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Biochemistry

ऊतक की न्यूनतम मात्रा का उपयोग Drosophila के Permeabilized फाइबर में Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का मापन

Published: April 7, 2018 doi: 10.3791/57376
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton
* These authors contributed equally

Summary

इस पत्र में, Drosophila के permeabilized thoraxes में उच् च संकल् respirometry का प्रयोग करते हुए ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए एक विधि बताई गई है । इस तकनीक को क्लासिक mitochondrial अलगाव तकनीक की तुलना में ऊतक की एक ंयूनतम राशि की आवश्यकता है और प्राप्त परिणाम अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं ।

Abstract

फल मक्खी, Drosophila melanogaster, चयापचय के अध्ययन के लिए एक उभरते मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है । दरअसल, drosophila मानव अंगों के लिए मुताबिक़ संरचनाओं है, अत्यधिक संरक्षण चयापचय रास्ते के अधिकारी और एक अपेक्षाकृत कम उंर है कि समय की एक छोटी अवधि में विभिंन बुनियादी तंत्र के अध्ययन की अनुमति देता है । यह है, तथापि, आश्चर्य की बात है कि सेलुलर चयापचय के लिए आवश्यक तंत्र में से एक, mitochondrial श्वसन, अच्छी तरह से इस मॉडल में जांच नहीं की गई है । यह संभावना है क्योंकि Drosophila में mitochondrial श्वसन के उपाय आम तौर पर व्यक्तियों की एक बहुत बड़ी संख्या की आवश्यकता है और प्राप्त परिणाम अत्यधिक reproducible नहीं हैं । यहां, Drosophila से ऊतक की ंयूनतम मात्रा का उपयोग कर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का सटीक माप की अनुमति विधि वर्णित है । इस विधि में thoraxes और permeabilized दोनों यांत्रिक रूप से तेज संदंश और saponin के साथ रासायनिक, कोशिका झिल्ली को पार करने के लिए विभिन्न यौगिकों की अनुमति और mitochondrial श्वसन का नियमन कर रहे हैं । permeabilization के बाद, एक प्रोटोकॉल के लिए इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली (ETS) के विभिंन परिसरों की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए विभिंन सब्सट्रेट ऑक्सीकरण, साथ ही साथ अपनी प्रतिक्रिया के लिए किया जाता है एक unयुग्मक और कई अवरोधकों के लिए । इस विधि mitochondrial अलगाव का उपयोग कर तरीकों की तुलना में कई लाभ प्रस्तुत करता है, क्योंकि यह अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है क्योंकि mitochondria अभी भी अंय सेलुलर घटकों के साथ बातचीत कर रहे है और mitochondrial आकृति विज्ञान संरक्षित है । इसके अलावा, नमूना तैयारी तेजी से कर रहे हैं, और प्राप्त परिणाम अत्यधिक reproducible हैं । mitochondrial श्वसन के मूल्यांकन के साथ चयापचय के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में Drosophila के लाभ के संयोजन से, महत्वपूर्ण नए अंतर्दृष्टि का अनावरण किया जा सकता है, खासकर जब मक्खियों अलग पर्यावरण या pathophysiological का सामना कर रहे है शर्तों.

Introduction

फल मक्खी, Drosophila melanogaster, एक सदी1से अधिक के लिए आनुवंशिक अनुसंधान के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है । इस जीव का अध्ययन न केवल सेक्स के बारे में महत्वपूर्ण मौलिक ज्ञान के लिए नेतृत्व किया है विरासत2, उत्परिवर्तन दर3, तंत्रिका तंत्र के विकास और सेल भाग्य निर्धारण4, लेकिन यह भी हाल ही में एक के रूप में उभरा महत्वपूर्ण उपकरण जैसे अल्जाइमर और पार्किंसंस5,6के रूप में कई रोगों के लिए अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए । इसके अलावा, यह उंर बढ़ने की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल है, क्योंकि वे समय की एक छोटी अवधि में बड़ी संख्या में उठाया जा सकता है और एक छोटी उंर है । वे भी मानव अंगों को मुताबिक़ संरचनाओं के अधिकारी, जैसे एक दिल, oenocytes (hepatocyte की तरह कोशिकाओं), वसा शरीर (जिगर और सफेद वसा ऊतक के रूप में इसी तरह कार्य), इंसुलिन का उत्पादन कोशिकाओं (β-अग्नाशय कोशिकाओं के बराबर), के रूप में अच्छी तरह के रूप में hemolymph परिवहन चयापचयों (रीढ़ के रक्त के अनुरूप)7। इसके अलावा, मध्यस्थ चयापचय के केंद्रीय मार्ग (सहित इंसुलिन/इंसुलिन की तरह विकास कारक-संकेतन मार्ग और Rapamycin-टो रास्ते के लक्ष्य) भी अत्यधिक संरक्षण कर रहे हैं7. इन कारणों के लिए, Drosophila हाल ही में मौलिक तंत्र है कि नियंत्रण चयापचय, विशेष रूप से रोग की स्थिति में इस तरह के मधुमेह के रूप में मानव चयापचय रोगों के लिए निहित का वर्णन करने के लिए शोषण किया गया है8। चयापचय का एक प्रमुख घटक mitochondrion है कि कई रास्ते को एकीकृत करता है और जीवन की सबसे महत्वपूर्ण जैविक कार्यों में से एक है, एटीपी उत्पादन, ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण प्रक्रिया (OXPHOS) के माध्यम से । जीव के चयापचय में उनकी केंद्रीय भूमिका को ध्यान में रखते हुए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि mitochondrial रोग पार्किंसंस की9 और अल्जाइमर रोगों की तरह कई रोगों में शामिल कर रहे हैं10, के रूप में अच्छी तरह के रूप में पेशीशोषी पार्श्व में स्केलेरोसिस 11 , 12. वे भी उंर बढ़ने की प्रक्रिया के मौलिक निर्धारक हैं । दरअसल, वे सेल में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के मुख्य निर्माता हैं, जो ऑक्सीडेटिव हर्जाना11के माध्यम से उच्च एकाग्रता पर कोशिका के लिए हानिकारक हो सकते हैं । उंर बढ़ने भी क्षतिग्रस्त या रूपांतरित mitochondrial डीएनए के संचय के लिए संबद्ध किया गया है13, mitophagy रोग14,15 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mitochondrial उत्पत्ति16की हानि । Mitochondria भी है सेल homeostasis के प्रमुख निर्धारकों के रूप में वे विभिंन सब्सट्रेट का उपयोग करने के लिए बहुतायत या macronutrients17,18की कमी के अनुसार कई सेलुलर कार्यों को समायोजित कर सकते हैं ।

दरअसल, आहार में विभिन्ना पोषक तत्व (कार्बोहाइड्रेट, लिपिड और प्रोटीन) पचता, अवशोषित और कोशिकाओं में पहुँचाया जाता है. वे तो cytosol में तब्दील हो जाते हैं, और व्युत्पंन सब्सट्रेट mitochondrial मैट्रिक्स में ले जाया जाता है जहां वे बराबरी को कम करने का उत्पादन, जैसे नध और फॊध219. ये कम करने के समकक्ष तो इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली (ETS) के विभिंन एंजाइमी परिसरों से ऑक्सीकरण हो रहे हैं । इन परिसरों में mitochondrial भीतरी झिल्ली, जैसे जटिल मैं और जटिल द्वितीय में एंबेडेड हैं । इसके अतिरिक्त, अंय एंजाइमी परिसरों जैसे mitochondrial ग्लिसरॉल-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज और डिहाइड्रोजनेज के लिए वैकल्पिक मार्गों में इलेक्ट्रॉनों की प्रविष्टि के लिए ETS20,21का प्रतिनिधित्व करते हैं । इन ' विकल्प ' परिसरों कीड़ों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, प्रजातियों के अनुसार के रूप में, वे सक्रिय रूप से श्वसन20,22,23,21को बढ़ाने के लिए भाग ले सकते हैं । इन ETS खिला प्रणालियों से इलेक्ट्रॉनों ubiquinone को हस्तांतरित कर रहे है और बाद में जटिल III के लिए, और फिर जटिल चतुर्थ करने के लिए, अंतिम स्वीकारकर्ता, आणविक ऑक्सीजन तक । यह इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण इनर mitochondrial झिल्ली भर में एक प्रोटॉन-मकसद बल उत्पंन करता है परिसर V में एटीपी के लिए ADP के फास्फारिलीकरण ड्राइविंग (चित्रा 1) । सेल के homeostasis में mitochondria की केंद्रीय भूमिका को ध्यान में रखते हुए, mitochondrial चयापचय का अध्ययन प्रासंगिक मॉडल डी. melanogaster का उपयोग करते हुए विभिन्न चित्रित के अंतर्निहित तंत्रों को pathophysiological करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है शर्तों या सेलुलर और पर्यावरण तनाव के तहत । आश्चर्य की बात है लेकिन, केवल अध्ययन के एक मुट्ठी भर वास्तव में Drosophila24,25,26में mitochondrial श्वसन मापा । दरअसल, प्रयोगों mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का मूल्यांकन करने के लिए लक्ष्य mitochondria के अलगाव की आवश्यकता है । हालांकि अलग mitochondrial कार्यों की माप के लिए लाभप्रद (जैसे ROS उत्पादन या mitochondrial दक्षता के मार्कर के रूप में पी/ओ अनुपात27,28), इन अलगाव आम तौर पर बल्कि बड़ी मात्रा की आवश्यकता कई व्यक्तियों24,29से ऊतक के । ऊतक और व्यक्तियों की उच्च मात्रा के लिए यह आवश्यकता एक महत्वपूर्ण सीमित कारक है, विशेष रूप से विचार है कि सभी व्यक्तियों को एक ही उंर और प्रयोगों के लिए एक ही लिंग के अधिमानतः होना चाहिए, अलग समय पर श्वसन के उपाय कर अंक श्रमसाध्य पर उत्तम । इसके अलावा, जबकि mitochondrial अलगाव mitochondrial चयापचय गवर्निंग बुनियादी तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, mitochondria को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों replicable परिणाम प्राप्त करने के लिए कठिनाई के रूप में कई कमियां है , mitochondrial नेटवर्क के विघटन, और mitochondrial संरचना और समारोह में परिवर्तन29,30,31।

इस अध्ययन का उद्देश्य Drosophila में mitochondrial ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल वर्तमान बहुत कम व्यक्तियों से ऊतक का केवल एक ंयूनतम राशि का उपयोग कर रहा है । इस प्रोटोकॉल को मापने के होते है सीटू में mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का उपयोग कर permeabilized मांसपेशी फाइबर29 Drosophila thoraxes से उच्च संकल्प respirometry32,33के साथ संयोजन में, 34 , 35. इस विधि के साथ ही mitochondrial संरचना और फ़ंक्शन अधिक संरक्षित हैं permeabilized में सेल के अन्य घटकों के साथ बातचीत के बाद से क्लासिक mitochondrial आइसोलेशन विधि की तुलना में भी अतिरिक्त लाभ है 29फाइबर,31,36, जो इस दृष्टिकोण को और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक बनाता है । इस प्रोटोकॉल के साथ, mitochondrial कार्यों सही Drosophila के केवल तीन thoraxes में उच्च संकल्प respirometry का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, सब्सट्रेट ETS के कई विभिन्न चरणों में ऑक्सीजन की खपत के निर्धारण की अनुमति के साथ. इसलिए, इस प्रोटोकॉल मदद कर सकता है बुनियादी तंत्र है कि Drosophila मॉडल का लाभ लेने के द्वारा कई पर्यावरणीय या pathophysiological शर्तों के संदर्भ में नियंत्रण चयापचय के बारे में महत्वपूर्ण सवालों का जवाब ।

ETS के कई विभिंन चरणों में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए और मूल्यांकन कैसे विभिंन सब्सट्रेट श्वसन, विभिंन सब्सट्रेट (चित्रा 1), unयुग्मक, और अवरोधकों के लिए योगदान के permeabilization के बाद30 का उपयोग कर रहे है ऊतक. विशेष रूप से, विभिन्न सब्सट्रेट के अनुक्रमिक जोड़ ETS के विभिन्न परिसरों के माध्यम से इलेक्ट्रॉनों के प्रवेश को प्रोत्साहित करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. एक uncarbonyl, साइनाइड 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), तो इष्टतम एकाग्रता को मापने के लिए गैर-संवेदनाएं, यानी, गैर phosphorylating श्वसन के लिए अधिक से अधिक ऑक्सीजन की खपत को प्रेरित में जोड़ा है । परिसरों मैं, द्वितीय और III के अनुक्रमिक संकोच तो अवशिष्ट ऑक्सीजन की खपत है कि गैर ETS ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाओं के कारण है की निगरानी करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । अंत में, जटिल चतुर्थ अधिकतम श्वसन क्षमता के इंजेक्शन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता n, n, n ', n,-Tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD), एक कृत्रिम इलेक्ट्रॉन प्रदाता, और ascorbate. यह ध्यान रखें कि प्रयोगों 24 डिग्रीसी पर आयोजित कर रहे है क्योंकि यह तापमान जिस पर मक्खियों उठाया है महत्वपूर्ण है ।

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Protocol

1. रिएजेंट्स तैयारी

  1. विच्छेदन और ऊतक के permeabilization के लिए निम्नलिखित समाधान तैयार करें ।
    1. संरक्षण समाधान तैयार: २.७७ mM कैक२EGTA, ७.२३ mm k2EGTA, ५.७७ mm na2एटीपी, ६.५६ एमएम MgCl2, 20 एमएम taurine, 15 एमएम ना2phosphocreatine, 20 एमएम imidazole, 0.5 एमएम dithiothreitol, और 50 एमएम k-एमईएस, pH 7.1 (संग्रहित किया जा सकता है -20 डिग्री सेल्सियस) ।
    2. तैयार saponin समाधान: संरक्षण समाधान के 1 मिलीलीटर में saponin के 5 मिलीग्राम (ताजा दैनिक तैयार) ।
  2. श्वसन की माप के लिए निम्नलिखित समाधान तैयार करें ।
    1. श्वसन माध्यम तैयार करें: 120 मिमी KCl, 5 मिमी KH2पीओ4, 3 मिमी HEPES, 1 मिमी EGTA, 1 मिमी MgCl2, और 0.2% BSA (डब्ल्यू/
    2. सब्सट्रेट, युग्मक, अवरोधकों तैयार करते हैं । एच2ओ में सभी सब्सट्रेट भंग, और unFCCP के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इथेनॉल निरपेक्ष में अवरोधकों को भंग (malonate के अलावा जो एच2ओ में पतला है). malonate के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सब्सट्रेट के अधिकांश बेअसर ( सामग्री की तालिकादेखें). प्रोटोकॉल में दी गई सभी सांद्रता 2 मिलीलीटर कक्षों के अंदर अंतिम सांद्रता होती है ।

2. तैयारी और उच्च संकल्प आत्मशोधन के अंशांकन ।

  1. आत्मशोधन के चैंबर्स, टोपियां, और डाट धो तीन बार 70% इथेनॉल और आसुत जल के साथ तीन बार के साथ ।
  2. शूंय ऑक्सीजन एकाग्रता पर जांचना: प्लास्टिक 2.3 कक्षों में श्वसन माध्यम के मिलीलीटर और सोडियम dithionite के 10 मिलीग्राम जोड़ें । हालांकि चैंबर के अधिक से अधिक मात्रा 2 मिलीलीटर है, 2.3 मिलीलीटर सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुला डाट के नीचे रहता है जब चैंबर बंद कर रहे हैं । डाट के साथ कक्षों को बंद करें और 10-20 मिनट के लिए ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने के परिणामस्वरूप ऑक्सीजन की खपत दर के साथ शून्य ऑक्सीजन एकाग्रता में इलेक्ट्रोड जांचना.
  3. distillated पानी के साथ चैंबर धो, 10 मिनट के लिए निरपेक्ष इथेनॉल में गर्मी, और फिर आसुत जल के साथ कुल्ला ।
  4. वायु संतृप्ति पर जांचना: प्लास्टिक 2.3 एमएल के श्वसन माध्यम कक्षों में, डाट डालने के लिए, डाट के ऊपर पर अतिरिक्त माध्यम महाप्राण, और फिर डाट को स्पेसर के साथ उठाएं । अतिरिक्त श्वसन माध्यम मंडलों में pipetted है (2 मिलीलीटर कुल की मात्रा) के चैंबरों बंद करने के बाद हवा के बुलबुले की उपस्थिति से बचने के लिए ।
  5. एक घंटे के लिए 45 मिनट के लिए ऑक्सीजन की खपत की निगरानी, ऑक्सीजन एकाग्रता (ब्लू ट्रेस) 24 डिग्री सेल्सियस पर 250 एनएम के आसपास स्थिर है जब तक ।

3. मक्खियों और ऊतक के Permeabilization के विच्छेदन

  1. सुनिश्चित करें कि सभी कदम बर्फ पर प्रदर्शन कर रहे हैं ।
  2. Anaesthetize छह पुरुष एक ही तनाव, एक ही उंर के मक्खियों और बर्फ पर एक ही आहार पर उठाया मक्खियों के विच्छेदन की सुविधा (वंय प्रकार डब्ल्यू१११८, 15 दिन पुराने, cornmeal माध्यम पर खिलाया) ।
  3. एक स्केलपेल और ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग करना, मक्खियों काटना (सिर और पेट को हटाने) केवल उड़ान की मांसपेशियों युक्त thoraxes रखने के लिए । यह कदम नग्न आंखों से किया जा सकता है । ठीक इत्तला दे दी संदंश के साथ परिणामी thoraxes संभाल ।
  4. संदंश का उपयोग कर बर्फ शीत संरक्षण समाधान के 2 मिलीलीटर युक्त एक 25 मिमी पेट्री डिश में तीन विच्छेदित thoraxes हस्तांतरण ।
  5. ठीक से इत्तला दे दी संदंश के साथ, यांत्रिक thoraxes में संदंश की नोक डालने के द्वारा thoraxes permeabilize और बार ही एक ढीला जुड़े नेटवर्क प्राप्त करने के लिए ऊतक के अलावा आंसू ।
  6. एक 24-वेल प्लेट में, saponin सॉल्यूशन के 12.5 µ l के साथ दो कुओं को भरें और 1 मिलीलीटर संरक्षण समाधान की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए मीलियन µ g/एमएल का saponin । श्वसन माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ दो आसंन कुओं भरें ।
  7. ठीक से इत्तला दे दी संदंश के साथ, हस्तांतरण तीन permeabilized thoraxes पतला saponin समाधान में और एक कक्षीय शेखर पर हल्के आंदोलन के साथ गर्मी, बर्फ पर, 20 मिनट के लिए ।
  8. बाद की मशीन के बाद, बगल के हल्के आंदोलन के साथ श्वसन माध्यम से भरा कुओं में फाइबर स्थानांतरण, बर्फ पर, 5 मिनट के लिए बंद कुल्ला saponin ।

4. शुष्क वजन का निर्धारण

  1. सूखे एक शोषक सतह पर permeabilized thoraxes और फ्लिप 3-4 बार ठीक-इत्तला दे दी संदंश का उपयोग कर सुनिश्चित करें कि सभी नमी हटा दिया है ।
  2. तीन thoraxes एक साथ एक microbalance पर तौलना । प्राप्त वजन नोट के रूप में यह mitochondrial ऑक्सीजन की खपत दरों को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  3. तुरंत बर्फ पर श्वसन माध्यम की एक बूंद में ऊतकों स्थानांतरण ।

5. ऑक्सीजन की खपत दर निर्धारण

  1. आत्मशोधन के चैंबर्स खोलें (डाट निकालें) और प्रत्येक कक्ष में 10 मिमी पाइरूवेट और malate के 2 मिमी जोड़ें.
  2. permeabilized ऊतकों को सीधे श्वसन माध्यम से भरे कक्षों में जोड़ें ।
  3. स्पेसर का उपयोग कर डाट बदलें ।
  4. एक 60 मिलीलीटर सिरिंज के साथ, एक ऑक्सीजन टैंक से सीधे ऑक्सीजन इकट्ठा करने और प्रत्येक चैंबर के डाट केशिका के माध्यम से 2-5 मिलीलीटर ऑक्सीजन की सुई के माध्यम से सुनिश्चित करें कि ऑक्सीजन प्रसार ऊतक ऑक्सीजन की खपत को सीमित नहीं करेगा ।
  5. thoraxes चैंबर में रहना सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक डाट की केशिका में एक हैमिल्टन सिरिंज डालें.
  6. बंद कक्षों पूरी तरह से जब ऑक्सीजन एकाग्रता 400 एनएम के आसपास है, हवा संतृप्ति से ऊपर ऑक्सीजन के स्तर को प्राप्त करने (चारों ओर 160% हवा संतृप्ति) कक्षों के अंदर ।
  7. बंद करो और मंडलों में हवा के बुलबुले के लिए जांच करने के लिए सरगर्मियों को पुनः आरंभ ।
  8. ऊतक के बड़े पैमाने पर दर्ज करें ऊतक के बड़े पैमाने पर श्वसन दरों को सामान्य करने के लिए पहले तौला (मिलीग्राम), प्रदर्शित जन-विशिष्ट ऑक्सीजन की खपत (pmol ओ2 भस्म. एस-1. मिलीग्राम-1 ऊतक).
  9. एक बार ऑक्सीजन की खपत (लाल ट्रेस) स्थिर है, एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ 5 मिमी ADP जोड़ें ।
  10. प्रत्येक इंजेक्शन के बाद, आसुत जल, 70% इथेनॉल, और आसुत पानी के साथ सीरिंज फिर से कुल्ला ।
  11. एक बार ऑक्सीजन की खपत फिर से स्थिर है, cytochrome सी के 4 मिमी के 5 µ एल इंजेक्षन
  12. ETS के विभिन्न चरणों में mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का मूल्यांकन करने के लिए निम्नलिखित सब्सट्रेट के अनुक्रमिक इंजेक्शन के लिए आगे बढ़ें:
    1. एक 2 मीटर की रेखा के 5 µ एल जोड़ें ।
    2. एक 1 M succinate के 10 µ l को जोड़ें ।
    3. एक 1 एम ग्लिसरॉल-3-फास्फेट के 30 µ एल जोड़ें ।
  13. एक अनुमापन तरीके से FCCP 0.5-1 µ एम (2 एक 1 मिमी समाधान के µ एल) के कदम से युग्मक सुई इष्टतम एकाग्रता तक पहुंच गया है, यानी, एकाग्रता के लिए उच्चतम ऑक्सीजन की खपत को प्राप्त करने के लिए अवरोध के बिना संभव (चेतावनी: देखें तालिका की सामग्री) ।
  14. निंन अवरोधकों को पूरी तरह से ETS में इलेक्ट्रॉन प्रवाह को बाधित करने के क्रम में अवशिष्ट ऑक्सीजन की खपत (ROX) यानी गैर श्वसन प्रतिक्रियाओं जैसे अंय लोगों के बीच oxygenase प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इंजेक्शन:
    1. 1 मिमी रोटेनोन के 1 µ एल जोड़ें (सावधानी: सामग्री की तालिकादेखें).
    2. एक 2 एम malonate के 5 µ एल जोड़ें (सावधानी: सामग्री की तालिकादेखें).
    3. एक 5 मिमी antimycin के 1 µ एल जोड़ें (सावधानी: सामग्री की तालिकादेखें).
  15. कक्ष में 0.2 mm ascorbate और 0.5 mm TMPD क्रमिक रूप से जोड़ें, ascorbate के साथ शुरू करने के लिए जटिल चतुर्थ द्वारा ऑक्सीजन की खपत को मापने ।
  16. जटिल चतुर्थ को बाधित करने के लिए सोडियम azide के 20 मिमी जोड़ें (सावधानी: सामग्री की तालिकादेखें).
  17. एक बार सिग्नल स्थिर हो जाने पर, स्पेसर के साथ चैंबर्स खोलें, फिर से आक्सीजन को 2 मिलीलीटर शुद्ध ऑक्सीजन का इंजेक्शन लगाकर चैंबर्स को बंद कर दे और जब एकाग्रता करीब २५०-३०० nmol.mL-१के आसपास हो.
  18. 10-15 मिनट के लिए संकेत उपाय और रासायनिक पृष्ठभूमि की गणना, यानी, TMPD के autoxidation के कारण ऑक्सीजन की खपत.

6. आत्मशोधन की सफाई

  1. माप के बाद, आसुत जल के साथ कक्षों कुल्ला एक बार और कक्षों कुल्ला 70% इथेनॉल में तीन बार ।
  2. 10 मिनट के लिए निरपेक्ष इथेनॉल में गर्मी अवरोधकों को निष्क्रिय करने के लिए ।
  3. आसुत जल के साथ तीन बार कुल्ला, 70% इथेनॉल के साथ कक्षों को भरने और डाट और अगले उपयोग तक टोपियां की जगह ।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का एक प्रतिनिधि ट्रेस चित्रा 2में प्रदान की जाती है । पाइरूवेट और malate permeabilized मांसपेशी फाइबर के साथ कक्षों में इंजेक्शन CI-रिसाव श्वसन, अर्थात्के लिए भेजा जाता है, जब ETS के जटिल मैं पाइरूवेट और malate के माध्यम से ऑक्सीकरण के माध्यम से उत्पादित नध से प्रेरित है tricarboxylic एसिड चक्र (CI) । इस श्वसन दर के दौरान, mitochondrial ऑक्सीजन मुख्य रूप से प्रोटॉन रिसाव के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए बनाए रखा है, यानी, प्रोटान mitochondrial मैट्रिक्स, जब एटीपी सिंथेस (रिसाव) सक्रिय नहीं है करने के लिए झिल्ली अंतरिक्ष से पार30। जब ADP जोड़ दिया जाता है, एटीपी सिंथेस सक्रिय है और इलेक्ट्रॉनों जटिल मैं के साथ जटिल चतुर्थ के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं के साथ समवर्ती फास्फारिलीकरण में adp एटीपी (CI-OXPHOS), वृद्धि हुई mitochondrial ऑक्सीजन की खपत में जिसके परिणामस्वरूप. OXPHOS युग्मन अनुपात ci-OXPHOS/ci-रिसाव के रूप में गणना की जाती है और आमतौर पर mitochondrial की गुणवत्ता और mitochondrial युग्मन के एक अच्छे संकेतक के रूप में लिया जाता है30. Drosophila में, यह अनुपात 6.0 से अधिक होना चाहिए (चित्र 3) । यदि यह इस मूल्य से नीचे है, यह ऊतक तैयारी या एक mitochondrial शिथिलता के साथ एक समस्या का संकेत सकता है । cytochrome सी के अलावा बाहरी mitochondrial झिल्ली की अखंडता के निर्धारण की अनुमति देता है और इसलिए तैयारी (चित्रा 4) के एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है । दरअसल, cytochrome सी शिथिल भीतरी mitochondrial झिल्ली के लिए बाध्य है और आम तौर पर दूर धोया जाता है अगर बाहरी mitochondrial झिल्ली permeabilization प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त है । एक परिणाम के रूप में, exogenous cytochrome सी जोड़ने काफी ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि होगी अगर बाहरी mitochondrial झिल्ली क्षतिग्रस्त है और अंतर्जात cytochrome सी खो दिया है । ऑक्सीजन की खपत में से कम 10-15% की वृद्धि (चित्रा 4) आमतौर पर बाहरी mitochondrial झिल्ली की उचित अखंडता29दिखाता है । चित्रा 3 और 4 में, हरे निशान गैर से प्राप्त किए गए थे पर्याप्त permeabilization और नमूनों की हैंडलिंग ( चित्रा 3के लिए ऊतक के अत्यधिक फाड़, और चित्रा 4के लिए शोषक सतह पर एक लंबे समय के बाद तौला), जबकि लाल निशान नमूनों का प्रतिनिधित्व पर्याप्त रूप से permeabilized और संभाला । इन परिणामों पर प्रकाश डाला कि उचित permeabilization स्थितियों mitochondrial ऑक्सीजन की खपत के विश्वसनीय आकलन के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

निंनलिखित प्रयोग के दौरान इस्तेमाल सब्सट्रेट ubiquinone को इलेक्ट्रॉनों प्रदान और ETS में इलेक्ट्रॉन प्रवाह को बढ़ाने की अनुमति दी । एक एमिनो एसिड है कि ऊर्जा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है सब्सट्रेट में विशेष रूप से23कीड़ों, लेकिन यह भी तीव्र भुखमरी के दौरान या स्तनधारियों में रोग की स्थिति के दौरान37. कक्षों में रेखा के अलावा ETS, जब इलेक्ट्रॉनों दोनों जटिल मैं और ProDH से बह रहे है और OXPHOS प्रक्रिया (CI + ProDH-OXPHOS) को भाग ले रहे है में इलेक्ट्रॉन प्रवाह के लिए लाइन डिहाइड्रोजनेज (ProDH) के योगदान का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है । succinate के अलावा, ETS के लिए जटिल द्वितीय (succinate डिहाइड्रोजनेज) के योगदान को मनाया जा सकता है (CI + ProDH + सीआईआई-OXPHOS) । ग्लिसरॉल-3-फॉस्फेट (G3P) के इंजेक्शन, आगे mitochondrial ऑक्सीजन की खपत बढ़ जाती है के रूप में इस सब्सट्रेट ग्लिसरॉल शटल और हस्तांतरण का हिस्सा है जो mitochondrial डिहाइड्रोजनेज-3-फॉस्फेट G3PDH (glycerophosphate) को उत्तेजित करता है ETS (CI + ProDH + सीआईआई + G3PDH-OXPHOS) के लिए इलेक्ट्रॉनों । दोनों ProDH और G3PDH कीड़ों की कई प्रजातियों में विशेष रूप से सक्रिय होना दिखाया गया है और इसलिए इस प्रोटोकॉल में Drosophila के साथ महत्वपूर्ण है20,21,22,23,32 .

जब unयुग्मक FCCP जोड़ा जाता है, गैर युग्मित श्वसन (ETS राज्य) प्राप्त की है, यानी, अधिक से अधिक ऑक्सीजन की खपत ETS (CI + ProDH + सीआईआई + G3P-ETS) की अधिक से अधिक क्षमता का प्रतिनिधित्व । FCCP एक protonophore है जो प्रोटान के बीच से गुजरते हुए बिना mitochondrial मैट्रिक्स के लिए झिल्ली के अंतरिक्ष से परिवहन करता है । FCCP को ध्यान से titrated हो गया है, गैर में इष्टतम परिणाम-अधिक से अधिक ऑक्सीजन की खपत और गैर स्थिर श्वसन दर के रूप में सांद्रता, जबकि mitochondrial ऑक्सीजन की खपत के निषेध में इष्टतम परिणाम के ऊपर सांद्रता (चित्रा 5) । एक बार सब्सट्रेट और unयुग्मक जोड़ रहे हैं, मैं, द्वितीय, और III के परिसरों के निषेध क्रमिक रूप से रोटेनोन, malonate, और antimycin ए, क्रमशः का उपयोग किया जा सकता है । प्रत्येक अवरोधक के साथ इस्तेमाल किया, mitochondrial ऑक्सीजन की खपत में कमी मनाया जाता है, antimycin के अलावा के बाद सबसे कम ऑक्सीजन की खपत तक पहुँचने तक. सभी अवरोधकों के अतिरिक्त के बाद पहुंच दर अवशिष्ट ऑक्सीजन की खपत30है । यह उदाहरण के लिए oxygenase प्रतिक्रियाओं और प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन के रूप में गैर mitochondrial ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रियाओं के कारण ऑक्सीजन की खपत का प्रतिनिधित्व करता है, और इसलिए मापा सभी अन्य दरों से घटाया जा करने के लिए है.

TMPD एक कृत्रिम इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्टर है कि जटिल चतुर्थ करने के लिए सीधे इलेक्ट्रॉनों प्रदान करता है, सभी परिसरों को दरकिनार, जटिल चतुर्थ अधिकतम श्वसन क्षमता की माप की अनुमति । इस सब्सट्रेट हालांकि autoxidation करने के लिए प्रवण है, तो ascorbate करने के लिए TMPD से पहले जोड़ा जा करने के लिए सीमा पर पूरी तरह से इस autoxidation से बचने के लिए नहीं है. TMPD के शेष autoxidation के लिए सही करने के लिए, परिसर के चतुर्थ अवरोधक सोडियम azide कक्षों में जोड़ा जाता है और ऑक्सीजन की खपत फिर 10-15 मिनट के लिए दर्ज की गई है । इस ऑक्सीजन की खपत इसलिए रासायनिक पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व करता है, या दूसरे शब्दों में TMPD कि जटिल चतुर्थ अधिक श्वसन क्षमता की गणना के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए autoxidation ।

Figure 1
चित्र 1 . इलेक्ट्रॉनक यातायात प्रणाली द्वारा mitochondrial इलेक्ट्रॉनक परिवहन का योजनाबद्ध निरूपण तथा mitochondrial भीतरी झिल्ली में ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण. मैं: जटिल मैं; द्वितीय: परिसर द्वितीय; iii: जटिल iii; चतुर्थ: परिसर iv; V: एटीपी सिंथेस; एसिटाइल-CoA: एसिटाइल कोएंजाइम A; Cyt ग: cytochrome ग; ई-: इलेक्ट्रॉन; G3P: ग्लिसरॉल-3-फॉस्फेट; G3PDH: mitochondrial ग्लिसरॉल-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; H+: प्रोटॉन; PRODH: रेखांकित डिहाइड्रोजनेज; टीसीए: tricarboxylic एसिड चक्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : mitochondrial ऑक्सीजन एकाग्रता (ब्लू ट्रेस) और Drosophila के permeabilized thoraxes पर खपत (लाल ट्रेस) के प्रतिनिधि निशान. प्रत्येक इंजेक्शन यौगिक इंजेक्शन का संकेत तीर के साथ प्रतिनिधित्व किया है (Pyr: पाइरूवेट; मल: malate; adp; Cyt ग: cytochrome ग; प्रो: रेखा; Succ: succinate; G3P: ग्लिसरॉल-3-फॉस्फेट; FCCP: carbonyl साइनाइड 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone; सड़ांध: रोटेनोन; मालो: malonate; मुंगी a: antimycin a; TMPD: n, n, n ', n,-Tetramethyl-p-phenylenediamine; ए एस सी: ascorbate; SAZ: सोडियम azide). प्रत्येक mitochondrial ऑक्सीजन खपत की दर ग्राफ पर चिह्नित है, जब ऑक्सीजन की खपत (रेड स्ट्रेस) स्थिर हो गई है । Cytochrome सी प्रभाव बाहरी mitochondrial झिल्ली की अखंडता को नोट (विवरण के लिए पाठ देखें) । अवशिष्ट ऑक्सीजन की खपत कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव पक्ष प्रतिक्रियाओं के कारण ऑक्सीजन की खपत का प्रतिनिधित्व करता है और मापा सभी अन्य दरों को घटाया जा करने के लिए है । रासायनिक पृष्ठभूमि केवल TMPD के autoxidation के कारण ऑक्सीजन की खपत का अर्थ है और जटिल चतुर्थ अधिकतम श्वसन क्षमता की गणना के लिए ध्यान में रखा जाना है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : एक वैध (लाल ट्रेस, चैंबर ए) और अपर्याप्त (ग्रीन ट्रेस, चैंबर बी) के प्रतिनिधि के निशान ADP के अलावा करने के लिए प्रतिक्रियाएं । एक ही प्रयोग के दौरान चैंबर के लिए एक और ग्रीन ट्रेस मेल खाती है, चैंबर बी करने के लिए संगत लाल ट्रेस । लाल निशान thoraxes से प्राप्त किया गया था पर्याप्त रूप से permeabilized जबकि हरी ट्रेस जरूरत से ज्यादा permeabilization के दौरान ऊतकों को फाड़ने के बाद प्राप्त किया गया था । जब ADP जोड़ा जाता है, ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि की उंमीद है, लाल निशान की तरह । OXPHOS युग्मन अनुपात ci-OXPHOS/ci-रिसाव के रूप में गणना कर रहे है और ग्राफ में प्रस्तुत कर रहे हैं । Drosophila में से कम 6.0 का अनुपात mitochondrial युग्मन में एक समस्या का पता चलता है और नमूना क्षरण या mitochondrial के द्वारा प्रतिनिधित्व रोग की विशेषता है ग्रीन ट्रेस । Pyr: पाइरूवेट; मल: malate । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : एक वैध के प्रतिनिधि अंश (लाल ट्रेस, चैंबर ए) और अपर्याप्त (ग्रीन ट्रेस, चैंबर बी) cytochrome सी के अलावा करने के लिए प्रतिक्रिया. एक ही प्रयोग के दौरान चैंबर के लिए एक और ग्रीन ट्रेस मेल खाती है, चैंबर बी करने के लिए संगत लाल ट्रेस । लाल ट्रेस thoraxes से प्राप्त किया गया था पर्याप्त रूप से permeabilized और संभाला, जबकि हरी ट्रेस प्राप्त किया गया था के बाद thoraxes जानबूझकर वजन से पहले शोषक सतह पर एक लंबे समय के लिए सूख रहे थे । Cytochrome सी आमतौर पर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि नहीं करता है, के रूप में लाल निशान पर देखा, टिप्पण है कि बाहरी mitochondrial झिल्ली बरकरार है । अगर, तथापि, exogenous cytochrome सी के अलावा काफी अधिक से अधिक 15% की mitochondrial ऑक्सीजन की खपत बढ़ जाती है, के रूप में हरी ट्रेस पर देखा, यह पता चलता है कि बाहरी mitochondrial झिल्ली क्षतिग्रस्त है और इसलिए है कि नमूना नीचा है और होना चाहिए छोड़ दिया. Pyr: पाइरूवेट; मल: malate; Cyt c: cytochrome c. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : FCCP के अनुमापन के बाद mitochondrial ऑक्सीजन एकाग्रता (ब्लू ट्रेस) और खपत (लाल ट्रेस) के प्रतिनिधि अंश । कई सांद्रता पर FCCP के विभिंन इंजेक्शन के लिए ध्यान से अधिकतम ऑक्सीजन की खपत इस unयुग्मक द्वारा ट्रिगर निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया है । अपर्याप्त सांद्रता अधिक से अधिक ऑक्सीजन की खपत के आकलन की अनुमति नहीं है और गैर-स्थिर श्वसन दर की विशेषता है, जबकि FCCP अतिरिक्त mitochondrial ऑक्सीजन की खपत को रोकता है । तीर FCCP के विभिंन इंजेक्शन निरूपित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : एक ठेठ प्रयोग के दौरान mitochondrial ऑक्सीजन खपत दरों के Reproducibility दो अलग कक्षों का उपयोग कर प्राप्त (लाल ट्रेस, चैंबर a; ग्रीन ट्रेस, चैंबर बी) एक आत्मशोधन. एक ही उंर, लिंग, तनाव से Drosophila का उपयोग करते हुए एक ही प्रयोग के दौरान चैंबर एक और हरे रंग का पता लगाने के लिए मेल खाती है, एक ही आहार पर और उठाया, साथ ही साथ प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित है । दोनों नमूनों सूखे ऊतक के द्रव्यमान के साथ सामान्यीकृत थे के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित वजन (०.५३ और ०.६६ एक और बी चैंबर के लिए मिलीग्राम, क्रमशः) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस अध्ययन में, Drosophila में mitochondrial ऑक्सीजन खपत की माप से पहले नमूना तैयारी के लिए एक विधि बताई गई है. इस विधि mitochondrial अलगाव का उपयोग प्रोटोकॉल से संबंधित विभिंन समस्याओं को दूर करने के लिए विकसित किया गया था, विशेष रूप से अवधि और आवश्यक व्यक्तियों की संख्या के संदर्भ में । mitochondrial अलगाव आमतौर पर कई व्यक्तियों से प्राप्त ऊतकों की बड़ी राशि की आवश्यकता के साथ काम करने के बजाय, यह प्रयोग कुछ Drosophila के thoraxes से permeabilized मांसपेशी तंतुओं पर किया जाता है । इस प्रोटोकॉल में, केवल तीन व्यक्तियों इष्टतम परिणाम प्रदर्शित करने के लिए आवश्यक हैं । इसलिए, विभिंन समय बिंदुओं पर mitochondrial ऑक्सीजन की खपत की माप संभव है क्योंकि यह अधिक प्राप्त करने के लिए मक्खियों के एक छोटे समूह को सिंक्रनाइज़ करने के लिए एक ही उंर के होने और एक ही लिंग के ।

सबसे पहले, यह एक ही उंर के Drosophila का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, लिंग, तनाव और एक ही परिस्थितियों में उठाया परिणामों में कम परिवर्तनशीलता प्राप्त करने के लिए (चित्रा 6), के रूप में श्वसन उंर के साथ बदल सकते हैं, लिंग, जीनोटाइप, और मक्खियों के आहार । इस प्रोटोकॉल के निष्पादन में सबसे महत्वपूर्ण चरण thoraxes की permeabilization कार्यविधि है । यह बहुत जल्दी से आगे बढ़ना करने के लिए ऊतक के क्षरण से बचने के महत्वपूर्ण है, और यह भी सुनिश्चित करें कि thoraxes अच्छी तरह से permeabilized ऑक्सीजन की खपत की अधिक से अधिक दरों है करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि permeabilization सही ढंग से प्रदर्शन किया गया है और कि mitochondria के संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता permeabilization के बाद संरक्षित कर रहे हैं, OXPHOS युग्मन अनुपात (ci-OXPHOS/ci-रिसाव, चित्र 3), साथ ही cytochrome c (आरेख 4) के प्रतिसाद को गुणवत्ता नियंत्रणों के रूप में उपयोग किया जाता है । जल्दी से काम करने और permeabilization अच्छी तरह से मार डाला है सुनिश्चित करने के बीच विचार में लेने के लिए एक tradeoff है । यह भी महत्वपूर्ण है हमेशा बर्फ पर काम करने के लिए जब विच्छेदन thoraxes से छेड़छाड़ । सबसे reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए (चित्रा 6), समरूप permeabilization आवश्यक है और permeabilization के लिए तकनीक का अभ्यास करने के लिए सुनिश्चित करें कि एक ही आंदोलनों दोहराया जाता है बनाने में मदद करता है । एक और महत्वपूर्ण कदम नमूना के शुष्क वजन का निर्धारण है । दरअसल, thoraxes के बाद, वे बहुत संवेदनशील हैं, नाजुक और गिरावट के लिए प्रवण । इसलिए, permeabilization के लिए इसी तरह, जल्दी से शुष्क वजन के निर्धारण के लिए आगे बढ़ने महत्वपूर्ण है । दूसरी ओर, यह सटीकता के साथ वजन निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में परिणाम ऊतक के द्रव्यमान से सामान्यीकृत कर रहे हैं । इस्तेमाल thoraxes की मात्रा भी अनुकूलित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल के लिए एक एकल छाती का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है35चैंबर, लेकिन संकल्प के एक निश्चित स्तर के रूप में ज्यादा के रूप में शुष्क वजन के निर्धारण में ऑक्सीजन की खपत की माप में खो सकता है । thoraxes की मात्रा यदि आवश्यक हो तो बढ़ाई जा सकती है, लेकिन यह ध्यान रखना जरूरी है कि नमूने में जितनी अधिक mitochondria, ऑक्सीजन की खपत अधिक होगी और चैंबरों को इसलिए reoxygenated जाना पड़ेगा. यह reऑक्सिजन कक्षों को खोलकर और ऑक्सीजन इंजेक्ट करके किया जा सकता है, लेकिन इससे चैंबर में हवा के बुलबुले डालने की संभावना बढ़ जाएगी । इसलिए, यदि संभव हो तो, कक्षों को reoxygenate करने से बचने की कोशिश करें (जब जटिल चतुर्थ अधिकतम श्वसन क्षमता को निर्धारित किया जाना है) । प्रयोगों चलाने से पहले, सब्सट्रेट सांद्रता का अनुकूलन भी एक अत्यधिक एकाग्रता के कारण निरोधात्मक प्रभाव देख के बिना उच्चतम mitochondrial ऑक्सीजन की खपत को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. आत्मशोधन के कक्षों को भी अच्छी तरह से साफ करना होगा ताकि संभावित संदूषणों से बचा जा सके । यह महत्वपूर्ण है distillated पानी के साथ सफाई शुरू करने के लिए और फिर 70% इथेनॉल संभावित जैविक संदूषणों से छुटकारा पाने के लिए । इस के बाद, 10 मिनट के लिए निरपेक्ष इथेनॉल में एक मशीन hydrophobic अवरोधकों के संक्रमण से बचने के लिए सिफारिश की है । अंत में, distillated पानी के साथ कक्षों धोने और उंहें 70% इथेनॉल के साथ भरने अगले उपयोग जब तक संभावित संदूषण से बचना होगा ।

प्रोटोकॉल आसानी से या तो अंय सब्सट्रेट, या अलग अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक दिलचस्प अध्ययन करने के लिए प्रोटीन mitochondrial पाइरूवेट वाहक (MPC) है । इस प्रोटीन की भूमिका mitochondrial मैट्रिक्स में cytosol में उत्पंन पाइरूवेट परिवहन के लिए है । हाल ही में, यह प्रकार के दौरान रोग की स्थिति के दौरान चयापचय का मॉडुलन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है 2 मधुमेह38. mitochondrial चयापचय पर प्रोटीन MPC के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, यह एक ही समय में पाइरूवेट और malate के बजाय केवल पाइरूवेट के साथ इंजेक्शन शुरू करने के लिए उपयोगी है । इस प्रकार, पाइरूवेट के प्रभाव malate के प्रभाव से स्वतंत्र रूप से अध्ययन किया है, के रूप में बाद केवल tricarboxylic एसिड चक्र का समर्थन करने के लिए इंजेक्शन है और यह सुनिश्चित करें कि मध्यवर्ती समाप्त नहीं कर रहे हैं. यह भी MPC39 के अवरोधकों का उपयोग करने के लिए अगर पाइरूवेट के ऑक्सीकरण के बजाय इस ट्रांसपोर्टर की एक सीमा मनाया जाता है संभव है. फिर, यह श्वसन40के लिए पसंदीदा ईंधन स्रोत में एक संभावित बदलाव का पालन करना संभव होगा । यह भी अगर यह अध्ययन के लिए प्रासंगिक नहीं है प्रोटोकॉल को सरल करने के लिए कुछ सब्सट्रेट छोड़ करने के लिए संभव है. उदाहरण के लिए, मैं केवल परिसर की एक शिथिलता का अध्ययन करने के लिए, यह आवश्यक नहीं है सभी इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सब्सट्रेट का उपयोग करें ।

इस प्रोटोकॉल कुछ सीमाएं है कि vivo में शर्तों से डायवर्ट प्रस्तुत करता है । mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का माप दर्ज कर रहे हैं जब श्वसन माध्यम हवा संतृप्ति से ऊपर है, के रूप में शुद्ध ऑक्सीजन ऊतक के अंदर ऑक्सीजन प्रसार की सीमा को रोकने के लिए इंजेक्शन है30. इसके अलावा, सब्सट्रेट की सांद्रता अधिक है, जो vivo स्थितियों में प्रतिबिंबित नहीं कर रहे हैं में इंजेक्ट कर रहे हैं । यह भी ध्यान रखें कि उम्र, सेक्स, तनाव और Drosophila के आहार परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं महत्वपूर्ण है. ये पैरामीटर इसलिए खाते में परिणाम की व्याख्या करते समय लिया जा करने के लिए कर रहे हैं । हालांकि इस विधि mitochondrial अलगाव का उपयोग करने के लिए mitochondrial ऑक्सीजन की खपत को मापने तरीकों से शारीरिक स्थितियों के करीब है, अंय सेलुलर घटकों और mitochondria के संरचनात्मक अखंडता के साथ बातचीत के रूप में और आकृति विज्ञान31का संरक्षण कर रहे हैं । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि mitochondrial आइसोलेशन अधिक लाभप्रद होते हैं, जब अतिरिक्त पैरामीटर जैसे ROS उत्पादन या mitochondrial दक्षता (P/O अनुपात) को27मापा जाना चाहिए ।

इस विधि mitochondrial रोग और चयापचय रोगों के अंतर्निहित तंत्र की समझ से लेकर विभिन्न लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, रोग के तहत mitochondrial कार्यों पर विभिन्न यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए शर्तों. इसके अलावा, यह आहार या तापमान में परिवर्तन के रूप में mitochondrial चयापचय पर कई पर्यावरणीय तनाव के प्रभाव का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यह mitochondrial कार्यों पर और mitochondrial शिथिलताओं के उपचार में सक्रिय सिंथेटिक अणुओं की दक्षता का अध्ययन करने के लिए संभव है । यह विधि भी एक अच्छा उपकरण के लिए अलग समय अंक है, जो यह बहुत उंर बढ़ने की प्रक्रिया से संबंधित बुनियादी तंत्र के अध्ययन के लिए बहुत प्रासंगिक बनाता है पर mitochondrial कार्यों का अध्ययन है । permeabilized thoraxes का उपयोग कर ऑक्सीजन की खपत के माध्यम से mitochondrial चयापचय का आकलन निश्चित रूप से mitochondrial चयापचय की भूमिका के बारे में हमारे ज्ञान को बेहतर करने में मदद मिलेगी जब सेल चुनौतीपूर्ण स्थितियों के संपर्क में है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह अध्ययन राष्ट्रीय विज्ञान एवं अभियांत्रिकी अनुसंधान परिषद् (NSERC, डिस्कवरी अनुदान) और विश्विद्यालय डी मॉन्कटन से एनपीई को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया. LHB को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (CIHR), ंयू ब्राउनश्विक इनोवेशन फाउंडेशन (NBIF) और विश्विद्यालय डे मॉन्कटन से फंडिंग सपोर्ट स्वीकार करना चाहूंगा । EHC के काम को कनाडा, ब्रेन कनाडा, NSERC, कैनेडियन ब्रेस्ट कैंसर फाउंडेशन, न्यू ब्राउनश्विक इनोवेशन फाउंडेशन, न्यू ब्राउनश्विक हेल्थ रिसर्च फाउंडेशन और विश्विद्यालय डे मॉन्कटन के अल्जाइमर्स सोसायटी द्वारा सपोर्ट किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
 
O2K-Titration Set  Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
 
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
 
Fine-tipped antimagnetic forceps VWR 82027-400
 
Secura225D-1S-DQE Sartorius AG, Goettingen, Germany Semi-micro balance (distributed by several companies) 
 
Drosophila melanogaster wild-type w1118 Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA
Storage Condition: 24 °C
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378 EGTA
Storage Condition: RT
KOH Sigma-Aldrich P1767 CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
CaCO3 Sigma-Aldrich C4830
Storage Condition: RT
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
Storage Condition: -20 °C
MgCl2.6H2O Sigma-Aldrich M9272
Storage Condition: RT
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Storage Condition: RT
Na2Phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936
Storage Condition: -20 °C
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Storage Condition: RT
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Storage Condition: 2-8 °C
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Storage Condition: RT
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S7900 Saponin
Storage Condition: RT
Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.
KCl Sigma-Aldrich P9541
Storage Condition: RT
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
Storage Condition: RT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Storage Condition: RT
BSA Sigma-Aldrich 05470
Storage Condition: 2-8 °C
Na2S2O4 Sigma-Aldrich 157953 Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Pyruvate
Storage Condition: 2-8 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M1000 Malate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C.
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A5285 ADP
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C.
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C7752 Cytochrome c
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
L-Proline Sigma-Aldrich P0380 Proline
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378 Succinate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C.
sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt Sigma-Aldrich G7886 Glycerol-3-phosphate
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C.
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920 FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C.
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C.
Malonic acid Sigma-Aldrich M1296 Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394 TMPD
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Ascorbate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
NaN3 Sigma-Aldrich S2002 Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.

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References

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जैव रसायन अंक 134 Mitochondria इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली चयापचय उच्च संकल्प respirometry Drosophila melanogaster permeabilization
ऊतक की न्यूनतम मात्रा का उपयोग Drosophila के Permeabilized फाइबर में Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का मापन
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Simard, C. J., Pelletier, G.,… More

Simard, C. J., Pelletier, G., Boudreau, L. H., Hebert-Chatelain, E., Pichaud, N. Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue. J. Vis. Exp. (134), e57376, doi:10.3791/57376 (2018).

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