Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

Published: April 7, 2018 doi: 10.3791/57376
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton
* These authors contributed equally

Summary

בנייר זה, מתוארת שיטה למדידת צריכת החמצן באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ב- thoraxes permeabilized של דרוזופילה. טכניקה זו דורשת כמות מזערית של רקמות לעומת הטכניקה בידוד מיטוכונדריאלי קלאסי, התוצאות המתקבלות רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית.

Abstract

זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מייצג מודל המתעוררים עבור המחקר של חילוף החומרים. אכן, דרוזופילה יש מבנים הומולוגיים לאברים אנושיים, בעלי מאוד שנשמרת מסלולים מטבוליים, יש אורך חיים קצר יחסית המאפשר לימוד מנגנונים בסיסיים שונים בתקופה קצרה של זמן. עם זאת, מפתיע כי באחד המנגנונים חיוני לחילוף החומרים הסלולר, הנשימה מיטוכונדריאלי לא ביסודיות נבדקה במודל זה. סביר כי המדד הנשימה מיטוכונדריאלי ב דרוזופילה בדרך כלל דורש מספר רב מאוד של אנשים, התוצאות המתקבלות אינן מאוד לשחזור. כאן, מתוארת שיטה ומאפשר המידה המדויקת של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי באמצעות כמויות מינימליות של רקמה מתוך דרוזופילה. בשיטה זו, thoraxes ביתר, permeabilized באופן מכני עם מלקחיים חדה והן מבחינה כימית עם סאפונין, ומאפשר תרכובות שונות לעבור את קרום התא לווסת את הנשימה מיטוכונדריאלי. לאחר permeabilization, פרוטוקול מתבצע כדי להעריך את היכולת של מתחמי שונים של מערכת התחבורה אלקטרון (ETS) להתחמצן מצעים שונים, כמו גם תגובתם של uncoupler, מעכבי מספר. שיטה זו מציג יתרונות רבים לעומת שיטות שימוש ומשום מיטוכונדריאלי, כמו זה רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית בגלל המיטוכונדריה עדיין אינטראקציה עם רכיבים אחרים התאית, המורפולוגיה מיטוכונדריאלי כולו. יתר על כן, מדגם ההכנות מהירים יותר, ואת התוצאות המתקבלות הן מאוד לשחזור. על ידי שילוב היתרונות של דרוזופילה כמודל לחקר מטבוליזם עם הערכת הנשימה מיטוכונדריאלי, חשוב תובנות חדשות יכול להיות חשפה, במיוחד כאשר הזבובים חווים שונים סביבתי או pathophysiological תנאים.

Introduction

זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימש כאורגניזם מודל עבור מחקר גנטי עבור מעל המאה ה1. המחקר של האורגניזם הזה הוביל לא רק ידע משמעותי על ירושה שאיי2, קצב מוטציה3, הפיתוח של מערכת העצבים, את קביעת גורל התא4, אבל גם לאחרונה התפתחה כלי חשוב ללמוד את המנגנונים הטמון כמה מחלות כגון אלצהיימר ופרקינסון5,6. יתר על כן, זה מודל פופולרי ללמוד את תהליך ההזדקנות, כפי שהם יכולים לגדול במספר גדול על פני תקופה קצרה של זמן יש אורך חיים קצר. הם גם בעלי מבנים הומולוגיים לאיברים אנושי, כגון לב, oenocytes (כמו hepatocyte תאים), שומן הגוף (מתפקד באופן דומה רקמת שומן בכבד ולבן), לייצר תאים (שקול לתאי β בלבלב), אינסולין, כמו גם hemolymph הובלת מטבוליטים (מקביל להדם של בעלי חוליות)7. יתר על כן, משעולים המרכזי של מתווך חילוף החומרים (כולל את מסלול איתות כמו פקטורי גדילה דמויי אינסולין/אינסולין מסלולים היעד של Rapamycin-תור) הם גם מאוד שנשמרת7. מסיבות אלו, דרוזופילה לאחרונה נוצלה כדי לתאר את המנגנונים הבסיסיים השולטים חילוף החומרים, במיוחד בתנאים פתולוגיים הקשורות למחלות מטבוליות כגון סוכרת8. רכיב מרכזי של חילוף החומרים הוא מיטוכונדריון משלב מספר מסלולים ומבצע אחת מהפונקציות הביולוגי החשוב ביותר של החיים, ייצור ATP, באמצעות תהליך זרחון חמצוני (OXPHOS). בהתחשב שלהם תפקיד מרכזי בחילוף החומרים של האורגניזם, זה לא מפתיע כי תפקוד מיטוכונדריאלי מעורבים במחלות כמו פרקינסון9 ו מחלות אלצהיימר10, כמו גם נוירודגנרטיביות 11 , 12. הם גם המשפיעים של תהליך ההזדקנות. אכן, הם המפיקים הראשי של מינים חמצן תגובתי (ROS) בתא, אשר עלולה לפגוע בבריאותך לתא ריכוז גבוה דרך נזק חמצוני11. הזדקנות גם היה קשור להצטברות של ניזוק או מוטציה מיטוכונדריאלי דנ א13,14,mitophagy בתפקוד15 , כמו גם ליקוי להן מיטוכונדריאלי16. המיטוכונדריה הם גם גורמים מרכזיים של הומאוסטזיס של התא, כפי שהם יכולים לנצל סובסטרטים שונים כדי להתאים את מספר הסלולר פונקציות בהתאם שפע או מחסור של macronutrients17,18.

אכן, החומרים המזינים שונים בתזונה (פחמימות, שומנים וחלבונים) מתעכל, נספג, מועבר בתאים. . הם הופכים לאחר מכן ב ציטוזול ולאחר סובסטרטים נגזר מועברים לתוך מאטריקס מיטוכונדריאלי שבו הם מייצרים מקבילות תוך צמצום, כגון2NADH ו FADH19. הם אלה מקבילות תוך צמצום ואז תחמוצת על-ידי מתחמי אנזימטיות שונות של מערכת התחבורה אלקטרון (ETS). מכלולים אלה מוטבעות ממברנה פנימית מיטוכונדריאלי, כגון מתחם I ו- II מורכבים. בנוסף, מתחמי אנזימטי אחרים כגון דהידרוגנאז מיטוכונדריאלי של גליצרול-3-פוספט דהידרוגנאז פרולין מייצגים דרכים חלופיות עבור הערך של אלקטרונים לתוך ה ETS20,21. מתחמי "אלטרנטיבי" אלה חשובים במיוחד חרקים, כמו לפי המין, הם יכולים באופן פעיל להשתתף כדי להגדיל את הנשימה20,22,23,21. אלקטרונים אלה ETS האכלה מערכות מועברים את ubiquinone, לאחר מכן השלישי מורכב ולאחר מכן הרביעי מורכבים, עד מקבל הסופי, חמצן מולקולרי. העברת האלקטרון הזה יוצר פרוטון-מניע כוח על פני קרום מיטוכונדריאלי הפנימי שנוסעים זירחון של ADP ATP-V מורכבים (איור 1). בהתחשב התפקיד המרכזי של מיטוכונדריה הומאוסטזיס של התא, לומד מיטוכונדריאלי חילוף החומרים באמצעות מייצג melanogaster ד את הדגם הרלוונטי כלי רב עוצמה כדי ניסחו את המנגנונים שבבסיס שונים הקשורים pathophysiological תנאים או תחת לחצים הסלולר וסביבתיים. באופן מפתיע, רק קומץ מחקרים למעשה נמדד נשימה מיטוכונדריאלי דרוזופילה24,25,26. אכן, ניסויים במטרה להעריך את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי דורשים את ניתוקה של המיטוכונדריה. למרות יתרון עבור המידה של פונקציות מיטוכונדריאלי שונות (כגון ייצור ROS או יחס P/O כמו סמן של יעילות מיטוכונדריאלי27,28), ומשום אלה בדרך כלל דורשים כמויות די גדולות של רקמה מתוך24,יחידים מספר29. דרישה זו עבור כמויות גבוהות של רקמות ויחידים הוא גורם מגביל חשוב, במיוחד בהתחשב בעובדה כי כל אדם צריך להיות באותו הגיל, רצוי מאותו המין על הניסויים, שהופך את מידת הנשימה בזמן שונה נקודות מפרך במקרה הטוב. יתר על כן, בעוד ומשום מיטוכונדריאלי יכול לספק תובנה משמעותית המנגנונים הבסיסיים המסדירים את חילוף החומרים מיטוכונדריאלי, האמצעים שננקטו כדי לבודד המיטוכונדריה יש מספר חסרונות כגון הקושי להשיג תוצאות ניתן לשכפול , הפרעה של רשת מיטוכונדריאלי, ושינוי של מיטוכונדריאלי מבנה ותפקוד29,30,31.

מטרת מחקר זה היא להציג פרוטוקול חזקים כדי למדוד את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי דרוזופילה באמצעות רק כמות מזערית של רקמות מאנשים מעט מאוד. פרוטוקול זה מורכב מדידת חמצן מיטוכונדריאלי צריכת בחיי עיר באמצעות סיבי השריר permeabilized29 מ דרוזופילה thoraxes בשילוב עם רזולוציה גבוהה respirometry32,33, 34 , 35. בשיטה זו יש גם יתרונות נוספים בהשוואה לשיטת הבידוד מיטוכונדריאלי קלאסי מאז האינטראקציות עם רכיבים אחרים של התא כמו מבנה ותפקוד טוב כמו מיטוכונדריאלי יישמרו יותר ב- permeabilized סיבי29,31,36, מה שהופך את גישה זו רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית. עם פרוטוקול זה, פונקציות מיטוכונדריאלי ניתן בצורה מדויקת להעריך באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה ברק שלוש thoraxes של זבוב החומץ, עם מצעים המאפשר קביעת צריכת חמצן-מספר שלבים שונים של החוצנים. לכן, פרוטוקול זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח על המנגנונים הבסיסיים השולטים חילוף החומרים בהקשר של תנאים סביבתיים או pathophysiological רבים על-ידי ניצול של המודל דרוזופילה.

למדוד את צריכת החמצן מספר שלבים שונים של החוצנים ולהעריך כיצד סובסטרטים לתרום הנשימה, מצעים שונים (איור 1), uncoupler, מעכבי נמצאות בשימוש30 לאחר permeabilization של רקמות. באופן ספציפי, תוספות רציפים של סובסטרטים מבוצעות כדי לגרות את כניסתם של אלקטרונים בעלי מתחמים שונים של החוצנים. Uncoupler, קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), מצורף-ריכוז אופטימלי כדי למדוד את הנשימה הלא מצמידים, קרי, הנשימה phosphorylating מגורה צריכת חמצן מירבית. העכבות רציפים של מתחמי שאני II, III מבוצעות לאחר מכן כדי לפקח על צריכת חמצן שיורית הראוי תגובות חמצון הלא-ETS. לבסוף, ניתן להעריך יכולת הנשימה מקסימלי הרביעי מורכבים על ידי ההזרקה של N, N, N', נ, - Tetramethyl - p-phenylenediamine (TMPD), ספק אלקטרון מלאכותי, ואת ascorbate. חשוב לציין כי הניסויים נערכים ב 24 °C שכן הוא הטמפרטורה בה מגודלים הזבובים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. נוגדנים הכנה

  1. להכין את הפתרונות הבאים לנתיחה, permeabilization של הרקמה.
    1. להכין תמיסת השימור: 2.77 מ"מ CaK2EGTA, 7.23 מ מ K2EGTA, 5.77 מ מ נה2ATP, מ מ 6.56 MgCl2, טאורין, 20 מ מ 15 מ מ נה2phosphocreatine, imidazole 20 מ מ, dithiothreitol 0.5 מ מ, ו 50 מ מ K-MES, pH 7.1 (ניתן לאחסן ב-20 ° C).
    2. להכין סאפונין פתרון: 5 מ"ג של סאפונין ב 1 מ"ל של תמיסת השימור (להכין טרי מדי יום).
  2. הכינו את הפתרונות הבאים לשקילת הנשימה.
    1. להכין נשימה בינוני: 120 מ"מ אשלגן כלורי, 5 מ מ ח'2PO4, 3 מ מ HEPES, 1 מ"מ EGTA, 1 מ MgCl2ו- 0.2% BSA (w/v), pH 7.2.
    2. הכינו מצעים, uncoupler, מעכבי. להמיס הכל מצעים H2O, לפזר את uncoupler FCCP, כמו גם את מעכבי אתנול מוחלטת (למעט malonate אשר הוא מדולל H2O). לנטרל את רוב סובסטרטים כמו גם malonate (ראה טבלה של חומרים). ריכוז כל נתון בפרוטוקול ריכוזים הסופי בתוך 2 מ"ל צ'יימברס.

2. הכנה וכיול של Respirometer ברזולוציה גבוהה.

  1. לשטוף את צ'יימברס, בקבוקים, פקקים של respirometer שלוש פעמים עם 70% אתנול, שלוש פעמים עם מים מזוקקים.
  2. כיול על ריכוז חמצן אפס: pipet 2.3 מ של נשימה במדיום התאים ולהוסיף 10 מ"ג נתרן dithionite. אמנם נפח החדר 2 מ"ל, 2.3 mL נוספים כדי להבטיח כי אין בועת האוויר נשאר תחת הפקק בסגירת התאים. סגור התאים עם פקקים, מודדים ריכוז החמצן במשך 10-20 דקות כיול האלקטרודות ב אפס ריכוז חמצן עם קצב צריכת החמצן שנוצר.
  3. לשטוף את הצ'יימברס במים distillated, דגירה באתנול מוחלט למשך 10 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים.
  4. כיול-אוויר רוויה: pipet 2.3 מ של נשימה בינוני בלשכה, להוסיף על פקקים, תשאף המדיום עודף על פקקים ולאחר מכן הרם את פקקים עם מרווח. עודף נשימה בינוני pipetted בלשכה (נפח של סה כ 2 מ"ל) כדי למנוע הנוכחות של בועות אוויר לאחר סגירת התאים.
  5. לפקח על צריכת חמצן למשך 45 דקות עד שעה, עד ריכוז חמצן (כחול trace) תהיה יציבה סביב 250 nM ב 24 ° C.

3. ניתוח של זבובים, Permeabilization של רקמות

  1. ודא כי כל הצעדים מבוצעים על קרח.
  2. להרדים שישה זבובים זכרים של המתח זהה, אותו גיל וגדל על דיאטה זהה על קרח כדי להקל על ניתוח של הזבובים (פראי-סוג w1118, בן, 15 ימים ניזונו קמח תירס בינוני).
  3. באמצעות אזמל ומלקחיים שקצהו פיין, לנתח את הזבובים (להסיר את הראש ואת הבטן) כדי לשמור רק את thoraxes המכיל את השרירים טיסה. שלב זה יכול להעשות בעין בלתי מזוינת. להתמודד עם thoraxes שנוצר עם מלקחיים שקצהו פיין.
  4. העברת שלושה גזור thoraxes ב- 25 מ מ פטרי המכילות 2 מ ל תמיסת השימור קפואים עם המלקחיים.
  5. עם המלקחיים שקצהו פיין, מכנית permeabilize את thoraxes על-ידי הוספת הקצה של המלקחיים thoraxes, שוב ושוב לקרוע לגזרים את הרקמה כדי להשיג באופן רופף מחובר לרשת.
  6. צלחת 24-ובכן, למלא שתי בארות עם 12.5 µL של הפתרון סאפונין ו 1 מ"ל של תמיסת השימור בריכוז הסופי של µg/mL 62.5 של סאפונין. ממלאים שתי הבארות הסמוכים 1 מ"ל של נשימה בינוני.
  7. עם המלקחיים שקצהו פיין, להעביר שלוש thoraxes permeabilized לתוך הפתרון מדולל סאפונין, דגירה עם עצבנות קלה על שייקר-מסלולית, על קרח, כעשרים דקות.
  8. לאחר הדגירה האחרון, להעביר את הסיבים הבארות הסמוכים מלאים המדיום נשימה עם עצבנות קלה, על קרח, עבור 5 דקות כדי לשטוף סאפונין.

4. קביעת משקל יבש

  1. יבש את thoraxes permeabilized על משטח סופג והיפוך 3 - 4 פעמים עם המלקחיים שקצהו הקנס כדי לוודא שלחות כל מוסר.
  2. לשקול את thoraxes שלושה ביחד על microbalance. הערה על המשקל שהושג כמו זה ישמש לנרמל את שיעור צריכת החמצן מיטוכונדריאלי.
  3. העברת רקמות באופן מיידי בכל טיפת נשימה בינוני על קרח.

5. קביעת המחירים צריכת חמצן

  1. פתח לאהלי respirometer (להסיר את פקקים) ולהוסיף 10 מ מ של פירובט, 2 מ מ של בנויים לתוך כל תא.
  2. הוסף את רקמות permeabilized ישירות לתוך התאים מלאים המדיום נשימה.
  3. החלף את פקקים באמצעות את מרווח.
  4. עם מזרק 60 מ ל, לאסוף חמצן ישירות מתוך מיכל חמצן, להזריק 2-5 מ של חמצן דרך נימי בסימפטומים של כל חדר כדי לוודא דיפוזיה חמצן דרך הרקמות לא יגביל צריכת החמצן.
  5. מכניס מזרק המילטון נימי של כל פקק כדי לוודא ש-thoraxes יישארו בבית הבליעה.
  6. לסגור את התאים לחלוטין. כאשר ריכוז החמצן הוא בסביבות 400 nM, להשגת רמות החמצן מעל אוויר רוויה (בסביבות 160% אוויר רוויה) בתוך התאים.
  7. הפסק והפעל מחדש את חימום/קירור כדי לבדוק אם בועות אוויר בתוך התאים.
  8. הזן את המסה של רקמות שקל בעבר לנרמל את המחירים הנשימה על ידי מסה של רקמה (מ ג), הצגת צריכת החמצן ספציפיים מסה (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 של רקמות).
  9. לאחר צריכת חמצן מיוצב (trace אדום), להוסיף 5 מ מ ADP עם מזרק המילטון.
  10. אחרי כל זריקה, לשטוף את המזרקים עם מים מזוקקים, 70% אתנול, ו מים מזוקקים שוב.
  11. לאחר צריכת חמצן הוא יציב שוב, להזריק µL 5 מ 4 של ציטוכרום c.
  12. להמשיך הזריקות רציפים של סובסטרטים הבאים כדי להעריך את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי-שלבים שונים החוצנים:
    1. להוסיף 5 µL של פרולין 2 מ'.
    2. להוסיף 10 µL של succinate 1 מ'.
    3. להוסיף 30 µL של גליצרול 1 מ'-3-פוספט.
  13. להזריק את uncoupler FCCP באופן טיטור לפי השלבים של 0.5-1 מיקרומטר (2 µL של פתרון 1 מ"מ) עד ריכוז אופטימלי הוא להגיע, קרי, ריכוז כדי להשיג את צריכת החמצן הגבוה אפשרי ללא עכבות (זהירות: לראות טבלה החומרים).
  14. להזריק את מעכבי הבאים ברצף כדי לעכב לחלוטין שטף האלקטרונים ב החוצנים כדי למדוד את צריכת החמצן שיורית (רוקס) דהיינו שאינו נשימתי תגובות כגון oxygenase תגובות בין היתר:
    1. להוסיף 1 µL של rotenone 1 מ מ (זהירות: ראה טבלה של חומרים).
    2. להוסיף 5 µL של malonate 2 מ' (זהירות: ראה טבלה של חומרים).
    3. להוסיף 1 µL של antimycin 5 מ מ A (זהירות: ראה טבלה של חומרים).
  15. הוסף ascorbate 0.2 מ מ ו- 0.5 מ מ TMPD ברצף לתוך התאים, החל ascorbate כדי למדוד את צריכת החמצן על ידי הרביעי מורכבים.
  16. הוסף 20 מ מ של אזיד הנתרן לעכב הרביעי מורכבים (זהירות: ראה טבלה של חומרים).
  17. לאחר האות יציב, לפתוח התאים מרווח, מחדש חמצן התאים באמצעות הזרקת 2 מ של חמצן טהור ולסגור התאים כאשר הריכוז הוא סביב 250-300 nmol.mL-1.
  18. למדוד את האות למשך 10-15 דקות ולחשב את הרקע כימי, קרי, צריכת חמצן בשל autoxidation TMPD.

6. ניקוי של Respirometer

  1. אחרי המדידות, יש לשטוף את החדרים עם מים מזוקקים פעם ולשטוף הצ'יימברס שלוש פעמים ב 70% אתנול.
  2. דגירה באתנול מוחלט למשך 10 דקות להשבית את מעכבי.
  3. לשטוף שלוש פעמים עם מים מזוקקים, למלא את החדרים עם 70% אתנול ולהחליף את פקקים, את כמוסות עד ניצול הבא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עקבות נציג של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל הינו מסופק באיור2. פירובט, בנויים מוזרק בתאי יחד עם סיבי השריר permeabilized מכונים הנשימה CI-דליפה, דהיינו, כאשר המתחם מלך החוצנים הוא מגורה על ידי NADH המופק באמצעות חמצון פירובט, בנויים באמצעות מחזור חומצה tricarboxylic (CI). במהלך זה קצב נשימה, חמצן מיטוכונדריאלי נשמר בעיקר כדי לפצות על הדליפה הפרוטונים, כלומרפרוטונים חוצה מן המרחב intermembrane למטריקס מיטוכונדריאלי, כאשר ATP סינתאז אינו פעיל (דליפה)30. כאשר נוסף של ADP, ATP סינתאז מופעל האלקטרונים מועברים מהמתחם אני לעירוי מורכבים עם זרחון הבו-זמניים של ADP לתוך ATP (CI-OXPHOS), וכתוצאה מכך גדלה צריכת החמצן מיטוכונדריאלי. היחס צימוד OXPHOS מחושבת CI-OXPHOS/CI-דליפה, נלקח בדרך כלל כסמן טוב של איכות מיטוכונדריאלי ושל צימוד מיטוכונדריאלי30. ב. דרוזופילה, יחס זה יעלה לפחות 6.0 (איור 3). אם זה מתחת למחיר הזה, זה יכול להצביע על בעיה בהכנת רקמות או על תפקוד מיטוכונדריאלי. התוספת של ציטוכרום c מאפשר קביעת השלמות של הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי, ולכן משמש פקד איכות התכשיר (איור 4). אכן, ציטוכרום c קשורה באופן רופף קרום מיטוכונדריאלי הפנימי, בדרך כלל נשטף הרחק אם הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי פגום במהלך תהליך permeabilization. כתוצאה מכך, הוספת אקסוגני ציטוכרום c יוכלו להגדיל באופן משמעותי צריכת חמצן אם נזק מיטוכונדריאלי הממברנה החיצונית אנדוגני ציטוכרום c. עלייה של פחות מ- 10-15% בצריכת חמצן (איור 4) מדגימה בדרך כלל תקינות המתאים של הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי29. איור 3 ו- 4, עקבות ירוקים התקבלו מ permeabilization שאינם נאותים וטיפול הדגימות (מוגזם קריעת הרקמות עבור איור 3, ו שנשקל לאחר זמן רב יותר על פני השטח סופג עבור איור 4), ואילו עקבות אדומים מייצגים דוגמאות שלמאחה permeabilized ולהטפל. תוצאות אלה מדגישים כי התנאים המתאימים permeabilization מכריעים עבור הערכה אמינה של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי.

סובסטרטים הבאים נעשה שימוש במהלך הניסויים לספק אלקטרונים ubiquinone, רשאית להגדיל את שטף האלקטרונים לתוך החוצנים. פרולין היא חומצת אמינו יכול לשמש מצע אנרגיה בעיקר חרקים23, אלא גם אצל יונקים במהלך הרעב חריפה או במהלך מצבים פתולוגיים37. התוספת של פרולין בלשכה מאפשר להעריך את התרומה של פרולין דהידרוגנאז (ProDH) שטף האלקטרונים ב החוצנים, כאשר האלקטרונים זורמים ממתחם שתי ProDH ואני משתתפות בתהליך OXPHOS (CI + ProDH-OXPHOS). עם תוספת של succinate, התרומה של קומפלקס II (succinate דהידרוגנאז) החוצנים יכול להיות שנצפו (CI + ProDH + CII-OXPHOS). הזרקת גליצרול-3-פוספט (G3P), מגביר עוד יותר את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי כפי סובסטרט זה מגרה את מיטוכונדריאלי גליצרול-3-פוספט דהידרוגנאז (G3PDH) המהווה חלק של הסעות glycerophosphate, העברת אלקטרונים החוצנים (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS). הן ProDH ו- G3PDH הוכחו להיות פעיל במיוחד, מספר מינים של חרקים, לכן חשובים ב פרוטוקול זה עם דרוזופילה20,21,22,23,32 .

כאשר מתקבל uncoupler ש-FCCP נוספת, הנשימה הלא מצמידים (ETS המדינה), כלומר, צריכת חמצן מירבית המייצג את קיבולת מקסימלית של החוצנים (CI + ProDH + CII + G3P-ETS). FCCP הוא protonophore שמעביר את הפרוטונים מן המרחב intermembrane אל המטריקס מיטוכונדריאלי ללא דרך V מורכבים. FCCP צריך להיות בזהירות, טיטרציה, כמו ריכוז מתחת תוצאה אופטימלית צריכת חמצן מקסימלי ללא וקצבי יציב ללא נשימה תוך כדי ריכוז מעל תוצאה אופטימלית עיכוב של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי (איור 5). ברגע של מצעים, את uncoupler נוספים, עיכוב של מתחמי שאני II, III יכול להיות ברצף המבוצעת באמצעות rotenone, malonate ו- antimycin A, בהתאמה. עם כל מעכב בשימוש, נצפית ירידה בצריכת החמצן מיטוכונדריאלי, עד שהגיע צריכת החמצן הנמוך ביותר לאחר התוספת של antimycin א הקצב הגיע לאחר התוספת של כל המעכבים צריכת החמצן שיורית30. הוא מייצג את צריכת חמצן בשל שאינם מיטוכונדריאלי חמצוני תגובות כגון תגובות oxygenase וייצור מינים תגובתי לדוגמה, יש לכן כדי להיות מופחתים מן כל שאר השיעורים נמדדים.

TMPD הוא טרנספורטר אלקטרון מלאכותי המספק אלקטרונים ישירות הרביעי מורכבים, תוך עקיפת כל את מתחמי במעלה הזרם, ומאפשר מידה לקיבולת מירבית נשימה הרביעי מורכבים. המצע הזה הוא אולם הוסיף נוטה autoxidation, אז ascorbate חייב להיות מוקדמת TMPD כדי להגביל אך לא לגמרי להימנע autoxidation הזה. לתיקון autoxidation הנותרים של TMPD, אזיד הנתרן מעכב הרביעי מורכבים מתווסף התאים, צריכת חמצן הנצרב לאחר מכן במשך 10-15 דקות. צריכת החמצן הזה מייצג לפיכך הרקע כימי, או במילים אחרות את autoxidation של TMPD זה צריך להילקח בחשבון לחישוב יכולת הנשימה מקסימלי הרביעי מורכבים.

Figure 1
איור 1 . ייצוג סכמטי של תחבורה מיטוכונדריאלי אלקטרונים על ידי מערכת התחבורה אלקטרון זרחון חמצוני ממברנה פנימית מיטוכונדריאלי. א' מתחם; II: קומפלקס II; III: מתחם השלישי; הרביעי: IV מורכבים; V: ATP סינתאז; אצטיל קואנזים a: אצטיל קואנזים A; Cyt c: ציטוכרום c; e–: אלקטרון; G3P: גליצרול-3-פוספט; G3PDH: מיטוכונדריאלי גליצרול-3-פוספט דהידרוגנאז; H+: פרוטון; PRODH: פרולין דהידרוגנאז; TCA: מחזור חומצת tricarboxylic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : עקבות נציג של ריכוז חמצן מיטוכונדריאלי (כחול trace) ואת הצריכה (אדום trace) על permeabilized thoraxes של דרוזופילה. כל זריקה מיוצג עם חץ המציין את המתחם מוזרק (Pyr: פירובט; מל: בנויים; ADP; Cyt c: ציטוכרום c; Pro: פרולין; Succ: succinate; G3P: גליצרול-3-פוספט; FCCP: ציאניד קרבוניל 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone; רוט: rotenone; מלו: malonate; נמלה ת antimycin א; TMPD: N, N, N', נ, p - Tetramethyl--phenylenediamine; Asc: ascorbate; סאז: אזיד הנתרן). כל שיעור צריכת החמצן מיטוכונדריאלי זה מסומן בגרף, כאשר צריכת חמצן (אדום trace) כבר התייצב. אפקט ציטוכרום c מציין את התקינות של הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי (ראה טקסט לפרטים). צריכת החמצן שיורית מייצג את צריכת חמצן בשל ריאקציות צדדיות חמצוני בתאים, חייב להיות מופחתים כל אחרים תעריפי נמדד. רקע כימי מציין צריכת חמצן רק בשל autoxidation TMPD, חייב להילקח בחשבון לחישוב יכולת הנשימה מקסימלי הרביעי מורכבים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : עקבות נציג של חוקי (אדום עקבות, הקאמרית A) ולקוי (ירוק, טרייס, תא B) תגובות התוספת של ADP- המעקב אדום תואם לתא A, המעקב ירוק מקבילה לתא B, במהלך הניסוי אותו. הסימן האדום היה המתקבלים שלמאחה permeabilized ואילו המעקב ירוק הושג לאחר יתר על המידה קריעת הרקמות במהלך permeabilization thoraxes. כאשר מוסיפים ADP, צפויה עלייה בצריכת חמצן, כמו הסימן האדום. OXPHOS זיווגים יחסי מחושבים CI-OXPHOS/CI-דליפה, מוצגים בגרף. יחס של פחות מ 6.0 ב דרוזופילה מעידות על בעיה בהמושבים מיטוכונדריאלי והוא אופייני של מדגם השפלה או בתפקוד מיטוכונדריאלי מיוצג על ידי הסימן ירוק. Pyr: פירובט; מל: בנויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : עקבות נציג של חוקי (אדום עקבות, הקאמרית A) ולקוי (ירוק, טרייס, תא B) בתגובה התוספת של ציטוכרום c. המעקב אדום תואם לתא A, המעקב ירוק מקבילה לתא B, במהלך הניסוי אותו. מעקב אדום היה המתקבלים thoraxes במידה מספקת permeabilized, טופל, ואילו האיתור ירוק הושג לאחר thoraxes בכוונה היו יבשים זמן רב יותר על פני השטח סופג לפני שקילה. ציטוכרום c לא בדרך כלל להגדיל את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי, כפי שניתן לראות על הסימן האדום, המציין כי הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי לא נפגע. אם, לעומת זאת, תוספת של אקסוגני ציטוכרום c מגביר באופן משמעותי צריכת החמצן מיטוכונדריאלי של יותר מ- 15%, כפי שניתן לראות על הסימן ירוק, זה מרמז כי הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי פגום, ומכאן כי המדגם יורד, צריך להיות שנמחקו. Pyr: פירובט; מל: בנויים; C: Cyt ג ציטוכרום אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : עקבות נציג של ריכוז חמצן מיטוכונדריאלי (כחול trace) וצריכה (trace האדום) לאחר טיטור של FCCP. זריקות שונות של FCCP בריכוזים מספר צריך להתבצע בזהירות כדי לקבוע את צריכת חמצן מירבית המופעלות על-ידי-זה uncoupler. ריכוזים מספיקים אינם מאפשרים את ההערכה של צריכת חמצן מירבית, מאופיינים על ידי שיעורי נשימה בלתי יציב, ואילו עודף FCCP מעכב צריכת החמצן מיטוכונדריאלי. חיצים מציינים זריקות שונות של FCCP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : הפארמצבטית של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי התעריפים במהלך ניסוי טיפוסי שהושג באמצעות שני שונים לאהלי (זכר אדום, הקאמרית A; מעקב ירוק, תא B) respirometer. המעקב אדום תואם לתא A, המעקב ירוק מקבילה לתא B, במהלך אותו הניסוי באמצעות דרוזופילה מ באותו הגיל, המין, זן וגדל על דיאטה זהה, כמו גם את הפרוטוקול המתואר. שתי דוגמאות היו מנורמל עם המסה של רקמות יבש שקל כמפורט בפרוטוקול (0.53 ו- 0.66 מ"ג עבור תאי A ו- B, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, מתוארת שיטה עבור הכנת הדוגמא לפני המידות של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי דרוזופילה. שיטה זו פותחה כדי להתגבר על בעיות שונות הקשורות הפרוטוקולים באמצעות ומשום מיטוכונדריאלי, בייחוד מבחינת משך מספר האנשים הדרושים. במקום לעבוד עם ומשום מיטוכונדריאלי בדרך כלל נדרש גם כמות גדולה של רקמות שהושג מאנשים שונים, ניסוי זה מתבצע על סיבי השריר permeabilized מן thoraxes של כמה דרוזופילה. ב פרוטוקול זה, רק שלושה אנשים נדרשים להציג תוצאות אופטימליות. לכן, מידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי בנקודות זמן שונות אפשרי גם ככה השגה כדי לסנכרן קבוצה קטנה יותר של זבובים נתקל באותו הגיל, בני אותו המין.

קודם כל, זה חשוב להשתמש דרוזופילה באותו גיל, מין, זן וגדלתי באותם תנאים כדי לקבל השתנות נמוך בתוצאות (איור 6), כמו נשימה יכול להשתנות עם הגיל, המין, גנוטיפ את הדיאטה של הזבובים. השלב הקריטי ביותר בביצוע של פרוטוקול זה הוא הליך permeabilization thoraxes. חשוב מאוד להמשיך במהירות כדי למנוע ההשפלה של רקמות, חשוב גם לוודא כי thoraxes טוב permeabilized לקיים את שיעורי מקסימלי של צריכת החמצן. כדי להבטיח permeabilization בוצעה כראוי שלמות מבנית ופונקציונליים של המיטוכונדריה נשמרים לאחר permeabilization, OXPHOS זיווגים יחס (CI-OXPHOS/CI-דליפה, איור 3), וכן את בתגובה ציטוכרום c (איור 4) משמשים פקדים איכות. יש חיסרון שיש לקחת בחשבון בין עובדים במהירות ולוודא ש-permeabilization מבוצע היטב. חשוב גם לעבוד תמיד על הקרח כאשר מניפולציה של thoraxes גזור. כדי להשיג את התוצאות ביותר לשחזור (איור 6), permeabilization הומוגנית יש צורך ותרגול הטכניקה עבור permeabilization מסייעת לוודא כי אותן תנועות חוזרים על עצמם. עוד צעד קריטי הוא קביעת המשקל היבש של המדגם. ואכן, לאחר thoraxes מודגרת, הם מאוד רגישים, שביר, נוטה השפלה. לכן, באופן דומה כדי permeabilization, במהירות הליך קביעת משקל יבש חשוב. מצד שני, חשוב לקבוע את המשקל עם דיוק כמו התוצאות הן מנורמל על ידי המסה של הרקמה. גם ניתן למטב את כמות thoraxes בשימוש. הפרוטוקול ניתן להתאים לשימוש של החזה יחיד לכל חדר35, אבל יכול להיות אבוד רמה מסוימת של רזולוציה במדידת צריכת החמצן ככל בקביעת משקל יבש. ניתן להגדיל את כמות thoraxes במידת הצורך, אך חשוב לציין כי המיטוכונדריה יותר במדגם, גבוה יותר את צריכת החמצן ואת התאים יהיו לכן להיות reoxygenated. Reoxygenation הזה יכול להיעשות על-ידי פתיחת התאים ולהזריק חמצן, אך יגדיל את ההסתברות כדי להוסיף בועות אוויר בבית הבליעה. לכן, אם הדבר אפשרי, לנסות למנוע את הצורך reoxygenate של הצ'יימברס (למעט כאשר יש יכולת הנשימה מקסימלי הרביעי מורכבים שייקבע). לפני הפעלת הניסויים, אופטימיזציה של ריכוז המצע יש גם צורך להשיג את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי הגבוהה ביותר ללא התבוננות מעכבות ההשפעות עקב ריכוז יתר. לאהלי respirometer גם צריך לנקות היטב על מנת למנוע מציג פוטנציאליים. חשוב להתחיל לנקות עם מים distillated ולאחר מכן 70% אתנול להיפטר מציג ביולוגי פוטנציאלי. בעקבות כך, דגירה אתנול מוחלט למשך 10 דקות מומלץ כדי למנוע זיהום של מעכבי הידרופובי. לבסוף, שטיפה הצ'יימברס במים distillated וממלאים אותם עם 70% אתנול יימנע מציג פוטנציאליים עד ניצול הבא.

הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לחקור את ההשפעה של אחרים סובסטרטים או מעכבי שונים. לדוגמה, חלבון מעניין ללמוד הוא המוביל פירובט מיטוכונדריאלי (MPC). התפקיד של חלבון זה הוא להעביר פירובט המופקים על ציטוזול לתוך מאטריקס מיטוכונדריאלי. לאחרונה הוצע לשחק תפקיד חשוב האפנון של חילוף החומרים במהלך מצבים פתולוגיים כגון במהלך סוג 2 סוכרת38. כדי לחקור את ההשפעה של החלבון MPC על חילוף החומרים מיטוכונדריאלי, זה שימושי להתחיל הזריקות עם פירובט, רק שבמקום פירובט, בנויים באותו זמן. לכן, ההשפעה של פירובט הוא למד באופן עצמאי מן ההשפעה של בנויים, כפי האחרון מוזרק רק לתמוך מחזור חומצה tricarboxylic ולהבטיח כי intermediates לא התרוקנו. אפשרי גם להשתמש מעכבים של MPC39 כדי להעריך אם מגבלה של המשלח הזה במקום החמצון של פירובט נצפית. . אז, זה יהיה ניתן לצפות משמרת פוטנציאליים ב מקור דלק מועדף על נשימה40. אפשרי גם להשמיט כמה מצעים כדי לפשט את הפרוטוקול, אם זה לא רלבנטי לצורך המחקר. לדוגמה, כדי ללמוד על תפקוד של המתחם אני בלבד, אין צורך להשתמש הכל מצעים הוצג פרוטוקול זה.

פרוטוקול זה מציג מספר מגבלות המסיטים מתנאי ויוו . המידות של צריכת החמצן מיטוכונדריאלי נרשמים כאשר המדיום נשימה היא מעל אוויר-רוויה, כמו חמצן טהור מוזרק כדי למנוע הגבלה של דיפוזיה חמצן בתוך רקמת30. יתר על כן, הריכוזים של סובסטרטים מוזרקים עודף, אשר לא עוקבים-התנאים ויוו . חשוב גם לציין כי הגיל, המין, זן, הדיאטה של דרוזופילה יכול להשפיע על התוצאות. פרמטרים אלה ולכן הם להילקח בחשבון כאשר לפרש את התוצאות. שיטה זו היא תנאי עם זאת קרוב יותר פיזיולוגית מאשר שיטות שימוש ומשום מיטוכונדריאלי כדי למדוד את צריכת החמצן מיטוכונדריאלי, כמו האינטראקציות עם רכיבים אחרים התאית, את השלמות. המבנית של המיטוכונדריה, מורפולוגיה הם שנשמרת31. חשוב לציין כי ומשום מיטוכונדריאלי הן פרמטרים יותר יתרון כאשר נוספים כגון ROS ייצור או יעילות מיטוכונדריאלי (יחס P/O) חייב להיות נמדד27.

ניתן להשתמש בשיטה זו על מנת להשיג מטרות שונות, החל את ההבנה של תפקוד מיטוכונדריאלי המנגנון הבסיסי של מחלות מטבוליות, בוחן את ההשפעות של תרכובות שונות על פונקציות מיטוכונדריאלי תחת פתולוגי תנאים. יתר על כן, זה יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעות של מספר לחצים סביבתיים על חילוף החומרים מיטוכונדריאלי, כגון שינויים דיאטה או טמפרטורה. לדוגמה, זה אפשרי ללמוד את היעילות של מולקולות ביו סינטטי על הפונקציות מיטוכונדריאלי ועל לטיפול dysfunctions מיטוכונדריאלי. שיטה זו היא גם כלי טוב כדי ללמוד את הפונקציות מיטוכונדריאלי בנקודות זמן שונות, מה שהופך את זה מאוד רלוונטי לצורך המחקר של המנגנונים הבסיסיים הקשורים את תהליך ההזדקנות. ההערכה של חילוף החומרים מיטוכונדריאלי באמצעות צריכת החמצן באמצעות permeabilized thoraxes יהיה בהחלט לעזור לשפר את הידע שלנו על התפקיד של חילוף החומרים מיטוכונדריאלי כאשר התא חשוף לתנאים מאתגרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי מענקים הלאומית למדעים ואת המועצה למחקר הנדסי (NSERC, גילוי גרנט), אוניברסיטת דה מונקטון NP. LHB הייתי רוצה להכיר את התמיכה המימון של המכון הקנדי של הבריאות מחקר (CIHR), קרן חדשנות ניו ברנזוויק (NBIF) ושל אוניברסיטת דה מונקטון. העבודה של EHC נתמך על ידי אגודת האלצהיימר של קנדה, קנדה המוח, NSERC, קרן סרטן השד קנדי, ניו ברנזוויק חדשנות קרן, קרן למחקר בריאות ניו ברנזוויק ו אוניברסיטת דה Moncton.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-resolution respirometer Oxygraph O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 10022-02 Startup O2K respirometer kit
 
O2K-Titration Set  Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20820-03 Hamilton syringes with different volumes
 
Datlab software Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria 20700 Software for data acquisition and analysis
 
Fine-tipped antimagnetic forceps VWR 82027-400
 
Secura225D-1S-DQE Sartorius AG, Goettingen, Germany Semi-micro balance (distributed by several companies) 
 
Drosophila melanogaster wild-type w1118 Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA
Storage Condition: 24 °C
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378 EGTA
Storage Condition: RT
KOH Sigma-Aldrich P1767 CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
CaCO3 Sigma-Aldrich C4830
Storage Condition: RT
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
Storage Condition: -20 °C
MgCl2.6H2O Sigma-Aldrich M9272
Storage Condition: RT
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Storage Condition: RT
Na2Phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936
Storage Condition: -20 °C
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Storage Condition: RT
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Storage Condition: 2-8 °C
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Storage Condition: RT
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S7900 Saponin
Storage Condition: RT
Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.
KCl Sigma-Aldrich P9541
Storage Condition: RT
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
Storage Condition: RT
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Storage Condition: RT
BSA Sigma-Aldrich 05470
Storage Condition: 2-8 °C
Na2S2O4 Sigma-Aldrich 157953 Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Pyruvate
Storage Condition: 2-8 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich M1000 Malate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C.
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A5285 ADP
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C.
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C7752 Cytochrome c
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
L-Proline Sigma-Aldrich P0380 Proline
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378 Succinate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C.
sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt Sigma-Aldrich G7886 Glycerol-3-phosphate
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C.
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920 FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C.
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C.
Malonic acid Sigma-Aldrich M1296 Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage.
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674 Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.
Storage Condition: -20 °C
Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394 TMPD
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Ascorbate
Storage Condition: RT
Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at  -20 °C.
NaN3 Sigma-Aldrich S2002 Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
  2. Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
  3. Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
  4. Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
  5. Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
  6. Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
  7. Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
  8. Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
  9. Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
  10. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  11. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  12. Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
  13. Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120 (4), 483-495 (2005).
  14. Szibor, M., Holtz, J. Mitochondrial ageing. Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).
  15. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  16. López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
  17. Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
  18. Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. Nutrient-sensing mechanisms and pathways. Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).
  19. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
  20. McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
  21. Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).
  22. Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
  23. Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).
  24. Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
  25. Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
  26. Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
  27. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  28. St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
  29. Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
  30. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  31. Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
  32. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
  33. Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
  34. Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
  35. Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
  36. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  37. Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
  38. Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
  39. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  40. McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).

Tags

ביוכימיה בעיה 134 המיטוכונדריה מערכת התחבורה אלקטרון חילוף החומרים respirometry ברזולוציה גבוהה דרוזופילה melanogaster permeabilization
מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Simard, C. J., Pelletier, G.,… More

Simard, C. J., Pelletier, G., Boudreau, L. H., Hebert-Chatelain, E., Pichaud, N. Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue. J. Vis. Exp. (134), e57376, doi:10.3791/57376 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter