Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

רגישות גבוהה זיהוי של Micrometastases שנוצרו על-ידי Organoids Lentivirus transduced GFP תרבותי מגידול נגזר המטופל הגס

doi: 10.3791/57374 Published: June 14, 2018

Summary

כדי לאפשר זיהוי רגישה מאוד של סרטן המעי הגס האנושי disseminating (CRC) תאים להמדינות רקמות, במסמך זה נראה עבור התמרה חושית יעילה של חלקיקים lentiviral חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לתוך תאים תא צורב PDX-derived CRC פרוטוקול לפני הזרקת שלהם לתוך עכברים הנמען, עם תצפית מיקרוסקופית סטריאו-זריחה.

Abstract

למרות ההתקדמות הנוכחי בטיפול בסרטן המעי הגס האנושי (CRC), כמה טיפולים קיצוניים יעילים לשלבים מאוחר של CRC. כדי להתגבר על האתגר הזה קליניים, גידול xenograft העכבר מודלים באמצעות שורות תאים ותיקה קרצינומה של האדם והעכבר הטרנסגניים רבים פותחו מודלים עם גידולים כמו במודלים פרה. הם חלקית לחקות את התכונות של האנושי קרצינומה, אך לעיתים קרובות אינם מצליחים לסכם היבטים מרכזיים של ממאירות האנושי כולל פלישה גרורות. לפיכך, מודלים חלופיים שמייצגים יותר את התקדמות ממאיר ב CRC האנושי יש כבר המיוחל.

במסמך זה אנו מראים לדור של החולה, נגזר הגידול xenografts (PDXs) על ידי השתלה תת עורית של קטעים CRC קטן בניתוח גזור מן המטופל. המעי הגס PDXs לפתח ומזכירים histopathologically ה-CRC אצל המטופל. עם זאת, כמה micrometastases ספונטנית הן לזיהוי ב חתכים קונבנציונאלי איברים רחוקים המושפעת במודל PDX. כדי להקל על זיהוי גרורתי הפצתו לתוך איברים רחוקים, אנו מופק לתאי הגידול תא צורב PDXs המעי הגס בתרבות, נגוע אותם GFP lentivirus לפני זריקה לתוך IL2Rγ הנד/שי-scid מאוד immunodeficientnull (ליקר) עכברים. תא צורב CRC נגזר PDX Orthotopically מוזרק תאים באופן עקבי טופס גידולים ראשוני חיובי עבור GFP בעכברים הנמען. יתר על כן, באופן ספונטני פיתוח micrometastatic מושבות לבטא GFP מזוהים בעיקר בריאות של עכברים אלה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. יתר על כן, intrasplenic הזרקה של CRC organoids לעתים קרובות מייצר הכבד מושבת. ממצאים אלה מצביעים יחדיו, על מתויג-GFP CRC PDX-derived תא צורב התאים להיות ויזואלית לזיהוי במהלך תהליך רב-שלבי, כינה את המפל הפלישה-גרורות. הפרוטוקולים שתואר כוללים הקמת PDXs של CRC האנושי והתרבות תלת-ממד לתאים המתאימים CRC תא צורב transduced על ידי חלקיקים lentiviral GFP.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

סרטן המעי הגס (CRC) הוא הסיבה המובילה השניה של סרטן מקרי מוות ברחבי העולם1. התגובה לא מספיק טיפולים קונבנציונליים של חולים עם מחלה בשלב מתקדם מציין לחוסר היעילות של ניסיונות לרפא באופן קיצוני CRCs. כדי לפתח גישות טיפוליות יעיל יותר, הוקמו דגמים פרה העכבר שונים של סרטן המחקים את המאפיינים של CRCs. שורות תאים שונים של CRC היה בשימוש נרחב ליצירת הגידול xenografts עקב שלהם נוחות וקלות תפעול. תרבות לטווח ארוך של שורות תאים סרטן, עם זאת, לעיתים קרובות גורמת הבחירה של אוכלוסיות תאים ייחודיות כי הם די proliferative תחת תנאי תרבות מסוימת, ובכך וכתוצאה מכך תוצאות לא אמין והמגבלות מכריע הסם פרה פיתוח.

מבלי בתרבית במבחנה, החולה נגזר הגידול xenografts (PDXs) גם שהיא נוצרה על-ידי ההשרשה לתוך מודלים חייתיים של רקמות CRC בניתוח גזור מן המטופלים-2,-3,-4. PDXs מזוהים באופן נרחב recapitulating histopathological התכונות הגדולות ולהציג שינויים גנטיים במקור בגידולים של החולים שממנו הם נשאבו. יתר על כן, organoids החולה נגזר הגידול מורכב של תאים סרטניים אשכולות הוקמו על ידי תרבות בתנאים תלת-ממד זה מקרוב ממש מחקה את תכונות ביולוגיות של5,גידולים המקורי6. אלה organoids הגידול הוחלו גם על תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה, ובכך לאפשר טיפולים אישית להיות מעוצב5. עם זאת, במידה ניכרת הטרוגנית CRC אוכלוסיות מנועות להיות נוכח בתוך הגידול בנפח גדול. אוכלוסיות CRC מסוים עשוי באופן סלקטיבי להתרבות והרחב במהלך הסדרה בתוך vivo ו- in vitro לקשרי של קטעים PDX, גידול organoids, בהתאמה. זה יכול גם לאפשר את הכולל ביטוי גנים פרופילים ואת מצב גנטי/אפי CRCs המושפע לשינוי, ובכך וכתוצאה מכך דמיון מינימלי ה-CRC הורים.

החולה-derived CRC organoids ואלה מופק לא סרטני המעי הגס האנושי מתוכנן הנמל גם יש כבר מועסקים שילובים של מוטציות oncogenic לחקור את גולת הכותרת של תאים סרטניים אנושיים כשניסחתי הגידול הפלישה, גרורות 68,7,,9. עם זאת, נמוך מאוד השכיחות של גרורות ספונטנית הנובעות orthotopic השרשה של החולה-derived CRC לתוך עכברים immunodeficient, הפכה אותו קשה ללמוד את תהליך רב-שלבי של המפל הפלישה-גרורות הכולל המקומי הפלישה, intravasation, תחבורה למחזור הדם, extravasation, קולוניזציה של איברים רחוקים4,10. Micrometastasis כמו המיוצג על-ידי הגידול בתצהיר תא של ≤2 מ"מ, שהוקמה על ידי המטופל, נגזר organoids CRC, לעתים קרובות התעלמו ניתוח histopathological של קטעים מן המושפעים איברים רחוקים במודלים של העכבר ניסיוני. ויזואליזציה של micrometastases ספונטנית היה גם מינימלי ויוו בשל הקושי ביעילות ידביקו סמני פלואורסצנט תאים סרטניים תא צורב לפני ההזרקה שלהם לתוך עכברים הנמען. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול ביעילות מגלי GFP lentivirus לתאי תא צורב CRC PDX-derived בתרבות 3D לפני זריקה לתוך עכברים הנמען ולאפשר זיהוי רגישה מאוד, העסקת מיקרוסקופ סטריאו-זריחה, של שלהם קולוניזציה של איברים שונים כדי טופס micrometastases.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

החולה מסופקים בכתב הסכמה מדעת, הפרויקט אושרה על ידי ועדת האתיקה המחקר של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת Juntendo. הניסויים העכבר אושרו גם על-ידי ועדת האתיקה של המחקר חיה של הפקולטה לרפואה Juntendo.

1. הקמת PDXs CRC בעכברים Immunodeficient

ניסיוני ההליכים להקמת CRC PDXs (שלב 1) מתוארים ב איור 1A.

  1. הכנת הרקמה CRC העיקרי מיד לאחר כריתה כירורגית של הגידול מן המטופל.
  2. שטיפת הרקמה CRC הראשי על-ידי עצבנות בעדינות מספר פעמים ב 30 מ של פוספט סטרילי כקרח במאגר צינור חרוטי 50 מ ל תמיסת מלח (PBS) ולשמור אותו בקרח.
  3. למקם את הרקמה על צלחת פטרי 10 ס מ באמצעות פינצטה סטרילי, להסיר את אזורי נמק בהרחבה ככל האפשר באמצעות מספריים סטרילי, הרקמות גידולים מוצקים לחתוך חתיכות קטנות (5 x 5 x 5 מ מ3 בגודל) באמצעות סכיני סטרילי.
    הערה: אזורי נמק לעיתים קרובות לבן, רך ומתפורר יותר מאשר והסביבה.
  4. מניחים את חתיכות קטנות של הגידול באמצעות פינצטה סטרילי ב 2 מ של PBS קר כקרח סטרילי על צלחת 6-. טוב.
  5. גזע 6 בת שבוע IL2Rγ הנד/שי-scid null (ריקו) מאוד immunodeficient עכברים בתנאים חינם פתוגן מסוים וחופשיתנבט.
  6. עזים ומתנגד העכברים עם שאיפה איזופלוריין באמצעות המכשיר הרדמה אינהלציה בעל חיים קטן, לחטא את העור עם 70% אתנול. מבטיח את קצב נורמלי ואת עומק הנשימה ואת העדר רפלקס קמצוץ הבוהן על ההרדמה המתאים. הוטרינר משחה על העיניים הוא אופציה, כדי למנוע יובש עינית תחת הרדמה.
  7. לעקר כל כלי ניתוח באמצעות חום יבש עיקור ולאחר מכן להשתמש בכלים אלה עבור כל שגרות כדי למנוע זיהומים בפצע בעכברים הנמען.
  8. הנח את העכבר anesthetized במצב של שכיבה על הספסל מעבדה. עושים חתך קטן על החלקים התחתונים של האגף הימני והשמאלי של העכבר הנמען ליצירת כיסים תת עורית להשתלה רקמות באמצעות מספריים סטרילי. הקפידו לא לנקב את קרום הצפק. צריך להיות דימום קטן עם הליך זה.
  9. בעדינות לטבול לעיל מוכן שברי הגידול לתוך 50 µL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותי, ואז שתל אותם לתוך החלקים התחתונים של הכיסים תת עורי מימין ומשמאל.
  10. תפר החתך עם הפצע קטעי בעכברים שעברו ניתוחים. ודא כי רקמות הגידול מושתל ממוקמים במרחק מה מן החתך מתחת לעור.
    הערה: בהתאם מזעור ניתוחים, טיפולים לא כאב לאחר ניתוח, זיהום נוהלו במחקר זה.
  11. הנח את העכבר על משטח חם ' ולשמור על תנוחת שכיבה בחזה ובצלעות, עד להכרה מספקת משוחזר. ברגע מלא התאושש מסוגל לשבת על-ארבע, ניתן להחזיר העכברים לכלובים שלהם הביתה. כדי למנוע טריפה, אינם מאפשרים גידול עם בעלי חיים שאינם המופעל באותו הכלוב.
  12. בדוק אם תפר דליפה, לאשר כי העכברים הם במצב יציב למחרת, בקבוצה שטופלו בניתוח. בדוק את העכברים סימנים של מחלה, למדוד את גודל הגידול בכל עכבר, פעם בשבוע, העסקת מחוגה.

2. ניתוח שגיאות CRC PDXs של עכברים

ניסיוני נהלי דיסקציה של CRC PDXs (שלב 2) מתוארים ב איור 1B.

  1. לאפשר את הגידול לגדול subcutaneously ~ 1 ס מ3 בגודל, אשר בדרך כלל לוקח כ 1 – 3 חודשים.
  2. עזים ומתנגד העכבר עם שאיפה איזופלוריין באמצעות המכשיר הרדמה אינהלציה בעל חיים קטן, לחטא את העור עם 70% אתנול.
  3. הנח את העכבר במצב של שכיבה על הספסל מעבדה. פצעים וחתכים בעור, לחשוף את הגידול, בזהירות לנתק את העור מן הגידול באמצעות מספריים סטרילי. לאחר הסרת הגידול, הנח אותו על 10 ס מ פטרי להסיר כל אזורי נמק רווחתה של הגידול, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 5 מ של PBS.
    הערה: אזורי נמק לעיתים קרובות לבן, רך ומתפורר יותר מאשר והסביבה.
  4. במקום הגידול על קרח, מחלקים אותו באותה מידה לפחות 4 חלקים עבור יישומים שונים לרבות 1) CRC תא צורב התרבות, 2) השתלת לתוך עכברים המשני, בדיקה היסטולוגית 3), 4) הקפאה ואחסון של השברים הגידול.
    1. עבור הדור של organoids CRC, במקום הרקמה גידולים מוצקים על צלחת פטרי 6 ס מ המכיל 1 מ"ל של PBS סטרילי. לשמור את הרקמה על הקרח עד עיבוד (שלב 3).
    2. להקים את המודל PDX עבור CRC האנושי, מעבר PDXs טריים של CRC לתוך עכבר משנית. חתוך את רקמת הגידול לחתיכות קטנות (5 x 5 x 5 מ מ3 בגודל) באמצעות סכיני סטרילי, בעדינות טבלו אלה שברי רקמת 50 µL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותי. לאחר מכן, שתל קטעים אלה לתוך החלקים התחתונים של הכיסים תת עורית הימני והשמאלי של העכבר את המשקה, כפי שמתואר בשלב 1.8-1.11.
    3. לצורך בדיקה היסטולוגית, לתקן את הדגימות ב 5 מ של פורמלין במאגר נייטרלי 10% 15 מ"ל צינור חרוטי בטמפרטורת החדר במשך יומיים.
    4. הקפאה קריוגנית, חתוך את רקמת הגידול לחתיכות קטנות (5 x 5 x 5 מ מ3 בגודל), בעדינות טבלו את הדגימות µL 500 של תא הקפאה פתרון 1-1.5 mL cryovial צינורות. לאחר מכן, העבר את הצינור מקפיא-80 ° C.

3. מיצוי של PDXs לתוך התליה תא לתרבות תא צורב CRC

ניסיוני נהלי דיסוציאציה של CRC PDXs (שלב 3) מתוארים ב איור 1B.

  1. מקום הגידול מוכן לעיל (שלב 2.4.1) קטעים על 10 ס מ פטרי.
  2. מינצ השברים באמצעות סכיני סטרילי ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 8 מ ל 10% עגל עוברית סרום (FCS)-בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) עם 80 µL של מניות אנזים collagenase (ראה טבלה של חומרים).
  3. סגור את הצינור בחוזקה, לעטוף את הכובע עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע דליפה. מביצועם השברים טחון הגידול לתוך התליה תא, להתסיס אותו בעדינות על 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. שימו לב כי עדיין יהיו קטעים רבים של רקמות מעוכל שנותרו בצינור.
  4. Centrifuge את הצינור ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע. לפתור בגדר התא באמצעות 10 מ"ל של 10% FCS-DMEM כדי להפוך התליה תא.
  5. כדי לסלק פסולת רקמות מעוכל, לסנן התליה תא פעמיים באמצעות מסננת תא את 40 µm על צינור חרוטי 50 מ. לאחר מכן, צנטריפוגה הזרימה דרך ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע ולשמור בגדר על קרח.

4. הדור של Organoids CRC תרבותי על מטריצה חוץ-תאית מלאכותי

ניסיוני נהלי התרבות תא צורב CRC של PDXs המעי הגס (שלב 4) מתוארים ב איור 1B.

  1. ליצור מדיום תרבות מתאים organoids נגזר PDX CRC (ראה טבלה של חומרים, "המדיום תרבות CRC תא צורב") העסקת מדיה שתואר קודם לכן עבור המעי הגס האנושי organoids11.
  2. החל µL 150 של מטריצה חוץ-תאית מלאכותיים (ראה טבלה של חומרים) לכל טוב על צלחת 12-טוב על קרח, ואז דגירה זה למשך 30-60 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מגשים לגבש את ג'ל.
  3. להשעות בגדר תא מהשלב 3.5 עם המדיום תרבות תא צורב CRC (מתוך שלב 4.1) עם 5% FCS להשגת התאמה 3 x 105 תאים/מ ל.... לאחר מכן, זרע 1 מ"ל של המדיום לצלחת מלאכותי חוץ-תאית מצופים מטריצה מוכן בשלב 4.2. דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2. השתמש hemocytometer של ספירת מספר תאים סרטניים כולל תאים בודדים ואשכולות multicellular (קבוצה של תאים חסיד) תא ההשעיה.
    הערה: 5% FCS משמש כדי להרוות את הפעילות האנזימטית מתרחשת שיורית של collagenase במחקר זה.
  4. בזהירות לאסוף המדיום תרבות, כולל צף התאים יש מנותקת מלאכותי חוץ-תאית מצופים מטריצה לצלחת, לתוך mL 1.5 צנטריפוגה צינור למחרת היום centrifuge זה ב 1,400 x g למשך 5 דקות. לאחר מכן, להסיר את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה ב 70 µL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותיים. בקרח.
  5. כדי להגביר את הכדאיות תא CRC, כיסוי את הגידול המכילות תאים מלאכותיים מטריצה חוץ-תאית אל תא צורב גידול תאים המצורפת הצלחת מלאכותי מצופים מטריצה חוץ-תאית, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מגשים לגבש הציפוי המלאכותי מטריצה חוץ-תאית. לאחר מכן, דגירה זה עם 1 מ"ל של המדיום תרבות CRC תא תא צורב עם 1% FCS ב 37 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 5% CO2.
  6. לשנות את המדיום תרבות בכל יום שני. כמו organoids CRC למלא את המדיום, זה יכול להיות צורך לשנות המדיום מדי יום.

5. דור והעשרה של חלקיקים Lentiviral GFP

ניסיוני נהלי דור והעשרה של חלקיקים lentiviral GFP (שלב 5) מתוארים ב איור 1C.

  1. התרבות תאים HEK293T עם רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני המכיל 10% FCS, להתכונן 10 ס מ 6 מנות (2 x 106 תאים לכל מנה) תרביות תאים בנוהל.
  2. עבור תרביות תאים לכל תבשיל, להכין µL 500 של תערובת µL 20 מהתרכובת תרביות תאים ב- DMEM עם PRRL-GFP וקטור (5 µg)12 כולל שני פלסמידים אריזה lentiviral, כגון pCMV-VSV-G (1 µg) ו- pCMV-dR8.2 dvpr (5 µg), ב- mL 1.5 סטרילי microtube. לשמור את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות ואז להוסיף לו על גבי כל אחת מהמנות ס מ-10, דגירה אותם עבור 18 h.
  3. להסיר את המדיום, הוסף 5 מ של טרי בינוני 1640 FCS-RPMI 10% על כל מנה, ולהשאיר במשך 24 שעות ביממה.
  4. לאסוף את המדיום ממוזגים של כל מנה לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל ולאחסן סך של 30 מ של המדיום ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הוסף 5 מ ל 1640 RPMI טריים על כל מנה ולהשאיר במשך 24 שעות ביממה.
  5. לאסוף את המדיום ממוזגים כל מנה לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ ל זכור, כי סה כ, 30 מ של המדיום על קרח. לאחר מכן, למחוק את התאים.
  6. לסנן 60 מ של המדיום (מתוך שלב 5.4 – 5.5) דרך מסנן מיקרומטר 0.45 להסיר התאים ולחלק כמות זו לתוך צינורות פוליפרופילן צנטריפוגה מ ל 12 עבור ultracentrifugation.
  7. להתרכז וירוס, centrifuge אותם באמצעות רוטור דלי מתנדנדים (ראה טבלה של חומרים) ב x 85,327 g עבור h 1.5-4 מעלות צלזיוס.
  8. להסיר לאלתר את המדיום. כדי לפתור את גלולה מרוכזת וירוס, מקום 250 µL של F-12 תערובת של חומרי מזון חזיר (F12) / DMEM בינונית ללא FCS כל העשר צינורות, לשמור על זה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שימו לב: הווירוס הצניפה לעתים קרובות בלתי נראה.
  9. בעדינות pipette של המדיום כדי לאסוף 3 מ"ל של מרוכז 5 x GFP lentivirus המניה, בסך הכל, יש להניח כולל GFP חלקיקים lentiviral עם 10 יחידות transducing8 מ ל (טו/mL). לאחר מכן, אחסן את microtubes 1.5 מ ל 12 (כולל µL 250 למחזור) תחת תנאים סטריליים ב-80 מעלות צלזיוס במשך שנה. להכין aliquots קטנים רבים של התמיסה המקורית כדי למנוע מספר מחזורים הפשרת ההקפאה.

6. תוויות של CRC תאים תא צורב עם GFP Lentiviral חלקיקים בתרבית על מטריצה חוץ-תאית מלאכותי

נהלי ניסיוני labelling התאים תא צורב CRC עם GFP lentivirus (שלב 6) מתוארים ב איור 1C.

  1. אפשר את organoids CRC מוכן בשלב 4.6 כדי לגדול ללא התערבות, במשך 7-10 ימים, לקצור אותם באופן מכני באמצעות מגרד תא סטרילי ולאחר מכן להעביר אותם לתוך microtube 1.5 מ.
    הערה: הצמיחה של CRC organoids בתרבות תלוי באופי של גידולים המקורי מחולים. למנוע צמיחת יתר של organoids שגיאות CRC, על ידי שמירה על אותם ב- 60-70% הנהרות מוקדמת להעביר ביחס פיצול של 1:2 לצלחת חדשה מלאכותי חוץ-תאית מצופים מטריצה 12-. טוב.
  2. Centrifuge את microtube למשך 3 דקות ב 1,400 x g, להסיר את המדיום תרבות ולפתור בגדר תא ב- 500 µL ל- PBS על-ידי הקשה עדין.
  3. Centrifuge את microtube למשך 3 דקות ב 1,400 x g ולמחוק PBS.
  4. לנתק את organoids CRC חסיד, להוסיף 500 µL של פתרון ניתוק התא של הפרוטאוליטי, אנזימים collagenolytic לתא הצניפה בצינור ומערבבים על-ידי הקשה עדין. לאחר מכן, יוצאים הצינורות להתפשר על 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מאוד בעדינות pipette התליה תא עם µL 500 נוספת של 1% FCS-DMEM מספר פעמים ב microtube 1.5 mL בערך מביצועם התאים. דור של תאים בודדים מ- organoids CRC מאת pipetting קשות מפחית במידה ניכרת תא הכדאיות. לכן חיוני לעזוב את המסה של התאים לזיהוי חזותי ההשעיה תא על-ידי בעדינות pipetting ב microtube 1.5 mL.
  6. Centrifuge התליה תא למשך 3 דקות ב 1,400 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
  7. לפתור בגדר תא בתערובת של µL 100 מניות lentivirus x GFP 5 (> 108 TU/mL) ו- 400 µL של המדיום תרבות CRC תא צורב microtube 1.5 mL על-ידי הקשה עדין כדי להסתגל ריכוז של 5 x 105 הפומבית תאים סרטניים לכל 500 µL . השתמש hemocytometer עבור ספירת מספר תאים סרטניים, כולל תאים בודדים וקבוצות של תאים ההשעיה תא, כפי שתואר לעיל (שלב 4.3).
  8. להכין מלאכותית חוץ-תאית מצופים מטריצה 12-ובכן צלחת, כפי שמתואר בשלב 4.2. ואז, במקום 500 µL של התליה תא מוכן בשלב 6.7 בצלחת ולהשאיר את זה עבור 18 h ב 37 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 5% CO2.
  9. לאסוף את המדיום עם התאים צפים מנותקת את הצלחת מלאכותי מצופים מטריצה חוץ-תאית לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 mL. Centrifuge זה ב 1,400 x g להסיר את תגובת שיקוע וגם מחדש להשעות את צניפה ב 70 µL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותיים. בקרח.
  10. להגדלת הכדאיות תא CRC, מכסים את הגידול המכילות תאים מלאכותיים מטריצה חוץ-תאית אל organoids הגידול צמוד לבסיס מלאכותי חוץ-תאית מצופים מטריצה 12-. ובכן, כפי שמתואר בשלב 4.5. בשלב הבא, דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 חממה כדי לחזק את ציפוי מלאכותי מטריצה חוץ-תאית, ואז תרבות זה עם 1 מ"ל של המדיום תרבות CRC תא צורב עם 1% FCS ב 37 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 5% CO2.
  11. לבחון את התאים ב- 3 ימים לאחר ההדבקה תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות לאשר כמעט 100% חיוביות GFP עקב השימוש כייל נוגדנים גבוה של חלקיקים lentiviral (ראה איור 2 א).
  12. תרבות organoids את CRC לתקופות של 7-10 ימים כדי להרחיב את גדילת התאים לפני זריקה לתוך עכברים הנמען.

7. דור של גרורות מאת CRC GFP שכותרתו Organoids בעכברים הנמען

הטיפול. הניסיוני לדור של גרורות באמצעות את organoids שאותה ניתן להתאים GFP CRC (שלב 7) מתוארים ב איור 1C.

  1. לנתק את organoids CRC GFP שכותרתו לתוך התליה תא, לקצור אותם באופן מכני באמצעות מגרד תא סטרילי ולהעביר אותם לתוך microtube 1.5 מ ל, כפי שתואר לעיל (שלב 6.1).
  2. Centrifuge את microtube למשך 3 דקות ב 1,400 x g, להסיר את המדיום תרבות, ולפתור בגדר תא ב- 500 µL ל- PBS על-ידי הקשה עדין.
  3. Centrifuge את microtube למשך 3 דקות ב 1,400 x g ולמחוק PBS.
  4. כיסוי µL 500 של הפתרון ניתוק התא אל בגדר תא בצינור ומערבבים אותו על-ידי הקשה עדין. אז תעזוב את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר enzymatically מביצועם organoids חסיד של שגיאות CRC, כפי שתואר לעיל (שלב 6.4).
  5. מאוד בעדינות pipette התליה תא עם µL 500 נוספת של 1% FCS-DMEM מספר פעמים ב microtube 1.5 mL בערך מביצועם התאים, כפי שתואר לעיל (שלב 6.5). דור של תאים בודדים מ- organoids CRC מאת pipetting קשות מפחית במידה ניכרת תא הכדאיות. לפיכך, יוצאים המסה של התאים לזיהוי חזותי ההשעיה תא על-ידי בעדינות pipetting ב microtube 1.5 mL.
  6. Centrifuge התליה תא למשך 3 דקות ב 1,400 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
  7. להקים מודל העכבר גרורות ספונטנית של CRC PDXs:
    1. להכין השעיה התא כולל 5 x 105 תאים µL 50 ל- PBS עם מטריצה חוץ-תאית מלאכותי 50% לכל העכבר. לשמור על התליה על הקרח לפני השימוש. השתמש hemocytometer עבור ספירת התאים הסרטניים, כפי שמצוין בשלב 4.3.
    2. עזים ומתנגד עכבר עם שאיפה איזופלוריין באמצעות המכשיר הרדמה אינהלציה בעל חיים קטן, לחטא את העור עם 70% אתנול, כפי שמצוין בשלב 1.6.
    3. הנח את העכבר NOG במצב פרקדן על הספסל מעבדה. רירית פי הטבעת עם פינצטה סטרילי ומשוך בעדינות אל מחוץ לפי הטבעת. לאחר מכן, להזריק מיד התליה תא מוכן בשלב 7.7.1 submucosa רקטלי של העכבר באמצעות מזרק (מחט גודל: 22 גרם). באופן שגרתי, 4-6 עכברים לכל קבוצה משמשות כדי להעריך את התוצאות.
  8. להקים מודל ניסיוני גרורה של CRC PDXs:
    1. להכין השעיה תא תא צורב CRC כולל 4 x 104 תאים ב- 50 µL ל- PBS לכל העכבר. לשמור על התליה על הקרח לפני השימוש. השתמש hemocytometer עבור ספירת התאים הסרטניים (שלב 4.3).
    2. עזים ומתנגד עכבר עם שאיפה איזופלוריין באמצעות המכשיר הרדמה אינהלציה בעל חיים קטן, לחטא את העור עם 70% אתנול, כפי שמצוין בשלב 1.6.
    3. הנח את העכבר ליקר anesthetized במצב של שכיבה על הספסל מעבדה. עושים חתך קטן על החלק התחתון של אגף השמאלי ולאחר מכן לחתוך את הצפק לחשוף בקפידה את הטחול באמצעות פינצטה ומספריים סטרילי. לתפוס את רקמת השומן המצורפת הטחול עם פינצטה סטרילי, ואז לאט לאט להחדיר µL 50 של התליה תא (להכין לעיל, שלב 8.1) לתוך הטחול. להיות בטוחים כי התליה תא מוזרק כראוי ללא זליגות כלפי חוץ הטחול. באופן שגרתי, עכברים 4 לכל קבוצה משמשות כדי להעריך את התוצאות.
  9. למקם כל העכברים על משטח חם לאחר הניתוח ולקיים בתנוחת שכיבה בחזה ובצלעות עד להכרה מספקת משוחזר, כפי שמתואר בשלב 1.11. ברגע העכברים יש החלימו לחלוטין, להחזיר אותם לכלובים שלהם הביתה. כדי למנוע טריפה, אינם מאפשרים גידול עם בעלי חיים שאינם המופעל באותו הכלוב.
  10. בדוק אם תפר זליגת ואשר העכברים. אתה בחיים, בקבוצה שטופלו בניתוח, למחרת. בדוק את העכברים סימנים של גודל הגידול מחלת ולמדוד, העסקת מחוגה, בעכברים כל פעם בשבוע.
  11. להתבונן עכברים לגילוי גרורות ספונטנית (לתקופות של עד 2.5 חודשים), ניסיוני גרורות (1 חודש) לאחר ההזרקה.
  12. להקריב את העכברים באמצעות הרדמה, נקע בצוואר הרחם הימים המצוין. לנתח גידולים העיקרי ורקמות שונים כולל הכבד, הריאות. מניחים את ביתור גידולים ואיברים 5 מ של PBS קר כקרח על 10 ס מ פטרי ולאחסן אותם על קרח.
  13. כדי לאתר תאים תא צורב CRC GFP-חיובית, להתבונן הרקמות ביתור תחת מיקרוסקופ סטריאו-זריחה. לרכוש תמונות עם מצלמת CCD והכן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה רגילה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אדנוקרצינומה העיקרי המעי הגס מאובחנים כבינוני הבדיל היה כבר resected בניתוח של נקבה בת 76 עם TNM סיווג, שלב IIIa, ואחריו כימותרפיה לאחר הניתוח. Immunohistochemically הראשית של תאים CRC מוכתם חיובי עבור carcinoembryonic אנטיגן, Ki-67, פאן-cytokeratin ו- E-קדהרין. חתיכות של הגידול resected היו גם subcutaneously מושתל לתוך המשקה עכברים לייצר את הדגם PDX של המעי הגס. CRC תא צורב תאים חולצו לאחר מכן לתרבות רקמות מן PDX המעי הגס אשר פיתח subcutaneously בעכברים אלו. Organoids CRC מסוגלים בעקביות להרכיב אשכולות multicellular במהלך סדרה של מעברים על מטריצה חוץ-תאית מלאכותי. כפי organoids הגידול בהיסטולוגיה גנטית לשקף מהות גידולים ראשי חולים5,6, ניסינו לפתח מודל העכבר שיאפשר ויוו זיהוי של CRC תא צורב תאים עם רגישות גבוהה במהלך הפצת גרורתי. כדי להשיג מטרה זו, CRC organoids היו נגועים lentivirus GFP, ובכך וכתוצאה מכך כמעט כל organoids מציג GFP בהיר מאוד (איור 2 א). Organoids אלה היו ולאחר מכן מוזרק orthotopically ו intrasplenically לתוך עכברים NOG משני לפני גילוי של GFP-חיוביות תאים באיברים מרוחקים תחת מיקרוסקופ זריחה. הבחנו היווצרות גידולים העיקרי GFP-חיובית באתר orthotopic בעכברים כל ארבע בחן (איור 2B, משמאל). יתר על כן, נמצאו גרורות מיקרוסקופיות של הריאות של שלושה מתוך ארבעה עכברים שנבדקו בגיל 2.5 חודשים לאחר זריקות orthotopic (איור 2B, באמצע). יתר על כן, גרורות בכבד נצפו בתגובה intrasplenic הזרקה לתוך כל ארבעה עכברים בחן-חודש לאחר הזריקות (איור 2B, נכון).

יחדיו, ממצאים אלה מציינים כי פלורסצנטיות GFP ברזולוציה גבוהה על תאים תא צורב CRC PDX-derived מאפשר זיהוי שלהם micrometastases ספונטני והן אלה שפותחו ניסיוניים, באיברים מרוחקים, כאשר הנמען עכברים. זה גילוי רגישות גבוהה של ה disseminating CRC נגזר PDX organoids ויוו מציע גם מודל רב תכליתי לא רק לימוד הביולוגיה של גרורות הגידול, אלא גם לפיתוח טיפולים ממוקדים בהגדרת פרה.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של הדור של גרורות מאת organoids CRC PDX-derived המסומנת GFP lentivirus בעכברים NOG. (א) השתלה של חתיכות קטנות של הרקמה CRC subcutaneously לתוך המשקה עכברים (שלב 1). הרקמה CRC בניתוח גזור מן המטופל היה לחתוך לחתיכות, מושתל subcutaneously לתוך המשקה עכברים. ש: השתלה תת עורית. (B) דור של CRC organoids לזהויות PDXs (שלב 2 – 4). Xenografts CRC שפותחו היו טחון (שלב 2) והועבר לתוך צינור 15 מ"ל המכיל המדיום תרבות כולל collagenase (שלב 3). לאחר דגירה עם עצבנות איטי, התליה תא CRC היה מסונן (שלב 3). לאחר מכן, התליה תא תא צורב במדיום תא צורב CRC היה נזרע על גבי צלחת מלאכותי מצופים מטריצה חוץ-תאית, מודגרות ללון בחממה2 CO (שלב 4). התאים תא צורב CRC המצורפת של מטריצה חוץ-תאית מלאכותיים היו גם מצופים מטריצה חוץ-תאית מלאכותיים נוספים, מתפשט בתוך חממה2 CO (שלב 4). ש: השתלה תת עורית. (ג) דור של CRC organoids transduced על ידי חלקיקים lentiviral GFP לפני העסקת הזרקה לתוך הנמען עכברים (שלב 5 – 7). החלקיקים lentiviral GFP היו שנוצר עם כייל נוגדנים גבוה (שלב 5). Organoids CRC PDX-derived גדל על מטריצה חוץ-תאית מלאכותי היו ישירות שנקטפו עם במגרדת תא והועבר לתוך microtube (שלב 6). לאחר צנטריפוגה, בגדר תא היה מושעה מחדש ב- PBS. התליה תא היה centrifuged, בגדר תא היה חלופה מועדפת. לאחר מכן, התליה תא תא צורב CRC נדגרה עם GFP מניות וירוס של המדיום תרבות תא צורב CRC בצלחת מלאכותי חוץ-תאית מצופים מטריצה לילה בחממה2 CO (שלב 6). התאים תא צורב CRC המצורפת של מטריצה חוץ-תאית מלאכותיים היו מצופים מטריצה חוץ-תאית מלאכותיים נוספים, מודגרות ב חממה2 CO שבמהלכו הציפוי המלאכותי מטריצה חוץ-תאית (שלב 6). Organoids CRC היו אז תרבותי לתקופות של 7-10 ימים כדי להרחיב את צמיחת תאים (שלב 6). לפתח מודל גרורות ספונטנית, הוזרקו dissociated 5 x 105 CRC תא צורב התאים בלוחיות GFP הושעו ב- 50 µL ל- PBS עם מטריצה חוץ-תאית מלאכותי 50% orthotopically לתוך המשקה עכברים (שלב 7). כדי ליצור מודל ניסיוני גרורות, 4 x 104 CRC תא צורב תאים עם GFP בפורטוגלית µL 50 ל- PBS הוזרקו intrasplenically לתוך המשקה עכברים (שלב 7). שעות נוספות: הזרקת orthotopic, i.s.: הזרקת intrasplenic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ויזואליזציה להדפסה ברזולוציה גבוהה של GFP זוהה תרבותי CRC GFP שכותרתו organoids, גידולים הראשי, micrometastases. (א) כמעט 100% organoids CRC בתרבית הם GFP חיובי. התמונות נלקחו בשבי באמצעות מיקרוסקופ סטריאו-זריחה. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. (B) GFP-חיוביות הגידול העיקרי, micrometastases בתוך הריאות והכבד. המתלה תא dissociated לבטא-GFP CRC תא צורב היה מוזרק submucosa רקטלי (שעות נוספות inj.) של עכברים NOG. הרוב המכריע של תאים סרטניים מוצגים להיות חיובי עבור GFP ב הגידול העיקרי. המפה מראה גם GFP-חיוביות micrometastases colonizing הריאות (מסומן על ידי חץ). יתר על כן, ה-GFP-חיוביות micrometastases מזוהים בכבד (מסומן על ידי חץ), כאשר התליה תא היה intrasplenically מוזרק (i.s. inj.) עכברים. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

למרות דגם CRC PDX כבר מועסקים נרחב ללמוד הגידול העיקרי, אם המודל הזה הוא גם ישים חוקרת גרורות הגידול יש לא עדיין היה מלא מבואר. גרורות ספונטנית היו גם בקושי לזיהוי הכבד, הריאות של שונים דווח על המעי הגס PDX מודלים4,10. כדי לזהות micrometastases עם רגישות גבוהה, פיתחנו פרוטוקול עבור transducing חלקיקים lentiviral GFP לתוך organoids CRC נגזר PDX לפני שלהם orthotopic, זריקות תוך ורידי לתוך עכברים הנמען. ראוי לציין, הצלחנו להראות כי שיטה זו מאפשרת זיהוי רגישה מאוד של CRC תא צורב, נגזר micrometastases, ויוצרים שניהם באופן ספונטני ולא ניסיוניים, באיברים מרוחקים.

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול כוללים שמירה על היווצרות ספרואיד שלם בלי אינדוקציה של anoikis על מטריצות מלאכותי על ידי בעדינות pipetting את organoids CRC במהלך הסדרה passaging. הכנת כייל נוגדנים גבוה lentivirus חלקיקים מרוכז על-ידי ultracentrifugation הוא גם חשוב להשגת את כמעט 100% GFP הגישה החיובית של CRC organoids. יתר על כן, מומלץ כי organoids CRC GFP שכותרתו להיות מוזרק בתוך 10-14 ימים עכברים הנמען. תקופות ארוכות בצורה מוגזמת להרחבת organoids CRC לאחר ההדבקה עשוי להעדיף מבחר organoids חלש לבטא-GFP.

ההזרקה של CRC organoids לתוך submucosa רקטלי של ליקר עכברים הראה שלהם הפצתו גרורות לריאות, אבל לא לתוך הכבד, ככל הנראה דרך הכלילי התחתון. ליצירת גרורות בכבד באופן ספונטני, הזרקה של CRC organoids לתוך המעי הגס עם פתיחת בטן יהיה צורך13.

שימו לב: השכיחות של לימפומות B cell הוא לעיתים מוגברת בעכברים immunodeficient NOG. מושתל רקמות כולל לימפוציטים, נגוע oncovirus אפשטיין-בר, מ בחולים אנושיים14. לכן זה הגיוני להמליץ כי אם מתפתחים גידולים שמקורם ה-CRC האנושי מושתל להיקבע על-ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה באמצעות האדם סמנים תא CRC, כגון carcinoembryonic אנטיגן cytokeratin 20.

כפי חקרנו CRC organoids נגזר רק מטופל. אחד, דגימות נוספות של מספר גדול של חולים צריכים להיבדק כדי להכליל את הממצאים שלנו בעתיד. אם מושתל CRC נגזר PDX organoids להראות צמיחה מזערית באתר orthotopic, ולעתים רחוקות טופס גרורות באתרים מרוחקים, חוקרים נקראים לשקול חילוץ CRC organoids מ- PDXs החולה-derived שונים.

זיהוי GFP שכותרתו micrometastasis מושגת באמצעות שיטה זו רגישה מאוד מעודדת אותנו לא רק כדי להמשיך לחקור מספר נושאים ביולוגיים לגבי המעבר של micrometastasis כדי macrometastasis, היווצרות סטרומה נישה עבור קולוניזציה גרורתי ורכישה של עמידות לתרופות, אלא גם כדי להעריך את efficacies של תרופות נוגדות סרטן רומן על ידי העסקת PDX מניבי חיות כמו במודלים פרה.

ה-GFP FACS-מיון לפי החיים organoids CRC שחולצו מן הראשית ואתרים מרוחקים גם יש הפוטנציאל לאפשר בחינות מבוססת תא יחיד של הביטויים ג'ין, כמו גם את הפרופילים epigenetic, metabolomic, של הגידול. ממצאים כאלה עשויים להוביל הבהרה של המנגנונים המולקולריים שבבסיס גרורתי הפצת organoids CRC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אין פוטנציאל ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Juntendo אוניברסיטת יאנג החוקר בפרס (2013, 2014 2015) בן, את משותפת פרוייקט פרס (2013 ו- 2014) ק מ, ומענקים בסיוע למחקר מדעי של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, טכנולוגיה, יפן (16 15625 K כדי י' ק' ו- 16K 15598 ל מ. ג). אנו מודים במיוחד לכל חברי החוג לכירורגיה Coloproctological של פתולוגיה מולקולרית שימושי לדיונים ותמיכה טכנית. אנו מודים גם ד ר הירויוקי Konno (המלונות בהם צפיתי אוניברסיטת Schoolof ברפואה) ואת ד ר הידקי קיטאג'ימה (אוניברסיטת הבינלאומי לבריאות ורווחה) להדרכה טכני נדיב הניתוחים להשתלה orthotopic לתוך עכברים, ד ר. Yoshitaka היפו (מרכז הסרטן צ'יבה) לקבלת ייעוץ טכני אודות ביצוע התרבות תא צורב הגידול.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions
wound clips
2×10mm
Natsume manufacturing, Japan #C-21-S Autoclave before use
Hamilton syringe
needle size:22 gauge
Tokyo Science, Japan Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.
6-well plate BMBio #92006
12-well plate BMBio #92412
15ml conical tube Sumitono Bakelite MS-57150
50ml conical tube Sumitomo Bakelite MS-57500
microtube Eppendorf #0030120086 Autoclave before use
Hemocytometer Erma #03-202-1
40μm cell strainer Corning #352340
Matrigel basement membrane matrix Corning #354234 Store aliqupts at -20°C.
Place on ice until use
Collagenase type 1 Sigma #C1030 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year
Accutase Innovate Cell Technologies #5V2623A Store at 4°C.
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ Gibco #10565018 Store at 4°C. Warm at 37°C before use
Cell banker 1plus ZENOAQ #628 Store at 4°C. Use within 1 month
Penicillin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
Streptomycin Gibco #15140122 Store at 4°C. Use within 1 month
hEGF PEPROTECH #AF-100-15 Store at -20°C. Add to medium on same day as use
Y27632, a ROCK inhibitor Wako #253-00591 Store at -20°C. Add to medium on
same day as use
Culture medium Gibco DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin.
Store at 4°C. Use within 1 month.
CRC organoid culture medium
with 1% or 5% FCS
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor.
Store at 4°C. Use within 1 month.
the FuGENE 6 transfection regent Roche 11814 443001
Minisart 0.45 µm filter Sartorius stedim 17598-K
5 ml polypropylene centrifuge tubes Beckman Coulter 326819
PRRL-GFP vector Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-VSV-G Gift from Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr Gift from Dr. Robert A. Weinberg
the SW55Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64, (2), 104-117 (2014).
  2. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4, (9), 998-1013 (2014).
  3. Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15, (5), 311-316 (2015).
  4. Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19, (24), 6787-6801 (2013).
  5. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161, (4), 933-945 (2015).
  6. Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18, (6), 827-838 (2016).
  7. Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (12), E2357-E2364 (2017).
  8. O'Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35, (6), 577-582 (2017).
  9. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35, (6), 569-576 (2017).
  10. Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (26), 12085-12089 (1995).
  11. Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (27), 11127-11132 (2013).
  12. Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68, (10), 3645-3654 (2008).
  13. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170, (3), 1077-1085 (2007).
  14. Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63, (3), 289-296 (2014).
רגישות גבוהה זיהוי של Micrometastases שנוצרו על-ידי Organoids Lentivirus transduced GFP תרבותי מגידול נגזר המטופל הגס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).More

Okazawa, Y., Mizukoshi, K., Koyama, Y., Okubo, S., Komiyama, H., Kojima, Y., Goto, M., Habu, S., Hino, O., Sakamoto, K., Orimo, A. High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor. J. Vis. Exp. (136), e57374, doi:10.3791/57374 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter