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Cancer Research

Haute sensibilité détection des micrométastases générés par GFP Lentivirus-transduites organoïdes cultivé à partir d’une tumeur du côlon dérivé de Patient

doi: 10.3791/57374 Published: June 14, 2018

Summary

Pour permettre une détection très sensible de la diffusion du cancer colorectal humain cellules (CRC) qui colonisent les tissus, nous montrons ici un protocole pour la transduction efficace des Particules Lentivirales protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules organoïde CRC PDX-dérivés avant leur injection à des souris bénéficiaires, avec l’observation au microscope stéréo-fluorescence.

Abstract

Malgré les progrès actuels dans le traitement du cancer colorectal humain (CRC), quelques traitements radicaux sont appliquent aux derniers stades du CRC. Pour surmonter ce défi clinique, les modèles de souris de xénogreffes tumorales utilisant longtemps lignées de cellules de carcinome humain et de nombreux modèles de souris transgéniques présentant des tumeurs ont été développés dans des modèles précliniques. Partiellement imiter les caractéristiques des carcinomes humaines, ils omettent souvent de récapituler les principaux aspects des malignités humaines y compris l’invasion et la métastase. Ainsi, des modèles alternatifs qui représentent mieux la progression maligne dans CRC humaine ont longtemps été attendus.

Nous montrons dans la présente génération de xénogreffes tumorales dérivées de patient (PDXs) par l’implantation sous-cutanée de petits fragments CRC chirurgicalement découpé d’un patient. Le colon PDXs développer et examen histopathologique ressemblent à la CDE chez le patient. Cependant, quelques micrométastases spontanées sont détectables dans les coupes classiques des organes éloignés touchés dans le modèle PDX. Afin de faciliter la détection d’une dissémination métastatique dans des organes éloignés, nous organoïde cellules tumorales extraites des PDXs du côlon en culture et infectés par le lentivirus GFP avant injection dans fortement immunodéprimé Shi-NOD/scid IL2Rγ null Souris (NOG). Orthotopically injecté PDX-dérivé CRC organoïde cellules constamment forme tumeurs primaires positifs pour GFP chez les bénéficiaires. En outre, spontanément au point micrometastatic colonies exprimant GFP sont notamment détectés dans les poumons de ces souris par microscopie de fluorescence. Par ailleurs, l’injection intra-splénique de CRC organoïdes produit fréquemment colonisation hépatique. Pris ensemble, ces résultats indiquent GFP-étiqueté des cellules dérivées de PDX CRC organoïde d’être visuellement détectable au cours d’un processus multipas appelle la cascade d’invasion-métastase. Les protocoles décrits incluent l’établissement de PDXs de CDE humaine et de la culture 3D des correspondants CRC organoïde cellules transduites par Particules Lentivirales GFP.

Introduction

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Cancer colorectal (CCR) est la deuxième cause de cancer décès dans le monde1. Une réponse insuffisante à des thérapies conventionnelles des patients atteints de la maladie de stade avancé indique l’inefficacité des tentatives pour guérir radicalement Croix-Rouge canadienne. Pour développer des approches thérapeutiques plus efficaces, divers modèles de souris préclinique du cancer qui imitent les caractéristiques du CRC ont été établis. Diverses lignées cellulaires CRC ont été largement utilisées pour générer des xénogreffes tumorales en raison de leur commodité et facilité de manipulation. Culture à long terme des lignées de cellules cancéreuses, cependant, provoque souvent la sélection unique de populations de cellules qui sont tout à fait proliférative sous une condition de culture particulière, entraînant ainsi des résultats peu fiables et des limitations cruciales dans le médicament préclinique développement.

Sans être cultivées in vitro, xénogreffes tumorales dérivées de patient (PDXs) ont également été générés par implantation dans des modèles animaux de tissus humains de CRC chirurgicalement disséqués des patients2,3,4. PDXs sont largement reconnus comme récapitulant les principales caractéristiques histopathologiques et altérations génétiques présent initialement dans les tumeurs des patients dont ils sont dérivés. En outre, tumeur dérivée de patient organoïdes composée de cellule tumorale grappes ont été établies par la culture dans des conditions 3D étroitement imité les propriétés biologiques de l’origine des tumeurs5,6. Ces organoïdes de tumeur ont été également appliqués au dépistage de drogue de haut débit, permettant ainsi aux thérapies personnalisées être conçu5. Cependant, les populations de CRC fortement hétérogènes sont censées pour être présents au sein d’une tumeur masse. Populations particulières de CRC peuvent sélectivement prolifèrent et développer au cours de la série in vivo et in vitro des passages de PDX et tumeur organoïdes, respectivement. Cela peut permettre également le général profils d’expression génique et le statut epi/génétique de la SCCR touchée à changer, entraînant ainsi dans la ressemblance minime à la CRC parental.

Dérivé de patient organoïdes CRC et celles extraites du côlon humain non cancéreuse, conçu pour le port de combinaisons de mutations oncogéniques ont également été employées pour étudier les caractéristiques des cellules tumorales humaines incarnées par invasion tumorale et les métastases 6,7,8,9. Cependant, la très faible incidence de métastases spontanées découlant de l’implantation orthotopique du CRC dérivé de patient dans des souris immunodéficientes, a rendu difficile d’étudier le processus multipas de la cascade d’invasion-métastases comprenant local invasion, intravasation, transport dans la circulation sanguine, l’extravasation et la colonisation des organes éloignés4,10. Micrométastase comme représenté par le dépôt de cellules tumorales de ≤2 mm, formé par patient dérivé CRC organoïdes, a souvent été négligé sur l’analyse histopathologique des coupes d’organes éloignés touchés dans des modèles expérimentaux de souris. Visualisation des micrométastases spontanée a été minime en vivo en raison de la difficulté d’introduire efficacement les marqueurs fluorescents dans les cellules tumorales organoïde avant leur injection à des souris destinataires. Dans cette étude, nous avons développé un protocole pour transmettre efficacement lentivirus GFP dans des cellules organoïde CRC PDX-dérivé dans la culture 3D avant l’injection à des souris destinataires et pour permettre la détection très sensible, employant stéréo-fluorescence microscopy, de leur colonisation des différents organes de forme micrométastases.

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Protocol

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Le patient fourni le consentement éclairé et le projet a été approuvé par le Comité d’éthique de recherche de la faculté de médecine de l’Université Juntendo. Les expériences de souris ont également été approuvées par le Comité d’éthique de recherche animale de la faculté de Juntendo de médecine.

1. création de PDXs CRC dans des souris immunodéficientes

Les procédures expérimentales pour établir la CRC PDXs (étape 1) sont décrites dans la Figure 1 a.

  1. Préparer le tissu CRC primaire immédiatement après résection chirurgicale de la tumeur du patient.
  2. Laver le tissu primaire de CRC par agitation modérée plusieurs fois dans 30 mL de phosphate stérile glacé solution saline tamponnée (PBS) dans un tube conique de 50 mL et le maintenir sur la glace.
  3. Placer le tissu sur une boîte de Pétri 10 cm à l’aide de pinces stériles, supprimer les zones nécrotiques aussi largement que possible à l’aide de ciseaux stériles et couper les tissus de tumeurs solides en petits morceaux (5 x 5 x 5 mm3 en taille) à l’aide de lames de rasoir stériles.
    Remarque : Les zones nécrotiques sont souvent plus blanc, plus doux et plus friables que dans les zones environnantes.
  4. Placer les petits morceaux de la tumeur à l’aide de pinces stériles dans 2 mL de solution de PBS stérile glacée sur une plaque de 6 puits.
  5. Se reproduisent 6 semaines Shi-NOD/scid IL2Rγ null (NOG) hautement souris immunodéficientes conditions gratuit germelibre et spécifique pathogène.
  6. Anesthésier les souris avec l’isoflurane inhalation à l’aide de l’appareil d’anesthésie inhalation animaux petits et désinfecter la peau avec l’éthanol à 70 %. Assurer le taux normal et la profondeur de la respiration et l’absence d’un réflexe de pincée d’orteil pour anesthetization bon. EFP onguent pour les yeux est une option, pour prévenir la sécheresse oculaire sous anesthésie.
  7. Stériliser tous les instruments chirurgicaux, à l’aide de stérilisation par la chaleur sèche et ensuite utiliser ces outils pour toutes les procédures pour prévenir les infections de plaies chez les bénéficiaires.
  8. Placez votre souris anesthésiée dans une position couchée sur le banc de laboratoire. Faire une petite incision sur la partie inférieure des flancs droit et gauche de la souris de destinataire pour générer les poches sous-cutanées pour l’implantation de tissus à l’aide de ciseaux stériles. Prendre soin de ne pas pour perforer la membrane péritonéale. Il devrait y avoir peu de saignements lors de cette procédure.
  9. Tremper doucement ce qui précède préparé des fragments de tumeur dans 50 µL de matrice extracellulaire artificielle et implanter ensuite vers les parties basses des poches sous-cutanées droite et gauche.
  10. Suture de l’incision avec des clips de blessure chez les souris qui subissent des procédures chirurgicales. S’assurer que les tissus de la tumeur implantés sont situés à une certaine distance de l’incision sous la peau.
    Remarque : Conformément à réduire au minimum les interventions chirurgicales, aucun traitement pour la douleur post-chirurgicale et infection ont été administrés dans cette étude.
  11. Placez votre souris sur une garniture chaude et maintenir la position de couché sternale jusqu'à ce que la conscience suffisante est rétablie. Une fois complètement récupéré et capable de s’asseoir sur ses quatre jambes, les souris peuvent être retournées à leurs cages maison. Pour éviter la prédation, ne permettent pas d’élevage avec des animaux non exploitées dans la même cage.
  12. Recherchez les fuites de suture et confirmer que les souris sont dans un état stable, le lendemain, dans le groupe traité par chirurgie. Vérifiez les souris pour les signes de la maladie et mesurer la taille de la tumeur dans chacune des souris, une fois par semaine, en employant des étriers.

2. dissection du CRC PDXs de souris

Les procédures expérimentales pour la dissection des CRC PDXs (étape 2) sont décrits dans la Figure 1 b.

  1. Permettre à la tumeur de croître par voie sous-cutanée à ~ 1 cm3 en taille, ce qui prend habituellement environ 1 à 3 mois.
  2. Anesthésier la souris avec l’isoflurane inhalation à l’aide de l’appareil d’anesthésie inhalation animaux petits et désinfecter la peau avec l’éthanol à 70 %.
  3. Placez votre souris dans une position couchée sur le banc de laboratoire. Inciser la peau, exposition de la tumeur et détacher délicatement la peau de la tumeur à l’aide de ciseaux stériles. Après avoir enlevé la tumeur, placez-le sur une boîte de Pétri de 10 cm et supprimer toute zones nécrotiques grossièrement de la tumeur, puis rincer deux fois avec 5 mL de PBS.
    Remarque : Les zones nécrotiques sont souvent plus blanc, plus doux et plus friables que dans les zones environnantes.
  4. Placez la tumeur sur la glace et divisez-le tout aussi en au moins 4 pièces pour différentes applications dont 1) la CRC organoïde culture, 2) transplantation secondaire chez la souris, l’examen 3) histologique et 4) congélation et stockage des fragments tumeur.
    1. Pour la génération de la CRC organoïdes, placez le tissu de tumeur solide sur un plat de Pétri de 6 cm contenant 1 mL de PBS stérile. Gardez le tissu sur la glace jusqu’au traitement (étape 3).
    2. Pour établir le modèle PDX CRC humaine, passage la douce PDXs CRC dans un secondaire de la souris. Couper le tissu tumoral en petits morceaux (5 x 5 x 5 mm3 en taille) à l’aide de lames de rasoir stériles et tremper doucement ces fragments tissulaires dans 50 µL de matrice extracellulaire artificielle. Ensuite, l’implant ces fragments vers les parties basses des poches sous-cutanée gauche et droit de la souris NOG, tel que décrit à l’étape 1.8, 1.11.
    3. Pour faire une analyse histologique, fixer les échantillons dans 5 mL de formol tamponné neutre de 10 % dans un tube conique de 15 mL à température ambiante pendant 2 jours.
    4. Pour la cryoconservation, couper le tissu tumoral en petits morceaux (5 x 5 x 5 mm3 en taille) et plonger délicatement les échantillons dans 500 µL de cellules tubes cryovial 1 – 1,5 mL de la solution de congélation. Ensuite, transférer le tube dans un congélateur à-80 ° C.

3. extraction du PDXs dans la Suspension cellulaire pour la Culture d’organoïde CRC

Les procédures expérimentales pour la dissociation du CRC PDXs (étape 3) sont décrits dans la Figure 1 b.

  1. Place la tumeur de prêts (étape 2.4.1) ci-dessus des fragments sur une boîte de Pétri de 10 cm.
  2. Émincer les fragments à l’aide de lames de rasoir stériles et de les transférer dans un tube conique de 15 mL, 8 ml de sérum de veau foetal de 10 % (FCS)-Medium (DMEM de l’aigle de la modification de Dulbecco) avec 80 µL de stock d’enzyme collagénase (voir Table des matières).
  3. Bien fermer le tube et envelopper le bouchon avec du parafilm pour éviter les fuites. Pour dissocier les fragments de tumeur hachées dans la suspension cellulaire, agitez il doucement pendant 2 h à 37 ° C. Notez qu’il y aura encore de nombreux fragments de tissus non digérés restant dans le tube.
  4. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Résoudre le culot cellulaire à l’aide de 10 mL de 10 % FCS-DMEM pour faire de la suspension cellulaire.
  5. Pour éliminer les débris tissulaires non digérés, filtrer la suspension cellulaire deux fois à l’aide de la crépine de cellule de 40 µm sur un tube conique de 50 mL. Puis, centrifuger le cheminement à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et garder le diabolo sur la glace.

4. génération de la CRC organoïdes cultivés sur la matrice extracellulaire artificielle

Les procédures expérimentales pour la culture d’organoïde CRC des PDXs du côlon (étape 4) sont décrits dans la Figure 1 b.

  1. Établir un milieu de culture approprié pour l’organoïdes CRC PDX-dérivé (voir Table des matières, « le milieu de culture organoïde CRC ») qui emploient décrites antérieurement pour humain du colon organoïdes11.
  2. Appliquer 150 µL de matrice extracellulaire artificielle (voir Table des matières) par ainsi sur une plaque de 12 puits sur la glace et ensuite il incuber pendant 30 à 60 min dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pour solidifier les gels.
  3. Suspendre le culot cellulaire de l’étape 3.5 avec le milieu de culture organoïde CRC (de l’étape 4.1) avec 5 % de FCS pour réaliser le réglage à 3 x 105 cellules/mL. Ensuite, les semences 1 mL du milieu sur la plaque extracellulaire artificiel de matrice-enduit préparé à l’étape 4.2. et incuber une nuit à 37 ° C moins de 5 % de CO2. Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules tumorales, y compris les cellules individuelles et groupes pluricellulaires (un groupe de cellules adhérentes) dans la suspension cellulaire.
    Remarque : 5 % FCS est utilisé pour étancher l’activité enzymatique résiduelle de collagénase dans cette étude.
  4. Recueillir soigneusement le milieu de culture, y compris flottant des cellules qui ont enlevé l’artificielle plaque enduit de matrice extracellulaire, dans un 1,5 mL Centrifuger le tube sur le jour suivant il centrifuger à 1 400 g pendant 5 min. Ensuite, retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 70 µL de matrice extracellulaire artificielle sur la glace.
  5. Pour augmenter la viabilité cellulaire CRC, superposer la tumeur contenant des cellules artificielles matrice extracellulaire sur la tumeur organoïde cellules fixé à la plaque de revêtement matrice extracellulaire artificielle et incuber pendant 30 minutes dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pour solidifier le revêtement artificiel de la matrice extracellulaire. Puis, incuber il avec 1 mL de milieu de culture cellulaire CRC organoïde avec 1 % FCS à 37 ° C sous 5 % CO2.
  6. Changer le milieu de culture tous les deux jours. Comme les CRC organoïdes remplissent le milieu, il peut devenir nécessaire de changer le support de tous les jours.

5. production et enrichissement des Particules Lentivirales GFP

Les procédures expérimentales pour la génération et l’enrichissement des Particules Lentivirales GFP (étape 5) sont décrits dans la Figure 1.

  1. La culture de cellules HEK293T avec Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen contenant 10 % FCS et préparer six plats de 10 cm (2 x 106 cellules / plat) pour la procédure suivante de transfection.
  2. Pour la transfection par plat, préparer 500 µL du mélange dont 20 µL de réactif transfection dans DMEM avec un PRRL-GFP vector (5 µg)12 et deux plasmides d’emballage des gènes, tels que CMVp-VSV-G (1 µg) et CMVp-dR8.2 dvpr (5 µg), dans un stérile de 1,5 mL microtube. Garder le mélange à température ambiante pendant 20 min puis superposer sur chacun des plats 10 cm et les incuber pendant 18 heures.
  3. Retirez le support, ajouter 5 mL de milieu de FCS-RPMI 1640 10 % frais de chaque plat et laisser reposer pendant 24 h.
  4. Recueillir le milieu conditionné de chaque plat dans un tube à centrifuger 50 mL et stocker un total de 30 mL de milieu à 4 ° C durant la nuit. Ajouter 5 mL de la douce RPMI 1640 sur chaque plat et laisser reposer pendant 24 h.
  5. Recueillir le milieu conditionné de chaque plat dans un tube à centrifuger de 50 mL et le donjon, au total, 30 mL de milieu sur la glace. Ensuite, jeter les cellules.
  6. Filtrer sur un filtre de 0,45 µm pour éliminer les cellules et diviser cette quantité en douze tubes de centrifugeuse en polypropylène de 5 mL d’ultracentrifugation 60 mL du milieu (de l’étape de 5,4 à 5,5).
  7. Afin de concentrer les virus, centrifuger à l’aide d’un rotor oscillant de seau (voir Table des matières) à 85 327 x g pendant 1,5 h à 4 ° C.
  8. Retirer immédiatement du milieu. Pour résoudre le culot de virus concentré, placez 250 µL du mélange de nutriments Ham F-12 (F12) / milieu DMEM sans FCS dans chacune des douze tubes et maintenir à 4 ° C durant la nuit. Notez que le culot de virus est souvent invisible.
  9. Pipetez doucement le milieu pour collecter les 3 mL du concentré 5 x GFP lentivirus stock, au total, dont probablement des Particules Lentivirales GFP avec 108 transduction unités / mL (TU/mL). Ensuite, rangez les douze microtubes de 1,5 mL (y compris les 250 µL par tube) dans des conditions stériles à-80 ° C pendant un an. Préparez plusieurs petites parties aliquotes de la solution d’origine afin d’éviter de multiples cycles de dégel freeze.

6. étiquetage des cellules organoïde CRC avec GFP Particules Lentivirales cultivées sur matrice extracellulaire artificielle

Les procédures expérimentales pour l’étiquetage des cellules organoïde CRC avec lentivirus GFP (étape 6) sont décrits dans la Figure 1.

  1. Permettre la CRC organoïdes préparé à l’étape de 4,6 à grandir sans interférence pendant 7 à 10 jours, récolter mécaniquement à l’aide d’un grattoir de cellules stériles et puis de les transférer dans un microtube 1,5 mL.
    Remarque : La croissance du CRC organoïdes dans la culture dépend de la nature des tumeurs originales provenant de patients. Éviter surcroissance de la CRC organoïdes, en les maintenant à la confluence de 60 à 70 % avant le transfert à un rapport 1:2 de split sur une nouvelle artificielle extracellulaire enduit de matrice 12 puits plaque.
  2. Centrifuger le microtube pendant 3 min à x 1 400 g, enlevez le milieu de culture et résoudre le culot cellulaire dans 500 µL de PBS en tapotant doucement.
  3. Centrifuger le microtube pendant 3 min à 1 400 g et éliminer les PBS.
  4. Pour dissocier l’organoïdes CRC adhérentes, ajouter 500 µL d’une solution de détachement des cellules de protéolytique et collagénolytique enzymes de la cellule dans le tube de granule et mélangent en tapotant doucement. Ensuite, laisser les tubes se contenter de 10 min à température ambiante.
  5. Pipetter très doucement la suspension de cellules avec un 500 µL supplémentaire de 1 % FCS-DMEM plusieurs fois dans un microtube 1,5 mL environ de dissocier les cellules. Génération de cellules individuelles de l’organoïdes CRC par pipetage dures réduit sensiblement la viabilité cellulaire. Ainsi, il est indispensable de laisser la masse des cellules visuellement détectable dans la suspension cellulaire en pipettant également très doucement dans un microtube 1,5 mL.
  6. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 3 min à 1 400 g et éliminer le surnageant.
  7. Résoudre le culot cellulaire avec un mélange de la 100 µL de stock de lentivirus x GFP 5 (> 108 TU/mL) et 400 µL de milieu de culture organoïde CRC dans un microtube 1,5 mL en tapotant doucement pour s’adapter à une concentration de 5 x 105 dissociée des cellules tumorales par 500 µL . Utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules tumorales, y compris les cellules individuelles et groupes de cellules dans la suspension cellulaire, tel que décrit ci-dessus (étape 4.3).
  8. Préparer une artificielle extracellulaire enduit de matrice 12 puits plaque, comme indiqué au point 4.2. Ensuite, placer 500 µL de la suspension cellulaire établie à l’étape 6,7 sur la plaque et laissez-le pendant 18 heures à 37 ° C moins de 5 % de CO2.
  9. Recueillir le milieu avec les cellules flottantes détachés de la plaque de revêtement matrice extracellulaire artificielle dans un tube de centrifugation de 1,5 mL. Il centrifuger à 1 400 x g puis retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 70 µL de matrice extracellulaire artificielle sur la glace.
  10. Pour augmenter la viabilité cellulaire CRC, superposer la tumeur contenant des cellules artificielles matrice extracellulaire sur la tumeur d’organoïdes attaché à l’artificielle extracellulaire enduit de matrice 12 puits plaque, comme indiqué au point 4.5. Ensuite, incuber la plaque pendant 30 min dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pour solidifier le revêtement artificiel de la matrice extracellulaire et puis culture il avec 1 mL de milieu de culture organoïde CRC avec 1 % FCS à 37 ° C moins de 5 % de CO2.
  11. Observer les cellules à 3 jours après l’infection sous un microscope à fluorescence pour confirmer la positivité GFP de presque 100 % en raison de l’utilisation d’un titre élevé de Particules Lentivirales (voir la Figure 2 a).
  12. Culture l’organoïdes CRC pour des périodes de 7 à 10 jours pour développer la croissance cellulaire avant l’injection à des souris destinataires.

7. génération des métastases par GFP-étiqueté CRC organoïdes chez les souris destinataires

Les procédures expérimentales pour la génération des métastases à l’aide de la GFP-étiqueté CRC organoïdes (étape 7) sont décrits dans la Figure 1.

  1. Pour dissocier l’organoïdes CRC GFP-étiqueté dans la suspension cellulaire, récolter mécaniquement à l’aide d’un grattoir de cellules stériles et transférez-les dans un microtube 1,5 mL, tel que décrit ci-dessus (étape 6.1).
  2. Centrifuger le microtube pendant 3 min à x 1 400 g, enlevez le milieu de culture et régler le culot cellulaire dans 500 µL de PBS en tapotant doucement.
  3. Centrifuger le microtube pendant 3 min à 1 400 g et éliminer les PBS.
  4. Superposition de 500 µL de la solution de détachement cellulaire sur le culot du tube et mélanger en tapotant doucement. Ensuite, laisser les commandes de mélange pendant 10 min à température ambiante enzymatiquement dissocier l’organoïdes CRC adhérentes, tel que décrit ci-dessus (étape 6.4).
  5. Pipetter très doucement la suspension de cellules avec un 500 µL supplémentaire de 1 % FCS-DMEM plusieurs fois dans un microtube 1,5 mL environ de dissocier les cellules, tel que décrit ci-dessus (étape 6.5). Génération de cellules individuelles de l’organoïdes CRC par pipetage dures réduit sensiblement la viabilité cellulaire. Ainsi, on laisse la masse des cellules visuellement détectable dans la suspension cellulaire en pipettant également très doucement dans un microtube 1,5 mL.
  6. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 3 min à 1 400 g et éliminer le surnageant.
  7. D’établir un modèle de souris de métastase spontanée du CRC PDXs :
    1. Préparer une suspension de cellules, y compris les 5 x 105 cellules dans 50 µL de PBS avec la matrice extracellulaire artificiel de 50 % par la souris. Maintenir la suspension sur la glace avant utilisation. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules cancéreuses, comme indiqué dans l’étape 4.3.
    2. Anesthésier une souris avec inhalation isoflurane, à l’aide de l’appareil d’anesthésie inhalation animaux petits et désinfecter la peau avec l’éthanol à 70 %, comme indiqué dans l’étape 1.6.
    3. Placez votre souris NOG en position couchée sur le banc de laboratoire. Saisir la muqueuse rectale avec des pinces stériles et tirez-le doucement hors de l’anus. Puis, immédiatement injecter la suspension cellulaire établie à l’étape 7.7.1 dans la sous-muqueuse rectale de la souris à l’aide d’une seringue (aiguilles : 22 G). Régulièrement, 4-6 souris par groupe sont utilisés pour évaluer les résultats.
  8. D’établir un modèle expérimental de métastases du CRC PDXs :
    1. Préparer une suspension de cellules organoïde CRC y compris 4 x 104 cellules dans 50 µL de PBS par souris. Maintenir la suspension sur la glace avant utilisation. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules cancéreuses (étape 4.3).
    2. Anesthésier une souris avec inhalation isoflurane, à l’aide de l’appareil d’anesthésie inhalation animaux petits et désinfecter la peau avec l’éthanol à 70 %, comme indiqué dans l’étape 1.6.
    3. Placez votre souris NOG anesthésiée dans une position couchée sur le banc de laboratoire. Faites une petite incision sur la partie inférieure du flanc gauche et puis coupez le péritoine pour exposer avec soin la rate à l’aide de pinces et ciseaux stériles. Saisir le tissu graisseux, attaché à la rate avec des pinces stériles, puis d’injecter lentement 50 µL de la suspension cellulaire (préparée comme indiqué ci-dessus, l’étape 8.1) dans la rate. Veillez à ce que la suspension cellulaire est injectée de manière appropriée sans fuite vers l’extérieur, de la rate. Régulièrement, 4 souris par groupe sont utilisés pour évaluer les résultats.
  9. Placez toutes les souris sur un coussin chaud après la chirurgie et maintenir en position allongée sternale jusqu'à ce que la conscience suffisante est restaurée, comme indiqué au point 1.11. Une fois que les souris ont pleinement récupéré, renvoyez-les à leurs cages maison. Pour éviter la prédation, ne permettent pas d’élevage avec des animaux non exploitées dans la même cage.
  10. Recherchez les fuites de suture et confirmer que les souris sont en vie, dans le groupe traité par chirurgie, le lendemain. Vérifier les souris des signes de maladie et mesure taille tumorale, employant des étriers, dans toutes les souris une fois par semaine.
  11. Observer les souris pour détecter les métastases expérimentale (1 mois) et des métastases spontanée (pour des périodes pouvant aller jusqu'à 2,5 mois) après l’injection.
  12. Sacrifier les souris par l’anesthésie et la dislocation cervicale les jours indiqués. Disséquer les tumeurs primaires et divers tissus, y compris le foie et les poumons. Placer les tumeurs disséqués et les organes dans 5 mL de PBS glacée sur une boîte de Pétri de 10 cm et stockez-les sur la glace.
  13. Pour détecter les cellules organoïde GFP séropositifs au CRC, observer les tissus disséqués au microscope stéréo-fluorescence. Acquisition d’images avec une caméra CCD et préparer à l’aide de logiciels de traitement d’image standard.

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Representative Results

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Un primaire adénocarcinome colorectal diagnostiqué comme modérément différencié avait été réséqué chirurgicalement d’une femme de 76 ans avec classification TNM, stade IIIa, suivie d’une chimiothérapie post-opératoire. L’immunohistochimique de cellules primaire CRC teinté positif pour l’antigène carcino-embryonnaire, Ki-67, pan-cytokératine et E-cadhérine. Pièces de la tumeur réséquée étaient également par voie sous-cutanée implantés dans souris NOG pour générer le modèle PDX de côlon. Les cellules organoïde CRC ont été ensuite extrait pour culture de tissus de la PDX colon qui avait mis au point par voie sous-cutanée chez ces souris. Les CRC organoïdes pouvaient constamment créant des grappes de multicellulaires lors d’une série de passages sur la matrice extracellulaire artificiel. Comme organoïdes de tumeur histologiquement et génétiquement reflètent la nature des tumeurs primaires du patients5,6, nous avons tenté de développer un modèle de souris qui permettrait in vivo la détection des cellules organoïde CRC à haute sensibilité au cours de la diffusion métastatique. Pour atteindre cet objectif, le CRC organoïdes abritaient des lentivirus GFP, entraînant ainsi dans presque tous les organoïdes montrant très lumineux GFP (Figure 2 a). Ces organoïdes étaient alors injecté orthotopically et intrasplenically dans des souris NOG secondaires avant la détection de cellules positives à GFP dans des organes éloignés sous un microscope à fluorescence. Nous avons observé la formation de tumeurs primaires GFP-positifs sur le site orthotopique dans toutes les quatre souris examinées (Figure 2 b, à gauche). En outre, des métastases microscopiques ont été trouvés dans les poumons des souris de trois des quatre examinés à 2,5 mois après injections orthotopique (milieu de laFigure 2 b, ). En outre, des métastases hépatiques ont été observées en réponse à l’injection intra-splénique dans toutes les quatre souris examinés à 1 mois après les injections (Figure 2 b, droit).

Pris ensemble, ces résultats indiquent que haute résolution fluorescence GFP sur des cellules dérivées de PDX CRC organoïde permet leur détection en micrométastases spontanée et ceux mis au point expérimentalement, dans des organes éloignés, lorsque introduit dans destinataire souris. Cette détection ultrasensible du disséminateur CRC PDX-dérivés organoïdes en vivo propose également un modèle polyvalent, non seulement pour l’étude de la biologie des métastases tumorales, mais aussi pour le développement de thérapies ciblées dans le paramètre préclinique.

Figure 1
Figure 1 : représentation schématique de la génération des métastases par la CRC PDX-dérivé organoïdes étiqueté avec lentivirus GFP chez les souris NOG. (A) l’Implantation de petits morceaux de tissu CRC par voie sous-cutanée à des souris NOG (étape 1). Le tissu CRC disséqué chirurgicalement le patient a été coupé en morceaux et implanté par voie sous-cutanée à des souris NOG. l.c. : implantation sous-cutanée. (B) génération de CDE organoïdes dissocié PDXs (étape 2 – 4). Les xénogreffes CRC développés étaient hachée (étape 2) et transférées dans un tube de 15 mL contenant le milieu de culture, y compris la collagénase (étape 3). Après incubation avec agitation lente, la suspension de cellules CRC a été filtrée (étape 3). Ensuite, la suspension de cellules organoïde dans le milieu d’organoïde CRC a été ensemencée sur une plaque de revêtement matrice extracellulaire artificielle et incubée durant une nuit dans un incubateur à CO2 (étape 4). Les cellules d’organoïde CRC attachés à la matrice extracellulaire artificielle étaient également recouverts de matrice extracellulaire artificielle supplémentaire et incubés dans un incubateur à CO2 (étape 4). l.c. : implantation sous-cutanée. (C) génération de CDE organoïdes transduites par Particules Lentivirales GFP avant employant l’injection à des souris destinataires (étape 5 – 7). Les particules Lentivirales GFP ont été générées à un titre élevé (étape 5). Les CRC PDX-dérivé organoïdes cultivés sur la matrice extracellulaire artificielle ont été directement récoltés avec un grattoir de cellules et transférés dans un microtube (étape 6). Après centrifugation, le culot cellulaire a été remises en suspension dans du PBS. La suspension cellulaire a été centrifugée et le culot cellulaire a été dissocié. Ensuite, la suspension de cellules organoïde CRC est incubée avec stock de virus GFP dans le milieu de culture organoïde CRC sur la plaque de revêtement matrice extracellulaire artificielle du jour au lendemain dans un incubateur à CO2 (étape 6). Les cellules d’organoïde CRC attachés à la matrice extracellulaire artificielle ont été recouverts de matrice extracellulaire artificielle supplémentaire et incubés dans un incubateur à CO2 pour solidifier le revêtement artificiel de la matrice extracellulaire (étape 6). Les CRC organoïdes sont alors cultivés pour des périodes de 7 à 10 jours pour développer la croissance des cellules (étape 6). Pour élaborer un modèle de métastase spontanée, les 5 x 105 CRC organoïde cellules dissociées étiquetés avec GFP en suspension dans 50 µL de PBS avec la matrice extracellulaire artificiel de 50 % ont été injectées orthotopically souris NOG (étape 7). Pour générer un modèle expérimental de métastase, 4 x 104 CRC organoïde cellules marquées avec GFP dans 50 µL de PBS ont été injectées intrasplenically chez des souris NOG (étape 7). o.t. : injection orthotopique, i.s. : injection intra-splénique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : visualisation haute résolution de GFP détectée dans culture CRC GFP-étiqueté organoïdes, tumeurs primaires et micrométastases. (A) près de 100 % de culture CRC organoïdes sont GFP positive. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope stéréo-fluorescence. Echelle = 250 µm. B GFP-positivité dans la tumeur primitive et les micrométastases dans les poumons et le foie. La suspension de cellules exprimant le GFP CRC organoïde dissociée a été injectée dans la sous-muqueuse rectale (o.t. INJ.) des souris NOG. La majorité des cellules tumorales apparaissent positifs pour GFP dans la tumeur primitive. GFP-positif micrométastases colonisant les poumons (indiqués par une flèche) sont également indiqués. En outre, GFP-positif micrométastases sont détectés dans le foie (indiqué par une flèche), lorsque la suspension cellulaire a été injectée intrasplenically (i.s. INJ.) à des souris. Echelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Bien que le modèle CRC PDX a été largement utilisé pour étudier la croissance de la tumeur primitive, si ce modèle s’applique également à une enquête sur les métastases tumorales n'a pas encore été complètement élucidé. Métastases spontanées étaient également à peine détectables dans le foie et les poumons des divers rapportés du côlon PDX modèles4,10. Pour détecter les micrométastases à haute sensibilité, nous avons développé un protocole pour la transduction des Particules Lentivirales GFP dans CRC PDX-dérivé organoïdes avant leur orthotopique et injections intraveineuses à des souris destinataires. De note, nous avons pu montrer que cette méthode permet de détecter très sensible CRC dérivés organoïde micrométastases, tous deux formant spontanément et expérimentalement, dans des organes éloignés.

Étapes critiques au sein du protocole, mentionnons le maintien formation sphéroïde intact sans induction d’anoikis sur la matrice extracellulaire artificielle de pipetage doucement l’organoïdes CRC au cours de la série passaging. La préparation de titre élevé lentivirus particules concentrées par ultracentrifugation est aussi importante pour la réalisation de la positivité de GFP presque 100 % des CRC organoïdes. En outre, il est recommandé que le CRC GFP-étiqueté organoïdes être injectées dans les 10 – 14 jours souris destinataires. Excessivement longues périodes d’expansion de la CRC organoïdes après l’infection peuvent favoriser la sélection de faiblement organoïdes exprimant le GFP.

L’injection de CRC organoïdes dans la sous-muqueuse rectale de souris NOG ont montré leur dissémination métastatique dans les poumons, mais pas dans le foie, probablement par l’intermédiaire de la veine cave inférieure. Pour générer des métastases hépatiques spontanément, injection de CRC organoïdes dans le côlon avec laparotomie serait requis13.

Notez que l’incidence des lymphomes B cell est à l’occasion a augmenté chez les souris immunodéficientes NOG implantés des tissus, y compris les lymphocytes, infectés par des oncovirus Epstein-Barr, de patients humains14. Il est donc raisonnable de recommander que si les nouvelles tumeurs proviennent de la CRC humaine implanté être déterminée en exécutant immunohistochimie à l’aide des marqueurs de cellules CRC humaines, tels que l’antigène carcino-embryonnaire et la cytokératine 20.

Comme nous avons étudié CRC organoïdes dérivé d’un seul patient, plus d’échantillons de plus grands nombres de patients devront être examinés afin de généraliser nos résultats à l’avenir. Si l’implant PDX-dérivé CRC organoïdes montrent une croissance minimale sur le site orthotopique et rarement des métastases de forme à des endroits éloignés, chercheurs sont encouragés à envisager l’extraction organoïdes CRC de différents dérivés de patient PDXs.

La détection très sensible des micrométastases GFP-étiqueté obtenus avec cette méthode nous encourage non seulement d’étudier plus avant plusieurs questions biologiques non résolues au sujet de la transition de micrométastase à macrométastase, formation de le stromales niche pour l’acquisition de la résistance aux médicaments, mais aussi d’évaluer l’efficacité des nouveaux médicaments contre le cancer en utilisant le PDX-animaux comme modèles précliniques et colonisation métastatique.

La GFP-basé FACS-tri de vivre organoïdes CRC extraites de sites principaux et lointaines a aussi le potentiel pour permettre seul examens basés sur les cellules de l’expression génique, ainsi que les profils épigénétiques et métabolomique, d’une tumeur. Ces conclusions peuvent conduire à l’élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la dissémination métastatique de la CRC organoïdes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt potentiel à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Juntendo University Young Investigator Award (2013, 2014 et 2015) à ans, le prix de projet conjoint (2013 et 2014) à M. K. et accorde à-aides à la recherche scientifique depuis le ministère de l’éducation, Sports, Culture, Science et Technologie, Japon (16 15625 K et K. Y. et 16K 15598 à M.G.). Nous sommes particulièrement reconnaissants à tous les membres du département de chirurgie coloproctogiques et pathologie moléculaire pour des discussions fructueuses et support technique. Nous remercions également m. Hiroyuki Konno (Hamamatsu Université école médecine) et Dr Hideki Kitajima (Université internationale de la santé et du bien-être social) généreux conseils techniques dans les procédures chirurgicales d’implantation orthotopique en souris et Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) pour des conseils techniques sur l’exécution de la culture d’organoïde tumeur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions
wound clips
2×10mm
Natsume manufacturing, Japan #C-21-S Autoclave before use
Hamilton syringe
needle size:22 gauge
Tokyo Science, Japan Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.
6-well plate BMBio #92006
12-well plate BMBio #92412
15ml conical tube Sumitono Bakelite MS-57150
50ml conical tube Sumitomo Bakelite MS-57500
microtube Eppendorf #0030120086 Autoclave before use
Hemocytometer Erma #03-202-1
40μm cell strainer Corning #352340
Matrigel basement membrane matrix Corning #354234 Store aliqupts at -20°C.
Place on ice until use
Collagenase type 1 Sigma #C1030 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year
Accutase Innovate Cell Technologies #5V2623A Store at 4°C.
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ Gibco #10565018 Store at 4°C. Warm at 37°C before use
Cell banker 1plus ZENOAQ #628 Store at 4°C. Use within 1 month
Penicillin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
Streptomycin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
hEGF PEPROTECH #AF-100-15 Store at -20°C. Add to medium on same day as use
Y27632, a ROCK inhibitor Wako #253-00591 Store at -20°C. Add to medium on
same day as use
Culture medium Gibco DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
Store at 4°C. Use within 1 month.
CRC organoid culture medium
with 1% or 5% FCS
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor.
Store at 4°C. Use within 1 month.
the FuGENE 6 transfection regent Roche 11814 443001
Minisart 0.45 µm filter Sartorius stedim 17598-K
5 ml polypropylene centrifuge tubes Beckman Coulter 326819
PRRL-GFP vector Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr Gift from Dr. Robert A. Weinberg
the SW55Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope Zeiss

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References

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Haute sensibilité détection des micrométastases générés par GFP Lentivirus-transduites organoïdes cultivé à partir d’une tumeur du côlon dérivé de Patient
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Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).More

Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).

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