Om zeer gevoelige detectie van de verspreiden menselijke colorectaal carcinoom (CRC) cellen koloniseren van weefsels, tonen we hierin een protocol voor efficiënte transductie van groen fluorescent proteïne (GFP) lentivirale deeltjes in PDX-afgeleide CRC organoid cellen voorafgaand aan hun injectie in ontvangende muizen, met stereo-fluorescentie microscopische observatie.
Ondanks de huidige vooruitgang in de behandeling van menselijke colorectal kanker (CRC) zijn paar radicale therapieën effectief voor de late stadia van CRC. Te overwinnen deze klinische uitdaging, tumor xenograft Muismodellen met behulp van reeds lang gevestigde cellijnen van menselijke carcinoom en vele transgene muismodellen met tumoren zijn ontwikkeld als preklinische modellen. Ze gedeeltelijk na te bootsen de kenmerken van menselijke carcinomen, maar vaak niet de belangrijkste aspecten van menselijke maligniteiten waaronder invasie en metastase recapituleren. Alternatieve modellen die beter de kwaadaardige progressie in menselijke CRC vertegenwoordigen hebben zo lang gewacht.
Hierin laten we generatie van patiënt-afgeleide tumor xenografts (PDXs) door onderhuidse implantatie van kleine CRC fragmenten operatief ontleed van een patiënt. De dikke darm-PDXs ontwikkelen en histopathologically lijken op de CRC in de patiënt. Echter, een paar spontane micrometastasen aantoonbaar in conventionele dwarsdoorsneden van aangetaste verre organen in het PDX-model. Ter vergemakkelijking van de opsporing van metastatische verspreiding in verre organen, we gewonnen van de tumorcellen organoid uit de PDXs van de dikke darm in cultuur en besmet ze met GFP lentivirus vóór injectie in zeer immunodeficiëntie knik/Shi-scid IL2Rγnull (NOG) muizen. Orthotopically geïnjecteerd PDX-afgeleide CRC organoid cellen consequent formulier primaire tumoren positief voor GFP in ontvangende muizen. Bovendien ontwikkelen spontaan micrometastatic kolonies GFP uitdrukken met name in de longen van deze muizen met fluorescentie microscopie worden gesignaleerd. Intrasplenic injectie van CRC organoids produceert bovendien vaak hepatische kolonisatie. Samen genomen, deze bevindingen wijzen erop GFP-gelabelde PDX-afgeleide CRC organoid cellen zijn visueel detecteerbaar een meerstaps tijdens de invasie-metastase cascade genoemd. De beschreven protocollen omvatten de oprichting van PDXs van menselijke CRC en 3D cultuur van de corresponderende CRC organoid cellen getransduceerde door GFP lentivirale deeltjes.
Colorectal kanker (CRC) is de tweede belangrijkste oorzaak van kanker doden wereldwijd1. De ontoereikende reactie op conventionele therapieën voor patiënten met de ziekte gevorderd stadium geeft aan de ondoeltreffendheid van de pogingen om de CRC’s radicaal te genezen. Ontwikkeling van meer effectieve therapeutische benaderingen, zijn verschillende preklinische Muismodellen van kanker die de kenmerken van de CRC’s na te bootsen vastgesteld. Verschillende CRC cellijnen zijn wijd gebruikt voor het genereren van tumor xenografts als gevolg van hun gebruiksgemak en manipulatie. Langetermijnkweek van kanker cellijnen, veroorzaakt echter vaak selectie van unieke cel populaties die heel proliferatieve onder de voorwaarde van een bepaalde cultuur, daardoor resulterend in onbetrouwbare resultaten en cruciale beperkingen in preklinische drug ontwikkeling.
Zonder gekweekt in vitro, zijn patiënt-afgeleide tumor xenografts (PDXs) ook gegenereerd door implantatie in diermodellen van menselijke CRC weefsels die operatief ontleed van patiënten2,3,4. PDXs op brede schaal erkend als de belangrijkste histopathologische kenmerken Recapitulerend en genetische wijzigingen oorspronkelijk in tumoren van de patiënten waarvan ze zijn afgeleid. Bovendien, patiënt-afgeleide tumor organoids samengesteld van tumor cel clusters werden opgericht door cultuur onder 3D omstandigheden dat nauw deed de biologische eigenschappen van de originele tumoren5,6. Deze tumor organoids werden ook toegepast voor high-throughput drug screening, waardoor gepersonaliseerde therapieën ontworpen5. Echter sterk heterogene CRC populaties wordt verondersteld dat zijn aanwezig in een tumor massa. Bijzondere CRC populaties kunnen selectief vermenigvuldigen en uit te breiden tijdens de in vivo en in vitro series van passages van PDX en tumor organoids, respectievelijk. Dit kan ook toestaan de algehele gene expressieprofielen en epi/genetische status van de getroffen CRC’s te veranderen, daardoor resulterend in minimale gelijkenis met de ouderlijke CRC.
Patiënt afkomstige CRC organoids en die geëxtraheerd uit noncancerous menselijke Colón ontworpen naar harbor combinaties van oncogene mutaties ook gewerkt hebben aan het onderzoeken van de kenmerken van menselijke tumorcellen wordt geïllustreerd door tumor invasie en metastase 6,7,8,9. Echter, de zeer lage incidentie van spontane uitzaaiing als gevolg van orthotopic implantatie van patiënt-afgeleide CRC naar immunodeficiëntie muizen, heeft het moeilijk gemaakt om te studeren het meerstaps proces van de invasie-metastase cascade waarin lokale invasie, intravasation, vervoer in de bloedbaan, de extravasation en de kolonisatie van verre organen4,10. Micrometastasis als vertegenwoordigd door tumor cel afzetting van ≤2 mm, gevormd door de patiënt afkomstige CRC organoids, heeft vaak over het hoofd gezien op histopathologisch analyse van secties van aangetaste verre organen in experimentele Muismodellen. Visualisatie van spontane micrometastasen geweest ook minimale in-vivo als gevolg van de moeilijkheid van de efficiënt invoering fluorescente markeringen in organoid tumorcellen voorafgaand aan hun injectie in ontvangende muizen. In deze studie, ontwikkelden we een protocol kunnen efficiënt transduce GFP lentivirus in PDX-afgeleide CRC organoid cellen in 3D cultuur vóór injectie in ontvangende muizen en kunnen zeer gevoelige detectie, stereo-fluorescentie microscopie, in dienst van hun kolonisatie van de verschillende organen te formulier micrometastasen.
Hoewel de CRC PDX-model heeft wijd uitgeoefend te bestuderen van de groei van de primaire tumor, of dit model is ook van toepassing op het onderzoek naar uitzaaiing van de tumor is niet nog is volledig opgehelderd. Spontane uitzaaiingen waren ook nauwelijks waarneembaar in de lever en longen van verschillende gerapporteerde dubbelpunt PDX modellen4,10. U wilt opsporen micrometastasen met hoge gevoeligheid, ontwikkelden we een protocol voor transducing van GFP len…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Juntendo Universiteit Young Investigator Award (2013, 2014 en 2015) Y.O., het gezamenlijke Project Award (2013 en 2014) naar K. M., en verleent in-steun voor wetenschappelijkonderzoek van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en Technologie-, Japan (16K 15625 aan Y. K. en 16K 15598 aan M.G.). Wij zijn vooral dankbaar voor alle leden van de fac. van de chirurgie van de Coloproctological en moleculaire pathologie voor nuttige discussies en technische ondersteuning. Wij danken ook Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu Universiteit Schoolof geneeskunde) en Dr Hideki Kitajima (Internationale Universiteit van gezondheid en welzijn) voor gulle technische begeleiding in de chirurgische procedures voor orthotopic implantatie in muizen en Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) voor technisch advies over het uitvoeren van de tumor organoid cultuur.
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
6-well plate | BMBio | #92006 | |
12-well plate | BMBio | #92412 | |
15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |