For at svært følsom påvisning av formidle menneskelige kolorektal kreft (CRC) celler kolonisere vev, viser vi her en protokoll for effektiv signaltransduksjon grønne fluorescerende protein (GFP) lentiviral partikler i PDX-avledet CRC organoid celler før deres injeksjon i mottakerens mus, med stereo-fluorescens mikroskopiske observasjon.
Til tross for gjeldende fremskritt i menneskelig tykktarmskreft (CRC) behandling er noen radikale behandlingsformer effektive for de senere fasene av CRC. Å overvinne denne kliniske utfordringen, svulst xenograft musen modeller av veletablert menneskelige karsinom linjer og mange transgene musen modeller med svulster er utviklet prekliniske modeller. De etterligner delvis funksjonene i menneskelig kreftsvulster, men ofte ikke recapitulate nøkkelen aspektene ved menneskelig malignitet inkludert invasjon og metastasering. Dermed har alternative modeller som bedre representerer ondartet progresjon i menneskelig CRC lenge vært ventet.
Her viser vi generasjon av pasient-avledede svulst xenografts (PDXs) av subkutan implantasjon av små CRC kirurgisk dissekert fra en pasient. Kolon PDXs utvikle og histopathologically ligner CRC hos pasienten. Men er noen spontan micrometastases i konvensjonelle tverrsnitt av berørte fjerne organer i PDX modellen. For å lette oppdagelsen av metastatisk spredning i fjerne organer, vi hentet organoid kreftceller fra kolon PDXs i kultur og infisert dem med GFP lentivirus før injeksjon i svært immunodeficient hilsen/Shi-scid IL2Rγnull (NOG) mus. Orthotopically injisert PDX-avledet CRC organoid celler konsekvent skjemaet primære svulster positiv for GFP i mottakerens mus. Videre utvikler spontant micrometastatic kolonier uttrykke GFP oppdages særlig inne lungen av disse musene av fluorescens mikroskopi. Videre produserer intrasplenic injeksjon av CRC organoids ofte hepatic kolonisering. Sammen viser disse funnene GFP-merket PDX-avledet CRC organoid celler å være visuelt synlig under må kalles invasjonen-metastasering kaskade. Beskrevet protokollene inkluderer etablering av PDXs av menneskelig CRC og 3D kultur tilsvarende CRC organoid cellene transduced av GFP lentiviral partikler.
Tykktarmskreft (CRC) er den andre ledende årsaken til kreft dødsfall verden1. Utilstrekkelige svaret konvensjonell terapi for pasienter med avansert stadium sykdom angir ineffectiveness av forsøk på å kurere radikalt CRC. For å utvikle mer effektive behandlingsmetoder, er ulike prekliniske musen modeller av kreft som etterligner egenskapene til CRC etablert. Ulike CRC linjer har vært mye brukt til å generere svulst xenografts på grunn av sin bekvemmelighet og brukervennlighet manipulasjon. Langsiktig kultur kreftcelle linjer, men fører ofte utvalg av unike celle populasjoner som er ganske proliferativ under en bestemt kultur tilstand, og dermed resulterer i upålitelige resultater og avgjørende begrensninger i preklinisk narkotika utvikling.
Uten å være kulturperler i vitro, har pasient-avledede svulst xenografts (PDXs) også blitt generert av implantasjon i dyremodeller av menneskelig CRC vev kirurgisk dissekert pasienter2,3,4. PDXs er anerkjent som recapitulating histopathological hovedfunksjonene og genetiske endringer opprinnelig stede i svulster av pasientene som de var avledet. Videre består pasient-avledede svulst organoids av svulst celle klynger ble etablert av kultur under 3D forhold som tett etterlignet biologiske egenskapene til den opprinnelige svulster5,6. Disse svulst organoids ble også brukt til høy gjennomstrømming narkotikarelaterte screening, og dermed slik at personlig terapi for å være utformet5. Imidlertid markert heterogene CRC bestander antas for å være til stede i en svulst masse. Bestemt CRC befolkninger kan selektivt spre og utvide under den i vivo og i vitro rekke passasjer PDX og tumor organoids, henholdsvis. Dette kan også tillate samlede genet uttrykket profiler og epi/genetisk statusen for den berørte CRC endre, og dermed resulterer i minimal likhet med foreldrekontroll CRC.
Pasient-avledede CRC organoids og de Hentet fra noncancerous menneskelige kolon konstruert til harbor kombinasjoner av kreftfremkallende mutasjoner har også vært ansatt å undersøke kjennemerkene til menneskelig kreftceller eksemplifisert ved svulst invasjon og metastasering 6,7,8,9. Men har svært lave forekomsten av spontane metastasering fremkommer fra orthotopic implantering av pasient-avledede CRC i immunodeficient mus, gjort det vanskelig å studere må prosessen med invasjonen-metastasering kaskade som inkluderer lokale invasjon, intravasation, transport i blodet, bloduttredelse og kolonisering av fjerne organer4,10. Micrometastasis som representeres av svulst celle deponering av ≤2 mm, dannet av pasient-avledede CRC organoids har ofte blitt oversett på histopathological analyse av inndelinger fra berørte fjerne organer i eksperimentell musen modeller. Visualisering av spontan micrometastases har også vært minimal i vivo på grunn av vanskelighetene med effektivt presenterer fluorescerende markører i organoid kreftceller før deres injeksjon i mottakerens mus. I denne studien vi utviklet en protokoll å effektivt transduce GFP lentivirus i PDX-avledet CRC organoid celler i 3D kultur før injeksjon i mottakerens mus og å tillate svært følsom oppdagelsen, ansette stereo-fluorescens mikroskopi, av deres koloniseringen av ulike organer til skjemaet micrometastases.
Selv om CRC PDX modellen har vært viden ansatt å studere primære tumor vekst, om denne modellen er også gjelder undersøker svulst metastasering har ennå ikke fullt utredet. Spontan metastaser var knapt synlig i leveren og lungene ulike rapporterte kolon PDX modeller4,10. For å oppdage micrometastases med høy følsomhet, utviklet vi en protokoll for transducing GFP lentiviral partikler i PDX-avledet CRC organoids før deres orthotopic og intravenøs injeks…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Juntendo University unge etterforsker prisen (2013, 2014 og 2015) yo, felles prosjekt prisen (2013 og 2014) til K. M., og gir i støtte til forskning fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og Teknologi, Japan (16K 15625 å Y. K. og 16K 15598 til M.G.). Vi er spesielt takknemlig for alle medlemmer av Institutt for Coloproctological kirurgi og molekylære patologi for nyttig diskusjoner og kundestøtte. Vi takker også Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University School medisin) og Dr. Hideki Kitajima (International University for helse og velferd) for sjenerøs teknisk veiledning i kirurgiske prosedyrer for orthotopic implantasjon til mus og Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) for tekniske råd om utføre svulst organoid kultur.
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
6-well plate | BMBio | #92006 | |
12-well plate | BMBio | #92412 | |
15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |