PDX-derived CRC organoids f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av den Juntendo universitet Young Investigator Award (2013, 2014 och 2015) till Y.O., gemensamma projekt tilldelningen (2013 och 2014) till K. M. och beviljar i-stöd för vetenskaplig forskning från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och Teknik, Japan (16K 15625 till Y. K. och 16K 15598 att M.G.). Vi är särskilt tacksamma till alla medlemmar av inst. för Coloproctological kirurgi och molekylär patologi för användbar diskussioner och teknisk support. Vi tackar också Dr Hiroyuki Konno (Hamamatsu universitet Schoolof läkemedel) och Dr. Hideki Kitajima (internationella universitet för hälsa och välfärd) för generösa teknisk vägledning i de kirurgiska ingrepp för ortotop implantering i möss och Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) för teknisk rådgivning om utför tumör organoid kulturen.
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O’Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
