Summary
In diesem Papier wird eine Methode zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch mit hochauflösender respirometrie in permeabilized Thoraxes von Drosophila beschrieben. Diese Technik erfordert eine minimale Menge an Gewebe im Vergleich zur klassischen mitochondriale Isolierung-Technik und die erzielten Ergebnisse mehr physiologisch relevant sind.
Abstract
Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, stellt eine aufstrebende Modell für die Untersuchung des Stoffwechsels. In der Tat, Drosophila haben Strukturen, die Homolog zu menschlichen Organen, hoch konservierte Stoffwechselwege besitzen und haben eine relativ kurze Lebensdauer, die das Studium der verschiedenen grundlegenden Mechanismen in kurzer Zeit ermöglicht. Es ist jedoch verwunderlich, dass einer der Mechanismen wichtig für Zellstoffwechsel, die mitochondriale Atmung in diesem Modell nicht gründlich untersucht worden ist. Es ist wahrscheinlich, weil das Maß für die mitochondriale Atmung in Drosophila in der Regel eine sehr große Anzahl von Individuen erfordert und die erzielten Ergebnisse nicht sehr reproduzierbar sind. Hier ist eine Methode, die genaue Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch mit minimalen Mengen von Gewebe von Drosophila beschrieben. Bei dieser Methode des Thoraxes seziert und permeabilized sowohl mechanisch mit scharfen Zangen und chemisch mit Saponin, so dass verschiedene Verbindungen zu überqueren die Zellmembran und modulieren die mitochondriale Atmung. Nach Permeabilisierung wird ein Protokoll durchgeführt, um die Kapazität der verschiedenen komplexe der Elektronentransport-System (ETS), verschiedene Substrate zu oxidieren zu bewerten sowie ihre Reaktion auf einen Entkuppler und mehrere Inhibitoren. Diese Methode bietet viele Vorteile im Vergleich zu Methoden mit mitochondrialen Isolationen, wie es mehr physiologisch relevant, ist da die Mitochondrien noch mit den anderen zellulären Komponenten interagieren sind und die mitochondriale Morphologie konserviert. Darüber hinaus Probe Vorbereitungen sind schneller, und die erzielten Ergebnisse sind sehr reproduzierbar. Durch die Kombination der Vorteile von Drosophila als ein Modell für die Untersuchung des Stoffwechsels bei der Auswertung der mitochondrialen Atmung, wichtige neue Erkenntnisse können werden vorgestellt, vor allem wenn die fliegen erleben verschiedene Umwelt- oder pathophysiologischen Bedingungen.
Introduction
Der Taufliege Drosophila Melanogaster, dient als Modellorganismus für genetische Forschung für über ein Jahrhundert1. Die Studie dieses Organismus führte nicht nur zu erheblichen Grundlagenwissen über geschlechtsgebundene Vererbung2, Mutation Satz3, die Entwicklung des Nervensystems und die Zelle Schicksal Bestimmung4, sondern hat auch vor kurzem entstanden, als ein wertvolles Instrument, um die Mechanismen, die verschiedene Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson5,6zu studieren. Darüber hinaus ist es ein beliebtes Modell, den Alterungsprozess zu studieren, da sie in großer Zahl über einen kurzen Zeitraum hinweg angehoben werden können und eine kurze Lebensdauer haben. Sie besitzen auch homologe Strukturen menschlicher Organe, wie Herz, Oenocytes (Hepatozyten-ähnliche Zellen), Fett Körper (funktionieren ähnlich wie die Leber und weißen Fettgewebe), Insulin produzierenden Zellen (β-Pankreaszellen entspricht), sowie die Hämolymphe Transport von Metaboliten (analog zu dem Blut der Wirbeltiere)7. Darüber hinaus sind die zentralen Bahnen des intermediären Stoffwechsels (einschließlich Insulin/Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-ähnliche Signalweg und Target of Rapamycin-TOR Wege) auch hoch konservierte7. Aus diesen Gründen Drosophila haben vor kurzem wurde ausgenutzt, um die grundlegenden Mechanismen zu beschreiben, die Stoffwechsel, vor allem in pathologischen Zuständen inhärenten menschlichen Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes8steuern. Ein wichtiger Bestandteil des Stoffwechsels ist das Mitochondrium, das mehrere Wege integriert und führt eine der wichtigsten biologischen Lebensfunktionen, ATP-Produktion über die Oxidative Phosphorylierung-Verfahren (OXPHOS). Angesichts ihrer zentralen Rolle im Stoffwechsel des Organismus ist es nicht verwunderlich, dass die mitochondriale Funktionsstörungen bei vielen Erkrankungen wie Parkinson9 und Alzheimer Erkrankungen10sowie Amyotrophe Lateralsklerose beteiligt sind 11 , 12. sie sind auch wesentliche Determinanten des Alterungsprozesses. In der Tat sind die Hauptproduzenten von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, die auf die Zelle in hoher Konzentration durch oxidativen Schäden11nachteilig sein kann. Alterung wurde auch die Anhäufung von beschädigten oder mutierte mitochondriale DNA-13, Mitophagy Dysfunktionen14,15 , sowie Beeinträchtigung der mitochondrialen Biogenese16gebracht. Mitochondrien sind ebenfalls wichtige Determinanten der Homöostase der Zelle, wie sie verschiedene Substrate anpassen verschiedene Zellfunktionen entsprechend der Fülle oder Mangel an Makronährstoffen17,18nutzen können.
In der Tat sind die verschiedenen Nährstoffe in der Nahrung (Kohlenhydrate, Lipide und Proteine) verdaut, absorbiert und in die Zellen transportiert. Sie werden dann umgewandelt in das Zytosol, und die abgeleitete Substrate werden in der mitochondrialen Matrix, wo sie reduzierende Mittel, wie NADH und FADH219 produzieren,transportiert. Diese Verringerung äquivalente werden dann von verschiedenen enzymatischen komplexen Elektronentransport-System (ETS) oxidiert. Diese komplexe sind eingebettet in die mitochondriale innere Membran, wie Komplex I und Komplex II. Darüber hinaus vertreten anderen enzymatischen komplexe wie die mitochondriale Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase und Prolin Dehydrogenase alternative Routen für die Eingabe von Elektronen in die ETS-20,-21. Diese "alternative" komplexe sind besonders wichtig bei Insekten, können als je nach Tierart, sie aktiv um die Atmung20,22,23,21zu erhöhen. Elektronen aus diesen ETS Zuführsysteme werden das Ubiquinon und anschließend zum Komplex III und dann Komplex IV, bis die endgültigen Akzeptor, molekularen Sauerstoff übertragen. Diese Elektronentransfer erzeugt eine Kraft, Proton-Motiv auf der inneren mitochondrialen Membran fahren die Phosphorylierung von ADP zu ATP bei komplexen V (Abbildung 1). Unter Berücksichtigung der zentralen Rolle der Mitochondrien in der Zelle Homöostase, mitochondrialen Stoffwechsel mit der relevanten Modell D. Melanogaster stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, die zugrunde liegenden Mechanismen der verschiedenen abzugrenzen pathophysiologischen Bedingungen oder unter Mobilfunk und Umwelt betont. Überraschend jedoch nur eine Handvoll Studien gemessen tatsächlich mitochondriale Atmung in Drosophila24,25,26. Tatsächlich erfordern Experimente mit dem Ziel, mitochondriale Sauerstoffverbrauch bewerten die Isolation von Mitochondrien. Obwohl für die Messung der verschiedenen mitochondriale Funktionen (z. B. ROS-Produktion oder P/O Verhältnis als Marker der mitochondrialen Effizienz27,28) vorteilhaft, erfordern diese Isolationen in der Regel ziemlich große Mengen Gewebe aus mehreren Individuen24,29. Diese Anforderung für hohe Mengen von Gewebe und Einzelpersonen ist ein wichtiger begrenzende Faktor, besonders wenn man bedenkt, dass alle Personen, die im gleichen Alter sein sollte und vorzugsweise des gleichen Geschlechts für die Experimente machen das Maß der Atmung zu anderen Zeitpunkt am besten verweist mühsam. Darüber hinaus während mitochondriale Isolationen bedeutenden Einblick in die grundlegenden Mechanismen mitochondrialen Stoffwechsel zur Verfügung stellen können, haben die Methoden verwendet, um die Mitochondrien isolieren einige Nachteile wie die Schwierigkeit, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen , Störungen der mitochondrialen Netz- und Veränderung der mitochondrialen Struktur und Funktion29,30,31.
Das Ziel dieser Studie ist es, ein robustes Protokoll zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Drosophila mit nur eine minimale Menge an Gewebe aus sehr wenige Individuen zu präsentieren. Dieses Protokoll besteht aus mitochondriale Sauerstoff Verbrauch Messen in Situ mit permeabilized Muskelfasern29 von Drosophila Thoraxes in Kombination mit hochauflösender respirometrie32,33, 34 , 35. diese Methode hat auch weitere Vorteile im Vergleich zu den klassischen mitochondriale Isolationsmethode da die Interaktionen mit den anderen Komponenten der Zelle als auch mitochondrialen Struktur und Funktion in mehr konserviert werden permeabilized Fasern29,31,36, wodurch dieser Ansatz mehr physiologisch relevanten. Mit diesem Protokoll können mitochondriale Funktionen genau mit hochauflösender respirometrie in nur drei Thoraxes von Drosophila, mit Substraten ermöglicht die Bestimmung der Sauerstoffverbrauch bei mehreren verschiedenen Schritten des ETS ausgewertet werden. Dieses Protokoll könnte daher wichtige Fragen über die grundlegenden Mechanismen helfen, die Stoffwechsel im Zusammenhang mit vielen Umwelt- oder pathophysiologischen Bedingungen zu steuern, unter Ausnutzung des Drosophila-Modells.
Den Sauerstoffverbrauch bei mehreren verschiedenen Schritten des ETS Messen und auswerten wie verschiedene Substrate tragen zur Atmung, verschiedene Substrate (Abbildung 1), Entkuppler und Inhibitoren sind gebrauchte30 nach Permeabilisierung der der Gewebe. Insbesondere werden fortlaufende Ergänzungen von verschiedenen Substraten durchgeführt, um Regen die Einreise von Elektronen durch verschiedene komplexe des ETS. Ein Entkuppler Carbonyl Zyanid-4-(Trifluoromethoxy) Phenylhydrazone (FCCP), wird dann hinzugefügt, bei optimaler Konzentration, die Atmung nicht gekoppelt zu messen, d.h., die Atmung nicht Phosphorylierung stimuliert, um maximale Sauerstoff-Verbrauch. Sequentielle Hemmungen von komplexen I, II und III dann durchgeführt werden, um den Restsauerstoff-Verbrauch zu überwachen, der durch nicht-ETS-Oxidationsreaktionen ist. Zu guter Letzt Komplex IV maximal Atmung Kapazität ausgewertet werden kann, durch die Injektion von N, N, N', N, - Tetramethyl - p-Phenylendiamin (TMPD), eine künstliche Elektron Anbieter und Ascorbat. Es ist wichtig zu beachten, dass die Experimente bei 24 °C durchgeführt werden, da es die Temperatur an der die fliegen ausgelöst werden.
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Protocol
(1) Reagenzien Vorbereitung
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen für Dissektion und Permeabilisierung des Gewebes.
- Bereiten Sie Erhaltung Lösung: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, Taurin, 20 mM 15 mM Na2Phosphokreatin, 20 mM Imidazol, 0,5 mM Dithiothreitol, und 50 mM K-MES, pH 7,1 (kann gespeichert werden bei-20 ° C).
- Bereiten Sie Saponin Lösung: 5 mg Saponin in 1 mL der Bewahrung Lösung (bereiten Sie täglich frisch).
- Bereiten Sie folgenden Lösungen für die Messung der Atmung.
- Bereiten Sie Atmung Medium: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2und 0,2 % BSA (w/V), pH 7,2.
- Entkuppler, Substrate, Inhibitoren vorzubereiten. Lösen Sie alle Substrate in H2O und lösen Sie der Entkuppler FCCP sowie die Inhibitoren in Ethanol absolut (mit Ausnahme von malonat die H2O verdünnt ist auf). Die meisten der Substrate sowie malonat (siehe Tabelle der Materialien) zu neutralisieren. Alle Konzentrationen im Protokoll gegeben sind Endkonzentrationen in 2 mL Kammern.
2. Vorbereitung und Kalibrierung von hochauflösenden Respirometer.
- Die Kammern, Kappen und Stopfen der Respirometer dreimal mit 70 % Ethanol und dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen.
- Kalibrieren auf NULL Sauerstoffkonzentration: pipettieren 2,3 mL Atmung Medium in den Kammern und 10 mg Natrium Dithionite hinzufügen. Zwar das maximale Volumen der Kammer 2 mL, 2,3 mL hinzugefügt, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter der Stopper bleibt, wenn die Kammern zu schließen. Schließen Sie die Kammern mit den Stöpseln und Messen Sie der Sauerstoffkonzentration für 10-20 min. kalibrieren die Elektroden bei Null Sauerstoffkonzentration mit der daraus resultierenden Sauerstoff-Verbrauch zu.
- Die Kammern mit distillated Wasser zu waschen, in absoluten Ethanol für 10 min inkubieren, und dann mit destilliertem Wasser abspülen.
- Bei Sättigung der Luft kalibrieren: pipettieren 2,3 mL Atmung Medium in den Kammern, legen Sie die Stopper, Aspirieren Sie das überschüssige Medium auf die Stopper und heben Sie dann die Stopper mit Abstandhalter. Überschüssige Atmung Medium ist in den Kammern (Volumen von 2 mL gesamt) pipettiert, um das Vorhandensein von Luftblasen zu vermeiden, nach dem Schließen der Kammern.
- Überwachen den Sauerstoffverbrauch für 45 Minuten bis eine Stunde, bis der Sauerstoff-Konzentration (blaue Spur) stabil rund 250 ist nM bei 24 ° C.
(3) sezieren von fliegen und Permeabilisierung der Gewebe
- Stellen Sie sicher, dass alle Schritte ausgeführt werden, auf dem Eis.
- Betäuben sechs männlichen fliegen von dem gleichen Stamm, dasselbe Alter und auf die gleiche Diät auf Eis, Dissektion der fliegen zu erleichtern (Wildtyp w1118, 15 Tage alt, mit Maismehl Medium gefüttert) erhoben.
- Mit einem Skalpell und feine Spitzen Pinzette, sezieren Sie die fliegen (entfernen Sie die Köpfe und Bäuche) um nur des Thoraxes, enthält die Flugmuskeln zu halten. Dieser Schritt kann mit dem bloßen Auge erfolgen. Die daraus resultierende Thoraxes mit feinen Spitzen Pinzette zu behandeln.
- Drei seziert Thoraxes in einem 25 mm Petrischale mit 2 mL eiskaltes Bewahrung Lösung mit der Pinzette zu übertragen.
- Mit der feinen Spitze Pinzette mechanisch permeabilize des Thoraxes durch Einfügen von der Spitze der Zange in die Thoraxes und wiederholt zerreißen des Gewebes um ein locker verbundenes Netzwerk zu erhalten.
- Füllen Sie in einer 24-Well-Platte zwei Brunnen mit 12,5 µL der Saponin-Lösung und 1 mL der Bewahrung Lösung um eine Endkonzentration von 62,5 µg/mL von Saponin zu erhalten. Füllen Sie die zwei benachbarten Brunnen mit 1 mL der Atmung Medium.
- Mit der feinen Spitze Pinzette drei permeabilized Thoraxes in die verdünnte Saponin-Lösung und mit milden Agitation auf einem Orbitalschüttler auf Eis, für 20 min inkubieren.
- Übertragen Sie nach der zweiten Inkubation die Fasern in die benachbarten Vertiefungen gefüllt mit der Atmung Medium mit milden Agitation, auf Eis, für 5 min die Saponin abzuspülen.
4. Bestimmung der Trockenmasse
- Trocknen Sie der permeabilized Thoraxes auf einer saugfähigen Unterlage und drehen Sie 3-4 mal mit der feinen Spitze Pinzette um sicherzustellen, dass alle Feuchtigkeit entfernt wird.
- Wiegen Sie die drei Thoraxes auf einer Mikrowaage zusammen. Beachten Sie die erhaltenen Gewicht, wie es verwendet wird, um die mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch zu normalisieren.
- Übertragen Sie das Gewebe sofort in einem Tropfen Atmung Medium auf Eis.
(5) Sauerstoff Verbrauch Rate Bestimmung
- Öffnen Sie die Kammern der Respirometer (entfernen Sie die stopfen) und fügen Sie 10 mM von Pyruvat und 2 mM von Malate in jeder Kammer.
- Fügen Sie die permeabilized Gewebe direkt in die Kammern, die mit der Atmung Medium gefüllt.
- Ersetzen Sie die Stopper mit Abstandhalter.
- Mit einer Spritze 60 mL sammeln Sie Sauerstoff direkt aus einer Sauerstoffflasche zu und Spritzen Sie 2-5 mL Sauerstoff durch die Stopper Kapillare jeder Kammer um sicherzustellen, dass Sauerstoffdiffusion durch das Gewebe nicht Sauerstoffverbrauch beschränkt wird.
- Einsetzen Sie eine Hamilton-Spritze in der Kapillare von jedem Anschlag um sicherzustellen, dass die Thoraxes in der Kammer verbleiben.
- Die Kammern vollständig zu schließen, wenn die Sauerstoffkonzentration rund 400 beträgt nM, Sauerstoffgehalt über Luft Sättigung zu erreichen (etwa 160 % Luft Sättigung) in den Kammern.
- Beenden Sie und starten Sie den Rührer für Luftblasen in den Kammern zu überprüfen.
- Geben Sie die Masse von Gewebe vorher gewogen, um die Atmung durch die Masse von Gewebe (mg), Anzeige Massenspezifische Sauerstoffverbrauch (Pmol O2 consumed.s-1.mg-1 des Gewebes) normalisieren.
- Sobald der Sauerstoffverbrauch (rote Spur) stabilisiert wird, fügen Sie 5 mM ADP mit einer Hamilton-Spritze.
- Spülen Sie nach jeder Injektion Spritzen mit destilliertem Wasser, 70 % Ethanol, und destilliertem Wasser wieder.
- Sobald der Sauerstoffverbrauch wieder stabil ist, injizieren Sie 5 µL einer 4 mm von Cytochrom c.
- Gehen Sie zu den sequentiellen Injektionen der folgenden Substrate, die mitochondriale Sauerstoffverbrauch auf verschiedenen Stufen des ETS zu bewerten:
- 5 µL von einer 2 M Proline hinzufügen.
- Fügen Sie 10 µL einer 1 M-Succinat.
- Fügen Sie 30 µL einer 1 M Glycerin-3-Phosphat.
- Injizieren der Entkuppler FCCP in gewissem Sinne Titration in Schritten von 0,5-1 µm (2 µL einer 1 mM Lösung) bis die optimale Konzentration erreicht, d. h., die Konzentration, den höchsten Sauerstoffverbrauch möglich ohne Hemmung zu erreichen (Vorsicht: siehe Tabelle Materialien).
- Injizieren der folgende Hemmnisse gegenüber dem Vorquartal um vollständig hemmen das Elektron Flussmittel in der ETS um den Restsauerstoff Verbrauch (ROX) messen also nicht-respiratorischen Reaktionen wie Cyclooxygenase Reaktionen unter anderem:
- 1 µL einer 1 mM Rotenon hinzufügen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).
- 5 µL von einer 2 M malonat hinzufügen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).
- Fügen Sie 1 µL einer 5 mM Antimycin A (Achtung: siehe Tabelle der Materialien).
- Fügen Sie 0,2 mM Ascorbat und 0,5 mM TMPD nacheinander in die Kammern beginnend mit Ascorbat, den Sauerstoffverbrauch von Komplex IV zu messen.
- Fügen Sie 20 mM von Natriumazid Komplex IV hemmen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).
- Sobald das Signal stabil ist, die Kammern mit Abstandhalter, wieder mit Sauerstoff die Kammern durch die Injektion von 2 mL reinem Sauerstoff bei öffnen und Schließen der Kammern ist die Konzentration um 250-300 nmol.mL-1.
- Das Signal für 10-15 min zu messen und chemischen Hintergrund, d. h. den Sauerstoffverbrauch durch Autoxidation TMPD zu berechnen.
6. Reinigung der Respirometer
- Nach den Messungen einmal spülen Sie die Kammern mit destilliertem Wasser und spülen Sie die Kammern dreimal in 70 % igem Ethanol.
- Brüten Sie in absoluten Ethanol für 10 min, die Inhibitoren zu inaktivieren.
- Spülen Sie drei Mal mit destilliertem Wasser, füllen Sie die Kammern mit 70 % Ethanol und ersetzen Sie die stopfen und die Kappen bis zum nächsten Einsatz.
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Representative Results
In Abbildung 2ist eine repräsentative Spur von mitochondrialen Sauerstoffverbrauch unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls kostenfrei. Pyruvat und Malat in den Kammern zusammen mit den permeabilized Muskelfasern injiziert werden bezeichnet, die CI-LECK-Atmung, d.h.wenn der Komplex I von der ETS durch stimuliert wird die NADH produziert durch Oxidation von Pyruvat und Malat über die Tricarboxylic Säure Zyklus (CI). Während diese Atemfrequenz ist die mitochondriale Sauerstoff überwiegend bestritten, zum Ausgleich des Proton Lecks, d.h.Protonen aus dem intermembran Raum in der mitochondrialen Matrix überqueren, wenn ATP-Synthase nicht aktiv (LECK)30 ist. Wenn die ADP wird hinzugefügt, die ATP-Synthase aktiviert ist und die Elektronen übertragen vom Komplex stieg ich zum Komplex IV mit gleichzeitigen Phosphorylierung von ADP zu ATP (CI-OXPHOS), was zu mitochondrialen Sauerstoffverbrauch. Die OXPHOS-Kupplung-Verhältnis wird als CI-OXPHOS/CI-LECK berechnet und ist in der Regel ein guter Indikator der mitochondrialen Qualität und mitochondriale Kupplung30übernommen. In Drosophila sollte dieses Verhältnis mindestens 6.0 (Abbildung 3) überschreiten. Wenn sie unterhalb dieses Wertes ist, könnte es ein Problem mit der Vorbereitung des Gewebes oder einer mitochondrialen Dysfunktion hinweisen. Die Zugabe von Cytochrom c ermöglicht die Bestimmung der Integrität der mitochondrialen Außenmembran und dient daher als eine Qualitätskontrolle der Zubereitung (Abbildung 4). In der Tat Cytochrom c ist lose an der inneren mitochondrialen Membran gebunden und ist in der Regel weggespült, wenn während des Prozesses Permeabilisierung die äußere mitochondriale Membran beschädigt ist. Infolgedessen wird Hinzufügen von exogenen Cytochrom c Sauerstoffverbrauch erheblich wenn die äußere mitochondriale Membran beschädigt ist und die endogene Cytochrom c verloren geht. Zunahme von weniger als 10-15 % in Sauerstoffverbrauch (Abbildung 4) zeigt in der Regel entsprechende Integrität der mitochondrialen Außenmembran29. In Abbildung 3 und 4, die grüne Spuren stammen aus nicht ausreichend Permeabilisierung und Handhabung der Proben (übermäßige reißen des Gewebes für Abbildung 3und wog nach einer längeren Zeit an der absorbierenden Oberfläche für Abbildung 4), während die rote Spuren Proben ausreichend permeabilized und behandelt darstellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass entsprechende Permeabilisierung Bedingungen für zuverlässige Beurteilung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch entscheidend sind.
Die folgenden Substraten verwendet während der Experimente geben Elektronen an das Ubiquinon und durfte um das Elektron Flussmittel in der ETS zu erhöhen. Prolin ist eine Aminosäure, die als Energie-Substrat, insbesondere Insekten23, sondern auch bei Säugetieren während akuter Hunger oder pathologischen Bedingungen37verwendet werden können. Die Zugabe von Prolin in den Kammern ermöglicht, um den Beitrag der Prolin Dehydrogenase (ProDH) zu bewerten, das Elektron Flussmittel in der ETS, wenn Elektronen fließen aus beiden komplexen I und ProDH und uns an den OXPHOS-Prozess (CI + ProDH-OXPHOS beteiligen). Mit Zusatz von Succinat kann der Beitrag von Komplex II (Succinat-Dehydrogenase) auf die ETS (CI + ProDH + CII-OXPHOS) beobachtet werden. Injektion von Glycerin-3-Phosphat (G3P), weiter mit zunehmender mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch dieses Substrat stimuliert die mitochondriale Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase (G3PDH) ist Teil des glycerophosphat-Shuttle und transfer Elektronen, die ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS). Sowohl ProDH und G3PDH haben gezeigt, dass verschiedene Arten von Insekten besonders aktiv werden und sind daher wichtig in diesem Protokoll mit Drosophila20,21,22,23,32 .
Wenn die Entkuppler, die FCCP hinzugefügt wird, die Atmung nicht gekoppelt (ETS Zustand) erreicht wird, d.h., der maximale Sauerstoffverbrauch, die maximale Kapazität des ETS (CI + ProDH + CII + G3P-ETS) darstellt. Die FCCP ist ein Protonophore, das die Protonen aus dem intermembran Raum in der mitochondrialen Matrix transportiert, ohne den Umweg über komplexe V. Die FCCP muss sorgfältig titriert werden, als Konzentrationen unter optimalen Ergebnis in nicht-maximale Sauerstoff-Verbrauch und instabil Atmung Preise bei Konzentrationen über optimales Ergebnis bei der Hemmung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch (Abbildung 5). Sobald der Substrate und die Entkuppler hinzukommen, Hemmung von komplexen I, II und III sequenziell sein kann mit Rotenon und malonat Antimycin A, bzw. durchgeführt. Mit jeder Inhibitor verwendet ist eine Abnahme der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch bis zum Erreichen des niedrigsten Sauerstoffverbrauchs nach der Zugabe von Antimycin A. beobachtet, Die Rate erreicht, nachdem die Inhibitoren der Restsauerstoff Verbrauch30ist. Es repräsentiert den Sauerstoffverbrauch durch nicht-Mitochondrien oxidative Reaktionen wie Cyclooxygenase Reaktionen und reaktive Spezies Produktion zum Beispiel, und wurde daher von den Preisen abgezogen werden gemessen.
TMPD ist eine künstliche Elektron-Transporter, die Elektronen direkt an komplexen IV unter Umgehung aller komplexe flussaufwärts bietet, Messung der komplexen IV maximal Atmung Kapazität ermöglicht. Dieses Substrat ist jedoch anfällig für Autoxidation, so Ascorbat sein vor TMPD hinzugefügt zu begrenzen, aber nicht vollständig zu vermeiden diese Autoxidation. Um die verbleibenden Autoxidation der TMPD zu korrigieren, die komplexe IV-Hemmer Natriumazid wird hinzugefügt, um die Kammern und der Sauerstoffverbrauch wird dann für 10-15 Minuten aufgezeichnet. Diese Sauerstoff-Verbrauch stellt daher den chemischen Hintergrund, oder mit anderen Worten die Autoxidation von TMPD, die für die Berechnung der komplexen IV maximal Atmung Kapazität berücksichtigt werden sollten.
Abbildung 1 . Schematische Darstellung der mitochondrialen Elektronentransport vom elektronentransportsystem und Oxidative Phosphorylierung in der inneren mitochondrialen Membran. I: komplexe ich; II: komplexe II; III: Komplex III; IV: Komplex IV; V: ATP-Synthase; Acetyl-CoA: Acetyl Coenzym A; Cyt c: Cytochrom c; e–: Elektron; G3P: Glycerin-3-Phosphat; G3PDH: Mitochondriale Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase; H+: Proton; PRODH: Prolin Dehydrogenase; TCA: Tricarboxylic Säure Zyklus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Repräsentative Spuren von mitochondrialen Sauerstoffkonzentration (blaue Spur) und Verbrauch (rote Spur) auf permeabilized Thoraxes von Drosophila. Jeder Injektion ist vertreten mit einem Pfeil, der die Substanz injiziert (Pyr: Pyruvat; Mal: Malat; ADP; Cyt c: Cytochrom c; Pro: Prolin; Succ: Succinat; G3P: Glycerin-3-Phosphat; FCCP: Carbonyl Zyanid 4-(Trifluoromethoxy) Phenylhydrazone; Rot: Rotenon; Malo: malonat; Ameise A: Antimycin A; TMPD: N, N, N', N, - Tetramethyl - p-Phenylendiamin; ASC: Ascorbat; SAZ: Natriumazid). Jedes mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch ist im Diagramm, bezeichnet, wenn der Sauerstoffverbrauch (rote Spur) stabilisiert hat. Cytochrom C-Effekt bezeichnet die Integrität der mitochondrialen Außenmembran (siehe Text für Details). Restsauerstoff Verbrauch stellt den Sauerstoffverbrauch durch oxidative Seite Reaktionen in den Zellen und muss auf alle anderen Preise gemessen abgezogen werden. Chemischer Hintergrund bezeichnet den Sauerstoffverbrauch nur durch Autoxidation von TMPD und für die Berechnung der komplexen IV maximal Atmung Kapazität berücksichtigt werden muss. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Repräsentative Spuren einer gültigen (rote Spur, Kammer A) und unzureichende (grüne Spur, Kammer B) Antworten auf die Zugabe von ADP. Die rote Spur entspricht der Kammer A und die grüne Spur an die Kammer B, während das gleiche Experiment. Die rote Spur wurde von Thoraxes angemessen permeabilized, während die grüne Spur gewonnen wurde, nach einem übermäßig abreißen des Gewebes während der Permeabilisierung erhalten. Wenn ADP hinzugefügt wird, eine Erhöhung der Sauerstoffverbrauch wird erwartet, wie die rote Spur. OXPHOS Kupplung Verhältnisse werden als CI-OXPHOS/CI-LECK berechnet und sind in der Grafik dargestellt. Ein Verhältnis von weniger als 6,0 in Drosophila schlägt ein Problem in der mitochondrialen Kupplung und zeichnet der Probe Abbau oder der mitochondrialen Dysfunktion durch die grüne Spur vertreten. Pyr: Pyruvat; Mal: Malate. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Repräsentative Spuren einer gültigen (rote Spur, Kammer A) und unzureichende (grüne Spur, Kammer B) als Reaktion auf die Zugabe von Cytochrom c. Die rote Spur entspricht der Kammer A und die grüne Spur an die Kammer B, während das gleiche Experiment. Rote Spur wurde von Thoraxes angemessen permeabilized und behandelt, erhalten, während die grüne Spur gewonnen wurde, nachdem die Thoraxes absichtlich für eine längere Zeit auf der absorbierenden Oberfläche vor dem wiegen getrocknet wurden. Cytochrom c erhöht in der Regel mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch sich nicht wie gesehen auf der roten Spur, bezeichnet, dass die äußere mitochondriale Membran intakt ist. Wenn Zugabe von exogenen Cytochrom c deutlich mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch von mehr als 15 %, jedoch erhöht wie auf der grünen Spur gesehen, schlägt er vor, dass die äußere mitochondriale Membran beschädigt ist und daher, dass die Probe abgebaut wird und sollte sein verworfen. Pyr: Pyruvat; Mal: Malat; Cyt c: Cytochrom c Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Repräsentative Spuren von mitochondrialen Sauerstoffkonzentration (blaue Spur) und Verbrauch (rote Spur) nach Titration von FCCP. Verschiedenen Injektionen von FCCP bei verschiedenen Konzentrationen müssen sorgfältig durchgeführt werden, um die maximale Sauerstoff-Verbrauch ausgelöst durch diese Entkuppler bestimmen. Unzureichende Konzentrationen erlauben nicht die Beurteilung der maximalen Sauerstoffverbrauch und zeichnen sich durch instabil Atmung Preise, während überschüssiges FCCP mitochondriale Sauerstoffverbrauch hemmt. Pfeile kennzeichnen die verschiedenen Injektionen von FCCP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Reproduzierbarkeit der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch Preise während ein typisches Experiment unter Verwendung der zwei verschiedenen Industrie-und Handelskammern (rote Spur, Kammer A, grüne Spur, Kammer B) ein Respirometer. Die rote Spur entspricht der Kammer A und die grüne Spur an die Kammer B, während die gleichen Experimentieren mit Drosophila von Gleichaltrigen, sex, Stamm und aufgewachsen auf der gleichen Diät sowie das Protokoll beschrieben. Beide Proben wurden mit der Masse der trockenen Tuch gewogen, wie im Protokoll beschrieben normalisiert (0,53 und 0,66 mg für Kammern A und B, beziehungsweise). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In dieser Studie wird ein Verfahren zur Probenaufbereitung vor den Messungen der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Drosophila beschrieben. Diese Methode wurde entwickelt, um verschiedene Probleme im Zusammenhang mit der Protokolle, die mit mitochondrialen Isolationen, insbesondere im Hinblick auf Dauer und Anzahl der Personen erforderlich. Anstatt zu arbeiten mit mitochondrialen Isolationen, erfordern in der Regel große Menge an Gewebe aus mehreren Personen gewonnen, erfolgt dieses Experiment permeabilized Muskelfasern von Thoraxes paar Drosophila. In diesem Protokoll sind nur drei Personen erforderlich, um optimale Ergebnisse anzuzeigen. Daher ist die Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu verschiedenen Zeitpunkten möglich, da es mehr erreichbar, eine kleinere Gruppe von Fliegen mit der gleichen Alters und gleichen Geschlechts zu synchronisieren ist.
Erstens ist es wichtig, Drosophila gleichen Alter, Geschlecht, Stamm zu verwenden und aufgewachsen in den gleichen Bedingungen, geringe Variabilität in den Ergebnissen (Abbildung 6), zu erhalten, wie Atmung mit dem Alter, das Geschlecht, das Erbgut und die Ernährung der fliegen kann. Der wichtigste Schritt bei der Durchführung dieses Protokolls ist die Permeabilisierung Verfahren des Thoraxes. Es ist sehr wichtig zu schnell gehen, um den Abbau des Gewebes zu vermeiden, und es ist auch wichtig, sicherzustellen, dass die Thoraxes gut permeabilized sind um die maximale Sauerstoff-Verbrauch aufweisen. Um sicherzustellen, dass die Permeabilisierung korrekt ausgeführt wurde und die strukturelle und funktionelle Integrität der Mitochondrien sind erhalten nach Permeabilisierung der OXPHOS Kupplung Verhältnis (CI-OXPHOS/CI-LECK, Abbildung 3), sowie die als Reaktion auf Cytochrom c (Abbildung 4) dienen als Qualitätskontrollen. Es ist ein Kompromiss zu berücksichtigen zwischen schnell arbeiten und sicherstellen, dass die Permeabilisierung gut ausgeführt wird. Es ist auch wichtig, immer auf Eis zu arbeiten, wenn seziert Thoraxes manipulieren. Für die meisten reproduzierbare Ergebnisse (Abbildung 6) homogene Permeabilisierung ist notwendig und die Technik zu üben, denn die Permeabilisierung hilft sicherzustellen, dass die gleichen Bewegungen wiederholt werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Bestimmung der Trockenmasse der Probe. In der Tat, nachdem die Thoraxes ausgebrütet werden, sind sie sehr empfindlich, zerbrechlich und anfällig für Abbau. Daher gilt ebenso für die Permeabilisierung schnell Verfahren zur Bestimmung der Trockenmasse. Auf der anderen Seite ist es wichtig, das Gewicht mit Genauigkeit zu bestimmen, wie die Ergebnisse durch die Masse des Gewebes normalisiert werden. Die Menge des Thoraxes verwendet kann auch optimiert werden. Das Protokoll kann angepasst werden, um einen einzigen Thorax pro Kammer35verwenden, aber ein gewisses Maß an Auflösung könnte bei der Messung des Sauerstoffverbrauchs so viel wie bei der Ermittlung des Trockengewichts verloren. Die Menge des Thoraxes kann erhöht werden, wenn nötig, aber es ist wichtig zu beachten, dass mehr Mitochondrien in der Probe, desto höher der Sauerstoffverbrauch und die Kammern daher müssen reoxygenated werden. Diese flussbettfilters lässt sich durch die Öffnung der Kammern und Sauerstoff zu injizieren, aber es erhöht die Wahrscheinlichkeit um Luftblasen in der Kammer einzufügen. Daher, wenn möglich, versuchen Sie, zu vermeiden, dass reoxygenate die Kammern (außer wenn Komplex IV maximal Atmung Kapazität werden ermittelt muss). Vor der Ausführung der Experimente, ist Optimierung der Substrat-Konzentrationen auch notwendig, den höchsten mitochondriale Sauerstoffverbrauch zu erreichen, ohne hemmende Effekte durch eine übermäßige Konzentration zu beobachten. Außerdem müssen die Kammern der Respirometer gründlich gereinigt werden, um mögliche Kontaminationen zu vermeiden. Es ist wichtig, die Reinigung mit distillated Wasser und dann 70 % Ethanol get rid of mögliche biologische Kontaminationen zu starten. Im Anschluss an diese eine Inkubation in absoluten Ethanol für 10 min wird empfohlen, zur Vermeidung von Kontaminationen von hydrophoben Inhibitoren. Schließlich werden die Kammern mit distillated Wasser spülen und Befüllen mit 70 % igem Ethanol mögliche Verunreinigungen bis die nächste Nutzung vermieden.
Das Protokoll kann leicht geändert werden, um die Wirkung von anderen Substraten oder anderen Inhibitoren untersuchen. Zum Beispiel ist ein interessantes Protein zu studieren der mitochondrialen Pyruvat Träger (MPC). Die Rolle dieses Proteins ist Pyruvat erzeugt in der Zellflüssigkeit in der mitochondrialen Matrix zu transportieren. Vor kurzem wurde es vorgeschlagen, eine wichtige Rolle in der Modulation des Stoffwechsels während der pathologischen Bedingungen wie z. B. bei Typ 2 Diabetes38. Um die Wirkung des Proteins MPC auf mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen, ist es sinnvoll, die Injektionen mit Pyruvat nur anstelle von Pyruvat und Malat zur gleichen Zeit beginnen. Effekts den Pyruvat ist also, unabhängig von der Wirkung von Malate, untersucht, da Letzteres injiziert wird, um nur die Tricarboxylic Säure Zyklus zu unterstützen und sicherzustellen, dass Zwischenprodukte nicht erschöpft sind. Es ist auch möglich, Inhibitoren der MPC39 verwenden, um wenn eine Einschränkung dieses Transporters zu bewerten, anstatt die Oxidation von Pyruvat wird beobachtet. Dann wäre es möglich, eine mögliche Verschiebung in die bevorzugte Energiequelle für Atmung40zu beobachten. Es ist auch möglich um einige Substrate um das Protokoll zu vereinfachen, wenn es nicht relevant für das Studium zu vernachlässigen. Zum Beispiel ist um eine Funktionsstörung des Komplexes zu studieren ich nur, es nicht notwendig, alle Substrate, präsentiert in diesem Protokoll zu verwenden.
Dieses Protokoll stellt einige Einschränkungen, die von in Vivo Bedingungen ablenken. Die Messungen der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch werden erfasst, wenn die Atmung Medium über Luft-Sättigung, ist wie reiner Sauerstoff injiziert wird, um zu verhindern, dass die Begrenzung der Sauerstoffdiffusion innerhalb der Gewebe-30. Darüber hinaus sind die Konzentrationen der Substrate im Übermaß, injiziert die spiegeln nicht der in-Vivo -Bedingungen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass das Alter, Geschlecht, Stamm und Ernährung von Drosophila die Ergebnisse beeinflussen können. Diese Parameter sind daher bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden. Diese Methode ist jedoch näher an physiologischen Bedingungen als Methoden mit mitochondrialen Isolationen, um mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch als die Wechselwirkungen mit den anderen zellulären Komponenten und die strukturelle Integrität der Mitochondrien zu messen und Morphologie sind konservierte31. Es ist wichtig zu beachten, dass mitochondrielle Isolationen vorteilhafter, wenn zusätzliche Parameter wie ROS-Produktion oder mitochondriale Effizienz (Verhältnis P/O) gemessenen27.
Diese Methode kann verwendet werden, um verschiedene Ziele, das Verständnis der mitochondriale Funktionsstörungen und die zugrunde liegenden Mechanismen der metabolischen Krankheiten bis hin zu Tests die Auswirkungen verschiedener Verbindungen auf mitochondriale Funktionen unter pathologischen Bedingungen. Darüber hinaus kann verwendet werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Umweltbelastungen auf den mitochondrialen Stoffwechsel, wie Änderungen in der Diät oder Temperatur beobachten. Beispielsweise ist es möglich, die Effizienz der bioaktiven synthetische Moleküle auf die mitochondriale Funktionen und bei der Behandlung von mitochondriale Funktionsstörungen zu studieren. Diese Methode ist auch ein gutes Werkzeug zu studieren die mitochondriale Funktionen zu verschiedenen Zeitpunkten, wodurch es sehr relevant für die Untersuchung der grundlegenden Mechanismen, die im Zusammenhang mit dem Prozess des Alterns. Die Beurteilung der mitochondrialen Stoffwechsel über Sauerstoffverbrauch mit permeabilized Thoraxes wird sicherlich dazu beitragen, um unser Wissen über die Rolle der mitochondrialen Stoffwechsel zu verbessern, wenn die Zelle schwierigen Bedingungen ausgesetzt ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde finanziert durch Zuschüsse aus dem National Sciences und Engineering Research Council (NSERC, Entdeckung Grant) und Université de Moncton, NP. LHB möchte die finanzielle Unterstützung des Canadian Institute of Health Research (CIHR), New Brunswick Innovation Foundation (NBIF) und der Université de Moncton anerkennen. Die Arbeit des EHC wird von der Université de Moncton und Alzheimer Gesellschaft des Gehirns Kanada, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, Kanada, New Brunswick Health Research Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
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