Summary
In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.
Abstract
De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, vertegenwoordigt een opkomende model voor de studie van het metabolisme. Inderdaad, drosophila structuren homoloog aan menselijke organen hebben, beschikken over zeer geconserveerde stofwisselingsroutes en hebben een relatief korte levensduur waarmee de studie van verschillende fundamentele mechanismen in een korte periode van tijd. Het is echter verrassend dat een van de mechanismen die essentieel zijn voor cellulaire metabolisme, de mitochondriale ademhaling, niet grondig in dit model onderzocht is. Het is waarschijnlijk omdat de maatregel van de mitochondriale ademhaling in Drosophila meestal een zeer groot aantal personen vereist en de resultaten niet zeer reproduceerbaar zijn. Hier, wordt een methode waardoor de nauwkeurige meting van mitochondriale zuurstofverbruik met minimale hoeveelheden weefsel van Drosophila beschreven. Bij deze methode worden de thoraxes ontleed en permeabel, zowel mechanisch met scherpe pincet en chemisch saponine, waardoor verschillende verbindingen te steken van het celmembraan en het moduleren van de mitochondriale ademhaling. Na permeabilization, wordt een protocol uitgevoerd om te evalueren van de capaciteit van de verschillende complexen van het elektronentransport systeem (ETS) om te oxideren verschillende substraten, evenals hun reactie op een uncoupler en verschillende remmers. Deze methode biedt veel voordelen ten opzichte van methoden met behulp van mitochondriale isolatie, aangezien er meer fysiologisch relevant omdat de mitochondriën zijn nog steeds interactie met de andere cellulaire componenten en de mitochondriale morfologie is geconserveerd. Bovendien staalvoorbereiding zijn sneller, en de verkregen resultaten zijn zeer reproduceerbaar. Door het combineren van de voordelen van Drosophila als een model voor de studie van het metabolisme met de evaluatie van de mitochondriale ademhaling, belangrijke nieuwe inzichten kunnen worden onthuld, vooral wanneer de vliegen ondervindt verschillende milieu- of pathofysiologische voorwaarden.
Introduction
De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is gebruikt als een modelorganisme voor genetisch onderzoek voor meer dan een eeuw1. De studie van dit organisme heeft niet alleen geleid tot belangrijke fundamentele kennis over geslachtsgebonden overerving2, mutatie tarief3, de ontwikkeling van neurale systeem en de cel lot bepaling4, maar ook onlangs heeft ontpopt als een waardevol instrument te bestuderen van de mechanismen die inherent zijn aan verschillende ziekten zoals Alzheimer en Parkinson5,6. Bovendien is het een populair model te bestuderen van het verouderingsproces, zoals ze in groot aantal over een korte periode van tijd kunnen worden verhoogd en een korte levensduur hebben. Zij bezitten ook homologe structuren aan menselijke organen, zoals een hart oenocytes (hepatocyte-achtige cellen), fat organen (functioneren op dezelfde manier als de lever en wit vetweefsel), de insuline producerende cellen (equivalent aan β-pancreatic cellen), evenals de Hemolymfe transport van metabolieten (analoog aan het bloed van gewervelde dieren)7. Bovendien is de centrale trajecten van intermediaire metabolisme (met inbegrip van de insuline/insuline-achtige groeifactor-achtige signalering traject en doel van Rapamycin-TOR trajecten) zijn ook zeer geconserveerde7. Om deze redenen hebben onlangs Drosophila benut om te beschrijven de fundamentele mechanismen waarmee metabolisme, vooral in pathologische omstandigheden die inherent zijn aan menselijke metabole ziekten zoals diabetes,8. Een belangrijk onderdeel van het metabolisme is het mitochondrion die integreert meerdere trajecten en voert een van life's meest belangrijke biologische functies, productie van ATP, via de oxidatieve fosforylatie proces (OXPHOS). Gezien hun centrale rol in het metabolisme van het organisme is het niet verwonderlijk dat mitochondriale stoornissen zijn betrokken in vele ziekten zoals Parkinson,9 en10ziekten van Alzheimer, evenals in Amyotrofische laterale sclerose 11 , 12. ze zijn ook fundamentele determinanten van het verouderingsproces. Inderdaad, ze zijn de belangrijkste producenten van reactieve zuurstof soorten (ROS) in de cel, die schadelijk voor de cel in hoge concentraties t/m11van de oxidatieve schade zijn kan. Veroudering is ook gekoppeld aan de accumulatie van beschadigde of gemuteerde mitochondriaal DNA-13, mitophagy disfuncties14,15 , alsmede bijzondere waardevermindering van mitochondriale biogenese16geweest. Mitochondriën zijn ook belangrijke determinanten van de cel van de homeostase als ze kunnen gebruik maken van verschillende substraten om aan te passen van de verschillende cellulaire functies aanroept volgens de overvloed of schaarste van macronutriënten17,18.
Inderdaad, de verschillende voedingsstoffen in de voeding (koolhydraten, lipiden en eiwitten) zijn verteerd, geabsorbeerd en vervoerd in de cellen. Ze worden vervolgens getransformeerd in het cytosol en de afgeleide substraten worden getransporteerd naar de mitochondriale matrix waar ze verminderen equivalenten, zoals NADH en FADH2-19 produceren. Deze vermindering equivalenten zijn vervolgens geoxideerd door verschillende enzymatische complexen van het elektronentransport systeem (ETS). Deze complexen zijn ingebed in de mitochondriale binnenste membraan, zoals Complex I en complexe II. Bovendien vertegenwoordigen andere enzymatische complexen zoals de mitochondriale glycerol-3-fosfaat dehydrogenase en de proline dehydrogenase alternatieve routes voor de toetreding van de elektronen in de ETS20,21. Deze 'alternatieve' complexen zijn met name belangrijk bij insecten, als gelang van de diersoort, zij kunnen actief deelnemen te verhogen van de ademhaling20,22,23,21. Elektronen uit deze ETS Voersystemen worden overgebracht naar de ubiquinone en vervolgens complexe III, en vervolgens naar complexe IV, tot de definitieve acceptor, moleculaire zuurstof. Deze elektronen overdracht genereert een proton-stuwende kracht over de innerlijke mitochondriale membraan de fosforylatie van ADP rijden naar ATP bij complexe V (Figuur 1). Gezien de centrale rol van mitochondria in cel homeostase, bestuderen van mitochondriale metabolisme met behulp van het relevante model D. melanogaster vertegenwoordigt een krachtig hulpmiddel om af te bakenen de onderliggende mechanismen van diverse pathofysiologische voorwaarden of onder cellulaire en milieu benadrukt. Verrassend echter slechts een handvol studies gemeten eigenlijk mitochondriale ademhaling in Drosophila24,25,26. Inderdaad, moeten experimenten gericht op het beoordelen van de mitochondriale zuurstofverbruik het isolement van de mitochondriën. Hoewel voordelig voor het meten van verschillende mitochondriale functies (zoals ROS productie of P/O verhouding als markering van mitochondriale efficiëntie27,28), vereisen deze isolatie in het algemeen liever grote hoeveelheden van weefsel van verschillende individuen24,29. Deze eis voor grote hoeveelheden weefsel en individuen is een belangrijke beperkende factor, vooral gezien het feit dat alle individuen dezelfde leeftijd moeten worden en bij voorkeur van hetzelfde geslacht voor de experimenten, waardoor de maatregel van de ademhaling op verschillende tijden moeizame wijst op zijn best. Bovendien, terwijl mitochondriale isolatie significante inzicht in de fundamentele mechanismen bestuur mitochondriale metabolisme bieden kunnen, de gebruikte methoden voor het isoleren van de mitochondriën hebben enkele nadelen zoals de moeilijkheid om repliceerbaar resultaten te verkrijgen , verstoring van de mitochondriale netwerk, en wijziging van mitochondriale structuur en functie29,30,31.
Het doel van deze studie is te presenteren van een robuust protocol voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik in Drosophila met behulp van slechts een minimale hoeveelheid weefsel van zeer weinig individuen. Dit protocol bestaat uit het meten van mitochondriale zuurstof verbruik in situ spiervezels permeabel29 van Drosophila thoraxes gebruiken in combinatie met hoge resolutie respirometrie32,33, 34 , 35. deze methode heeft ook extra voordelen in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-methode omdat de interacties met de andere componenten van de cel als goed als mitochondriale structuur en functie worden meer bewaard in permeabel vezels29,31,36, waardoor deze aanpak meer fysiologisch relevante. Met dit protocol, kunnen mitochondriale functies nauwkeurig getoetst met behulp van hoge-resolutie respirometrie in slechts drie thoraxes van Drosophila, met substraten toestaan van de bepaling van zuurstofverbruik in verschillende stappen van de ETS. Daarom kon dit protocol helpen beantwoorden van belangrijke vragen over de fundamentele mechanismen waarmee de stofwisseling in het kader van vele milieu- of pathofysiologische omstandigheden door te profiteren van de Drosophila model.
Meten van het zuurstofverbruik in verscheidene verschillende stappen van de ETS en evalueren van hoe verschillende substraten bijdragen aan de ademhaling, de verschillende substraten (Figuur 1), de uncoupler, en remmers zijn gebruikte30 na permeabilization van de weefsel. Specifiek, worden opeenvolgende toevoegingen van verschillende substraten uitgevoerd om het stimuleren van de toetreding van elektronen door verschillende complexen van de ETS. Een uncoupler, carbonyl cyanide 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), wordt vervolgens toegevoegd aan de optimale concentratie voor het meten van de ademhaling niet-gekoppeld, dat wil zeggen, de niet-phosphorylating ademhaling gestimuleerd om maximaal zuurstofverbruik. Opeenvolgende remmingen van complexen die i, II en III worden vervolgens uitgevoerd om te controleren de residuele zuurstofverbruik thats als gevolg van de niet-ETS oxidatiereacties. Ten slotte, complexe IV maximale ademhaling capaciteit kan worden geëvalueerd door de injectie van N, N, N', N, - Tetramethyl - p-fenyleendiamine (TMPD), een kunstmatige elektron provider, en ascorbaat. Het is belangrijk op te merken dat de experimenten zijn uitgevoerd op 24 °C omdat het de temperatuur waarop de vliegen zijn gerezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. reagentia voorbereiding
- De volgende oplossingen voorbereiden op dissectie en permeabilization van het weefsel.
- Bereiden van behoud oplossing: 2,77 CaK2EGTA, 7.23 mM K2EGTA, 5.77 mM nb2ATP, 6.56 mM MgCl2, taurine, 20 mM 15 mM nb2phosphocreatine, 20 mM imidazool, 0.5 mM dithiothreitol, en 50 mM K-MES, pH 7.1 (kan worden opgeslagen bij-20 ° C).
- Bereid saponine oplossing: 5 mg saponine in 1 mL behoud oplossing (bereiden verse dagelijks).
- Voorbereiding van de volgende oplossingen voor het meten van de ademhaling.
- Bereiden van ademhaling medium: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2en 0,2% BSA (w/v), pH 7,2.
- Bereiden substraten, uncoupler, remmers. Los van alle substraten in H2O en los van de uncoupler FCCP, alsmede de remmers in ethanol absolute (behalve malonaat die is verdund in H2O). Allermeest naar de substraten, evenals malonaat (Zie Tabel van materialen) te neutraliseren. Alle concentraties die in het protocol zijn eindconcentraties binnen 2 mL kamers.
2. voorbereiding en kalibratie van de hoge-resolutie Respirometer.
- Het wassen van de kamers, caps en stoppen van de respirometer drie keer met 70% ethanol en driemaal met gedestilleerd water.
- Kalibreren op nul zuurstofconcentratie: Pipetteer 2,3 mL voor ademhaling medium in de kamers en 10 mg natrium dithioniet toe te voegen. Hoewel het maximale volume van de kamer is 2 mL, worden 2,3 mL toegevoegd om ervoor te zorgen dat geen luchtbel blijft onder de stop bij het sluiten van de kamers. Sluit de kamers met de stoppers en meten van de zuurstofconcentratie voor 10-20 min. kalibreren de elektroden op nul zuurstofconcentratie met de resulterende zuurstof verbruik tarief.
- De kamers met distillated water wassen, incubeer in absolute ethanol gedurende 10 minuten en spoel na met gedestilleerd water.
- Kalibreren op lucht verzadiging: Pipetteer 2,3 mL voor ademhaling medium in de kamers, de stoppers invoegen, gecombineerd het overtollige medium op de top van de stoppers en til de stoppen met het tussenstuk. Overtollige ademhaling medium is afgepipetteerde in de kamers (volume van 2 mL totaal) om te voorkomen dat de aanwezigheid van luchtbellen na het sluiten van de kamers.
- Controleren van het zuurstofverbruik gedurende 45 minuten tot een uur, totdat de zuurstofconcentratie (blauwe trace) stabiel rond 250 is nM bij 24 ° C.
3. dissectie van vliegen en Permeabilization van weefsel
- Zorg ervoor dat alle maatregelen worden uitgevoerd op het ijs.
- Anaesthetize zes mannelijke vliegen van dezelfde stam, hetzelfde leeftijd en getogen op hetzelfde dieet op ijs ter vergemakkelijking van de dissectie van de vliegen (wild-type w1118, 15 dagen oud, gevoed op de drager van maïsmeel).
- Met behulp van een scalpel en pincet boete-tipped, ontleden de vliegen (Verwijder de hoofden en de buikjes) om te houden alleen de thoraxes met de vlucht spieren. Deze stap kan worden gedaan met het blote oog. De resulterende thoraxes behandelen met een boete-tipped Tang.
- Overdracht drie ontleed thoraxes in een 25 mm petrischaal met 2 mL ijskoud behoud oplossing met behulp van de verlostang.
- Met de fine-tipped Tang, mechanisch permeabilize de thoraxes door het invoegen van het uiteinde van de verlostang in de thoraxes en herhaaldelijk scheuren het weefsel om te verkrijgen van een losjes verbonden netwerk.
- In een 24-well plaat, door twee putten te vullen met 12,5 µL van het Zeepkruid oplossing en 1 mL behoud oplossing om een eindconcentratie van 62,5 µg/mL saponine. Vul de twee aangrenzende putten met 1 mL van ademhaling medium.
- Met de fine-tipped Tang, drie permeabel thoraxes Pipetteer in de oplossing van verdunde saponine en incubeer met milde agitatie op een rondschudapparaat, op ijs, voor 20 min.
- Na de laatste incubatie, overdracht van de vezels in de aangrenzende putten gevuld met het medium van de ademhaling met milde agitatie, op ijs, voor 5 min te spoelen uit de saponine.
4. bepaling van het droog gewicht
- De permeabilized thoraxes op een absorberend oppervlak droog en flip 3 - 4 keer met behulp van de verlostang boete getipt om ervoor te zorgen dat alle vocht wordt verwijderd.
- De drie thoraxes samen op een microbalans wegen. Opmerking het verkregen gewicht zoals het zal worden gebruikt om te normaliseren van de mitochondriale zuurstof verbruik.
- Het weefsel onmiddellijk in een daling van ademhaling medium overbrengen op het ijs.
5. zuurstof verbruik tarieven bepaling
- Openen van de kamers van de respirometer (Verwijder de stoppen) en voeg van 10 mM van pyruvaat en 2 mM malate in elke kamer.
- Voeg de permeabilized weefsels direct in de kamers gevuld met het medium van de ademhaling.
- Vervang de stoppen met behulp van het tussenstuk.
- Met een injectiespuit 60 mL zuurstof rechtstreeks ophalen in een zuurstoftank en injecteren van 2-5 mL zuurstof via de capillaire stop van elke kamer om ervoor te zorgen dat er zuurstof verspreiding via het weefsel zuurstofverbruik niet zal verkleinen.
- Plaats een Hamilton injectiespuit in het capillair van elke Stop om ervoor te zorgen dat de thoraxes in de bedwelmingsruimte blijven.
- De kamers volledig afsluiten wanneer de zuurstofconcentratie ongeveer 400 is nM, zuurstofniveaus boven lucht verzadiging bereiken (ongeveer 160% verzadiging lucht) binnen de kamers.
- Stoppen en herstarten van de stirrers om te controleren op luchtbellen in de kamers.
- Voer de massa van weefsel woog eerder om het normaliseren van de tarieven van de ademhaling door de massa van weefsel (mg), massa-specifieke zuurstofverbruik (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 van weefsel) weer te geven.
- Zodra het zuurstofverbruik is gestabiliseerd (rode trace), voeg 5 mM ADP met een spuit van Hamilton.
- Na iedere injectie, spoel het spuiten met gedestilleerd water, 70% ethanol, en gedestilleerd water weer.
- Zodra het zuurstofverbruik stabiel weer is, injecteren 5 µL van een 4 mM van cytochroom c.
- Overgaan tot de sequentiële injecties van de volgende substraten te evalueren van de mitochondriale zuurstofverbruik in verschillende stappen van de ETS:
- Voeg 5 µL van een Proline 2 M.
- Voeg 10 µL van een 1 M-succinaat.
- Voeg 30 µL van een 1 M glycerol-3-fosfaat.
- Injecteren van de uncoupler FCCP in een titratie wijze door stappen van 0,5-1 µM (2 µL van een oplossing van 1 mM) totdat de optimale concentratie is bereikt, dat wil zeggen, de concentratie te bereiken van de hoogste mogelijke zonder remming zuurstofverbruik (Let op: Zie tabel van materialen).
- Injecteer de volgende remmers opeenvolgend om de flux van het elektron in de ETS volledig te remmen om te meten de residuele zuurstofverbruik (ROX) dat wil zeggen niet-respiratoire reacties zoals oxygenase reacties onder andere:
- Voeg 1 µL van een 1 mM rotenon (Let op: Zie Tabel van materialen).
- Voeg 5 µL van een 2 M malonaat (Let op: Zie Tabel van materialen).
- Voeg 1 µL van een 5 mM antimycin A (Let op: Zie Tabel van materialen).
- 0.2 mM ascorbaat en 0,5 mM TMPD achter elkaar naar de kamers, beginnend met de ascorbaat voor het meten van het zuurstofverbruik door complexe IV toevoegen.
- Toevoegen van 20 mM van natriumazide voor de remming van complexe IV (Let op: Zie Tabel van materialen).
- Zodra het signaal stabiel is, openen de kamers met de spacer opnieuw de kamers zuurstof door het injecteren van 2 mL zuivere zuurstof en de kamers sluiten wanneer de concentratie ongeveer is 250-300 nmol.mL-1.
- Het signaal voor 10-15 min te meten en berekenen van de chemische achtergrond, dat wil zeggen, het zuurstofverbruik als gevolg van autoxidation van TMPD.
6. het reinigen van de Respirometer
- Na de metingen, eenmaal spoelen van de kamers met gedestilleerd water en spoel de kamers driemaal in 70% ethanol.
- Incubeer in absolute ethanol voor 10 min naar de inactivering van de remmers.
- Spoel driemaal met gedestilleerd water, vul de kamers met 70% ethanol en vervangen de stoppers en de doppen tot volgend gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een representatieve spoor van mitochondriale zuurstofverbruik met behulp van het protocol die hierboven beschreven wordt gegeven in Figuur 2. De pyruvaat en malate geïnjecteerd in de kamers samen met de permeabilized spiervezels zijn bedoeld om de CI-lek ademhaling, dat wil zeggen, wanneer het complex I van de ETS wordt gestimuleerd door de NADH geproduceerd door oxidatie van pyruvaat en malate via de tricarboxylic acid cyclus (CI). Tijdens deze ademhalingsfrequentie, wordt de mitochondriale zuurstof voornamelijk gehouden ter compensatie van het proton lek, dat wil zeggen, protonen overschrijding van de intermembrane ruimte naar de mitochondriale matrix, wanneer de ATP-synthase is niet actief (lek)30. Wanneer de ADP is toegevoegd, de ATP-synthase is geactiveerd en de elektronen worden overgedragen van het complex I tot en met de complexe IV met gelijktijdige fosforylatie van ADP in ATP (CI-OXPHOS), wat resulteert in verhoogde mitochondrial zuurstofverbruik. De verhouding van de koppeling OXPHOS wordt berekend als CI-OXPHOS/CI-lek en wordt meestal beschouwd als een goede indicator van mitochondriale kwaliteit en van mitochondriale koppeling30. In Drosophila, moet deze verhouding ten minste meer dan 6.0 (Figuur 3). Als het lager dan deze waarde is, kan het duiden op een probleem met de voorbereiding van het weefsel of een mitochondriale dysfunctie. De toevoeging van cytochroom c kan de bepaling van de integriteit van de buitenste mitochondriale membraan en wordt daarom toegepast als een kwaliteitscontrole van het preparaat (Figuur 4). Inderdaad, cytochroom c is losjes gebonden aan de innerlijke mitochondriale membraan en is meestal weggewassen als de buitenste mitochondriale membraan is beschadigd tijdens het permeabilization. Dientengevolge, toevoegen van exogene cytochroom c, zal dit aanzienlijk toenemen voor zuurstofverbruik als de buitenste mitochondriale membraan is beschadigd en de endogene cytochroom c verloren. Een stijging van minder dan 10-15% in zuurstofverbruik (Figuur 4) illustreert meestal passende integriteit van de mitochondriale buitenmembraan29. In Figuur 3 en 4, de groene sporen werden verkregen uit niet-adequate permeabilization en behandeling van de monsters (overdreven scheuren van het weefsel voor Figuur 3en gewogen na een langere tijd op het absorberend oppervlak voor Figuur 4), Overwegende dat de rode sporen monsters voldoende permeabel en behandeld vormen. Deze resultaten benadrukken dat passende permeabilization voorwaarden cruciaal voor een betrouwbare beoordeling van mitochondriale zuurstofverbruik zijn.
De volgende substraten gebruikt tijdens de experimenten bieden van elektronen aan de ubiquinone en mogen verhogen de flux van het elektron in de ETS. Proline is een aminozuur dat kan worden gebruikt als energie substraat met name insecten23, maar ook zoogdieren tijdens acute honger of pathologische condities37. De toevoeging van proline in de kamers kunt om te evalueren van de bijdrage van proline dehydrogenase (ProDH) de flux van het elektron in de ETS-regeling, wanneer de elektronen stromen van beide complex ik en ProDH en nemen deel aan het proces van OXPHOS (CI + ProDH-OXPHOS). Met toevoeging van succinaat, kan de bijdrage van complexe II (succinaat dehydrogenase) bij de ETS worden waargenomen (CI + ProDH + CII-OXPHOS). Injectie van glycerol-3-fosfaat (G3P), de mitochondriale zuurstofverbruik verder neemt toe naarmate dit substraat stimuleert de mitochondriale glycerol-3-fosfaat dehydrogenase (G3PDH), dat deel van de glycerophosphate shuttle en de overdracht uitmaakt elektronen aan de ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS). Zowel ProDH en G3PDH hebben aangetoond dat met name actief zijn in verschillende soorten insecten en zijn daarom belangrijk in dit protocol met Drosophila20,21,22,23,32 .
Wanneer de uncoupler die FCCP wordt toegevoegd, de niet-gekoppelde ademhaling (ETS staat) wordt verkregen, dat wil zeggen, de consumptie van de maximale zuurstof vertegenwoordigt de maximale capaciteit van het ETS (CI + ProDH + CII + G3P-ETS). De FCCP is een protonophore die de protonen van de intermembrane ruimte naar de mitochondriale matrix vervoert zonder complexe V passeren. De FCCP moet zorgvuldig worden getitreerd, als de concentraties onder optimaal resultaat in niet-maximaal zuurstofverbruik en niet-stable ademhaling tarieven terwijl concentraties boven optimaal resultaat bij inhibitie van het mitochondriaal zuurstofverbruik (Figuur 5). Zodra de substraten en de uncoupler worden toegevoegd, remming van complexen die i, II en III opeenvolgend kunnen uitgevoerd met behulp van rotenon, malonaat en antimycin A, respectievelijk. Met elke remmer gebruikt, wordt een afname van de mitochondriale zuurstofverbruik waargenomen, tot het bereiken van het laagste zuurstofverbruik na toevoeging van antimycin A. Het percentage bereikt na de toevoeging van alle de remmers de resterende zuurstof verbruik30 is. Hij vertegenwoordigt het zuurstofverbruik als gevolg van niet-Mitochondriale oxidatieve reacties zoals oxygenase reacties en reactieve soorten productie bijvoorbeeld, en heeft daarom te worden afgetrokken van de andere tarieven gemeten.
TMPD is een kunstmatige elektron vervoerder waarmee elektronen rechtstreeks naar complexe IV, het omzeilen van alle de complexen stroomopwaarts, waardoor de meting van de complexe IV maximale ademhaling capaciteit. Dit substraat is echter gevoelig voor autoxidation, zodat ascorbaat moet worden toegevoegd voorafgaande aan TMPD te beperken, maar deze autoxidation niet helemaal te vermijden. Om te corrigeren voor de resterende autoxidation van TMPD, de complexe IV remmer natriumazide wordt toegevoegd aan de kamers en het zuurstofverbruik is vervolgens opgenomen gedurende 10-15 minuten. Deze zuurstofverbruik geeft daarom de chemische achtergrond, of met andere woorden de autoxidation van TMPD die voor de berekening van complexe IV maximale ademhaling capaciteit rekening moet worden gehouden.
Figuur 1 . Schematische weergave van mitochondriaal elektronentransport door het elektronentransport systeem en de oxidatieve fosforylatie in de mitochondriale membraan van de innerlijke. I: complex I; II: complexe II; III: complexe III; IV: complexe IV; V: ATP-synthase; Acetyl-CoA: acetyl coenzym A; CYT c: cytochroom c; e-: elektron; G3P: glycerol-3-fosfaat; G3PDH: mitochondriale glycerol-3-fosfaat dehydrogenase; H+: proton; PRODH: proline dehydrogenase; TCA: tricarboxylic acid cyclus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief sporen van mitochondriale zuurstofconcentratie (blauwe trace) en verbruik (rode trace) voor permeabel thoraxes van Drosophila. Elke injectie wordt weergegeven met een pijl die aangeeft van de compound geïnjecteerd (Pyr: pyruvaat; mal: malate; ADP; CYT c: cytochroom c; Pro: proline; Succ: succinaat; G3P: glycerol-3-fosfaat; FCCP: carbonyl cyanide 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone; Rot: rotenon; Malo: malonaat; Ant A: antimycin A; TMPD: N, N, N', N, - Tetramethyl - p-fenyleendiamine; ASC: ascorbaat; SAZ: natriumazide). Elke mitochondriale zuurstof verbruik tarief is aangeduid op de grafiek, wanneer het zuurstofverbruik (rode trace) zich heeft gestabiliseerd. Cytochroom c effect duidt de integriteit van de buitenste mitochondriale membraan (zie tekst voor meer informatie). Residuele zuurstofverbruik vertegenwoordigt het zuurstofverbruik als gevolg van oxidatieve kant reacties in de cellen en moet aan alle andere prijzen gemeten worden afgetrokken. Chemische achtergrond duidt het zuurstofverbruik alleen te wijten aan autoxidation van TMPD en moet worden in aanmerking genomen voor de berekening van de complexe IV maximale ademhaling capaciteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Representatief sporen van een geldig (rode trace, kamer A) en ontoereikende (groene trace, kamer B) Reacties op de toevoeging van ADP. Het rode spoor komt overeen met de zaal A en het groene spoor komt overeen met de zaal B, tijdens hetzelfde experiment. Het rode spoor is verkregen uit thoraxes adequaat permeabel overwegende dat het groene spoor werd verkregen na overmatig scheuren van de weefsels tijdens de permeabilization. Wanneer ADP wordt toegevoegd, een toename van de consumptie van zuurstof wordt verwacht, als de rode overtrekken. OXPHOS koppeling ratio's zijn berekend als CI-OXPHOS/CI-lek en worden gepresenteerd in de grafiek. Een ratio van minder dan 6.0 in Drosophila suggereert een probleem in de mitochondriale koppeling en is karakteristiek voor de aantasting van het monster of van mitochondriale dysfunctie vertegenwoordigd door het groene spoor. Pyr: pyruvaat; mal: malaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Representatief sporen van een geldig (rode trace, kamer A) en ontoereikende (groene trace, kamer B) reactie op de toevoeging van cytochroom c. Het rode spoor komt overeen met de zaal A en het groene spoor komt overeen met de zaal B, tijdens hetzelfde experiment. Rode trace is verkregen uit thoraxes adequaat permeabel en behandeld, overwegende dat het groene spoor is verkregen na de thoraxes met opzet voor een langere tijd op het absorberend oppervlak voordat wegen werden gedroogd. Cytochroom c vergroot meestal niet mitochondriale zuurstofverbruik, zoals te zien op de rode trace, ter aanduiding dat de mitochondriale buitenmembraan intact is. Als, echter, toevoeging van exogene cytochroom c aanzienlijk verhoogt mitochondriale zuurstofverbruik van meer dan 15%, zoals te zien op het groene spoor, suggereert het dat de buitenste mitochondriale membraan is beschadigd en vandaar dat het monster is afgebroken en moet worden verwijderd. Pyr: pyruvaat; mal: malate; CYT c: cytochroom c. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Representatief sporen van mitochondriale zuurstofconcentratie (blauwe trace) en consumptie (rode trace) Na titratie van FCCP. Verschillende injecties van FCCP in verschillende concentraties moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om te bepalen van de consumptie van de maximale zuurstof geactiveerd door deze uncoupler. Onvoldoende concentratie niet toestaan de beoordelingvan maximale zuurstofverbruik en worden gekenmerkt door niet-stable ademhaling tarieven, overwegende dat overtollige FCCP mitochondriale zuurstofverbruik remt. Pijlen duiden de verschillende injecties van FCCP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Reproduceerbaarheid van mitochondriale zuurstofverbruik tarieven tijdens een typische experiment verkregen met behulp van de twee verschillende kamers (rode trace, kamer A; groene trace, kamer B) van een respirometer. Het rode spoor komt overeen met de zaal A en het groene spoor komt overeen met de zaal B, tijdens hetzelfde experimenteren met behulp van Drosophila van dezelfde leeftijd, geslacht, stam en getogen op hetzelfde dieet, evenals het protocol beschreven. Beide monsters werden genormaliseerd met de massa van droge weefsel gewogen zoals beschreven in het protocol (0.53 en 0,66 mg van chambers A en B, respectievelijk). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit onderzoek is een methode voor de bereiding van de monsters vóór de meting van de mitochondriale zuurstofverbruik in Drosophila beschreven. Deze methode werd ontwikkeld om te overwinnen van de verschillende problemen in verband met de protocollen die met behulp van mitochondriale isolatie, met name wat betreft de duur en aantal personen vereist. In plaats van het werken met mitochondriale isolatie meestal vereisen grote hoeveelheid weefsels verkregen uit meerdere personen, wordt dit experiment uitgevoerd op permeabel spiervezels van thoraxes van enkele Drosophila. In dit protocol zijn slechts drie personen nodig om optimale resultaten te geven. De mitochondriale zuurstofverbruik op verschillende tijdstippen te meten kan daarom, aangezien er meer haalbaar om te synchroniseren een kleinere groep van vliegen met dezelfde leeftijd en hetzelfde geslacht.
Eerste plaats is het belangrijk om te gebruiken van Drosophila van dezelfde leeftijd, geslacht, stam en getogen in dezelfde voorwaarden tot het verkrijgen van lage variabiliteit in de resultaten (Figuur 6), zoals ademhaling met de leeftijd, het geslacht, het genotype en het dieet van de vliegen veranderen kan. De meest kritische stap in de uitvoering van dit protocol is de procedure permeabilization van de thoraxes. Het is zeer belangrijk om verder te gaan snel om te voorkomen dat de afbraak van weefsels, en het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de thoraxes goed om te hebben de maximale tarieven voor zuurstofverbruik zijn permeabel. Om ervoor te zorgen dat de permeabilization correct is uitgevoerd en dat de structurele en functionele integriteit van het mitochondrium behouden blijven na de permeabilization, de OXPHOS koppeling verhouding (CI-OXPHOS/CI-lek, Figuur 3), alsmede de reactie op cytochroom c (Figuur 4) worden gebruikt als kwaliteitscontroles. Er is een afweging rekening moet worden gehouden tussen snel werken en ervoor te zorgen dat de permeabilization goed is uitgevoerd. Het is ook cruciaal om altijd te werken op het ijs bij het bewerken van de ontleed thoraxes. Voor het verkrijgen van de meest reproduceerbare resultaten (Figuur 6), homogene permeabilization noodzakelijk is en het beoefenen van de techniek voor de permeabilization helpt om ervoor te zorgen dat dezelfde bewegingen worden herhaald. Een andere belangrijke stap is de bepaling van het droge gewicht van het monster. Inderdaad, na de thoraxes worden geïncubeerd, ze zijn zeer gevoelig, kwetsbaar en gevoelig voor aantasting. Ook aan de permeabilization is snel verloopt voor de bepaling van het drooggewicht daarom belangrijk. Aan de andere kant, is het belangrijk om te bepalen van het gewicht met nauwkeurigheid als de resultaten worden genormaliseerd door de massa van het weefsel. De hoeveelheid thoraxes gebruikt, kan ook worden geoptimaliseerd. Het protocol kan worden aangepast voor het gebruik van een enkele thorax per kamer35, maar een zekere mate van resolutie kon worden verloren bij het meten van zuurstofverbruik zo veel als in de bepaling van het droog gewicht. De hoeveelheid thoraxes kan worden verhoogd, indien nodig, maar het is belangrijk op te merken dat de meer mitochondriën in de steekproef, hoe hoger het zuurstofverbruik en de kamers zullen moeten daarom worden reoxygenated. Deze heroxygenatie kan worden gedaan door het openen van de kamers en het injecteren van zuurstof, maar het zal verhogen de kans om in te voegen luchtbellen in de zaal. Daarom, indien mogelijk, proberen te vermijden moetend reoxygenate de kamers (behalve wanneer complexe IV maximale ademhaling capaciteit dient te worden bepaald). Voordat u de experimenten, is optimalisatie van de concentraties van het substraat ook noodzakelijk voor het bereiken van de hoogste mitochondriale zuurstofverbruik zonder inachtneming van remmende effecten als gevolg van een te sterke concentratie. De kamers van de respirometer moeten ook worden grondig gereinigd om te voorkomen dat potentiële verontreinigingen. Het is belangrijk om te beginnen met de reiniging met distillated water en vervolgens 70% ethanol om zich te ontdoen van potentiële biologische besmettingen. Na deze, een incubatie in absolute ethanol voor 10 min wordt aanbevolen om te voorkomen dat besmetting van hydrofobe remmers. Tot slot, de kamers met distillated water spoelen en vullen met 70% ethanol zal te voorkomen dat potentiële verontreinigingen tot het volgende gebruik.
Het protocol kan eenvoudig worden aangepast om te bestuderen van het effect van andere substraten of verschillende remmers. Bijvoorbeeld, is een interessant eiwit om te studeren de drager van de mitochondriale pyruvaat (MPC). De rol van dit eiwit is voor het vervoer van pyruvaat gegenereerd in het cytosol in de mitochondriale matrix. Onlangs, er is gesuggereerd om te spelen een belangrijke rol in de modulatie van het metabolisme tijdens pathologische condities zoals bij type 2 diabetes38. Om te bestuderen van het effect van het eiwit MPC op mitochondriale stofwisseling, is het nuttig om te beginnen met de injecties met pyruvaat alleen in plaats van pyruvaat en malate op hetzelfde moment. Dus, het effect van de pyruvaat is bestudeerd onafhankelijk van het effect van malate, zoals de laatste is geïnjecteerd om alleen ondersteunen de tricarboxylic acid cyclus en ervoor zorgen dat de tussenproducten zijn niet uitgeput. Het is ook mogelijk met remmers van MPC39 te beoordelen of een beperking van deze transporter in plaats van de oxidatie van pyruvaat wordt waargenomen. Dan, zou een mogelijke verschuiving in de voorkeur brandstofbron voor ademhaling40geobserveerd. Het is ook mogelijk aan het weglaten van sommige ondergronden ter vereenvoudiging van het protocol als het is niet relevant voor de studie. Bijvoorbeeld om te studeren een dysfunctie van het complex ik alleen, het is niet nodig om te gebruiken op alle substraten gepresenteerd in dit protocol.
Dit protocol biedt enkele beperkingen die van in vivo voorwaarden afleiden. De metingen van mitochondriale zuurstofverbruik worden vastgelegd wanneer het medium van de ademhaling boven lucht-verzadiging is, zoals zuivere zuurstof wordt geïnjecteerd om te voorkomen dat de beperking van de verspreiding van de zuurstof in de weefsels30. Bovendien worden de concentraties van substraten geïnjecteerd in overdaad, die niet aan het reflecteren zijn de voorwaarden in vivo . Het is ook belangrijk op te merken dat de leeftijd, het geslacht, de stam en de voeding van Drosophila kunnen invloed hebben op de resultaten. Deze parameters moeten daarom rekening worden gehouden bij de interpretatie van de resultaten. Deze methode is echter dichter bij fysiologische omstandigheden dan methoden met behulp van mitochondriale isolatie voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik, als de interacties met de andere cellulaire componenten en de structurele integriteit van mitochondriën en morfologie zijn geconserveerde31. Het is belangrijk op te merken dat mitochondriale isolatie voordeliger als extra parameters zijn zoals ROS productie of mitochondrial efficiëntie (P/O ratio) moet worden gemeten27.
Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende doelen, variërend van het begrijpen van mitochondriale stoornissen en de onderliggende mechanismen van metabole ziekten, voor het testen van de effecten van verschillende verbindingen op mitochondriale functies onder pathologische voorwaarden. Bovendien kan het worden gebruikt om te observeren van de effecten van verschillende milieu benadrukt op de mitochondriale metabolisme, zoals veranderingen in dieet of temperatuur. Het is bijvoorbeeld mogelijk om te bestuderen van de efficiëntie van bioactieve synthetische moleculen op de mitochondriale functies en in de behandeling van mitochondriale stoornissen. Deze methode is ook een goed hulpmiddel om te bestuderen van de mitochondriale functies op verschillende tijdstippen, waardoor het zeer relevant voor de studie van de fundamentele mechanismen die aan het verouderingsproces gerelateerde. De beoordeling van mitochondriale metabolisme via zuurstofverbruik met behulp van permeabel thoraxes zal zeker helpen om beter onze kennis over de rol van mitochondriale metabolisme wanneer de cel is blootgesteld aan uitdagende omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door subsidies van de National Sciences, de Engineering Research Council (NSERC, ontdekking subsidie) en de Université de Moncton aan NP. LHB wil de financiële steun van het Canadees Instituut voor gezondheid onderzoek (CIHR), de Stichting van de innovatie van New Brunswick (NBIF) en de Université de Moncton erkennen. Het werk van EHC wordt ondersteund door de Alzheimer Society of Canada, hersenen Canada, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick innovatie Foundation, New Brunswick Health Research Foundation en de Université de Moncton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
References
- Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
- Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).
- Dobzhansky, T., Wright, S. Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura. Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).
- Zipursky, S. L., Rubin, G. M. Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).
- Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease. The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).
- Blandini, F., Armentero, M. T. Animal models of Parkinson's disease. FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).
- Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila. Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).
- Morris, S. N. S., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).
- Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T.
- Szibor, M., Holtz, J.
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. Mitochondrial biogenesis and healthy aging. Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).
- Muoio, D. M. Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock. Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).
- Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M.
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).
- McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. "Alternative" fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).
- Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production. PLOS ONE. 10 (3), e0120600 (2015).
- Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor. Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).
- Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333 (2016).
- Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster. The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).
- Miwa, S., Brand, M. D. The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).
- Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).
- Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria. Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).
- Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males. Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).
- Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies. Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways. Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).
- Bender, T., Martinou, J. C. The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- McCommis, K., et al. An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion. Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).
