Summary
이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.
Abstract
과일 파리, 초파리 melanogaster, 물질 대사 연구에 대 한 새로운 모델을 나타냅니다. 실제로, 초파리 인간의 장기에 동종 구조, 높은 보존된 대사 경로가지고 있고 시간의 짧은 기간에 다른 근본적인 메커니즘의 연구를 수 있는 비교적 짧은 수명을. 그러나 그것은,, 그 세포 신진 대사, 미토 콘 드리 아 호흡에 필수적인 메커니즘 중 하나는 되어 철저 하 게 조사 하지이 모델에 놀라운. 초파리에서 미토 콘 드리 아 호흡의 측정 일반적으로 개인의 매우 많은 수를 요구 하 고 얻은 결과 매우 재현할 수 있기 때문에 가능성이 높습니다. 여기, 조직 초파리에서의 최소한의 금액을 사용 하 여 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 정확한 측정을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 직업적인 해 부 이며 모두 기계적으로 날카로운 집게와 화학적 사포닌, 교차 하는 세포 막, 미토 콘 드리 아 호흡을 조절 하는 다른 화합물을 수 있도록 permeabilized. Permeabilization, 후 프로토콜 여러 억제제에는 uncoupler에 그들의 응답에 뿐만 아니라 다른 기판 산화 전자 교통 시스템 (ETS)의 다른 단지의 용량을 평가 하기 위해 수행 됩니다. 이 메서드는 미토 콘 드리 아 아직 다른 세포질 구성 요소와 상호 작용 하기 때문에 미토 콘 드 리아 형태 보존 더 순수 관련으로 미토 콘 드 리아 격리를 사용 하 여 방법에 비해 많은 장점을 제공 합니다. 또한, 샘플 준비는 빠르게, 그리고 얻은 결과 매우 재현. 미토 콘 드리 아 호흡의 평가와 물질 대사 연구에 대 한 모델 초파리의 장점을 결합 하 여 새로운 통찰력 공개, 될 수 있는 중요 한 특히 때 파리 발생 하는 다른 환경 또는 병 태 생리 조건입니다.
Introduction
과일 파리, 초파리 melanogaster 사용 되었습니다 모델 생물으로 서 유전자 연구에 대 한1세기 이상. 이 유 기체의 연구만 sex-linked 상속2, 돌연변이 속도3, 신경 시스템의 개발 및 세포 운명 결정4에 대 한 중요 한 기초 지식을 주도 하지 않은 하지만 또한 최근 등장으로 Alzheimer와 Parkinson의5,6등 여러 질병에 고유의 메커니즘을 연구를 유용한 도구입니다. 또한, 그들은 시간의 짧은 기간 동안 많은 수에서 올려질 수 있고 짧은 수명으로 노화 과정을 공부 하는 인기 있는 모델입니다. 그들은 또한 인간의 장기는 심장, oenocytes (hepatocyte 같은 셀), 지방 기관 (간 및 백색 지방 조직으로 유사 하 게 작동), 인슐린 생산 세포 (췌 장 β 세포에 해당), 동종 구조를가지고 뿐만 아니라 hemolymph 수송 대사 산물 (척추 동물의 혈액과 유사)7. 또한, 중앙 통로 중간 대사 (인슐린/인슐린 같은 성장 인자와 같은 신호 통로 및 대상의 Rapamycin-토르 경로 포함)의 높은 보존된7있습니다. 이러한 이유로 초파리 최근 당뇨병8등 인간의 신진 대사 질환에 병 적인 조건에서 특히 신진 대사를 제어 하는 기본 메커니즘을 설명 하기 위해 개발 되었습니다. 물질 대사의 주요 구성 요소는 mitochondrion 여러 경로 통합 하 고 생활의 가장 중요 한 생물 학적 기능 중 하나를 수행 하는 (OXPHOS) 산화 인 산화 과정을 통해 ATP 생산. 생물의 물질 대사에 있는 그들의 중추적인 역할을 고려 하면 그것은 놀라운 미토 콘 드 리아 장애 루 경화 증 뿐만 아니라 파 킨 슨 병9 , Alzheimer 질병10, 같은 많은 질병에 관련 된 11 , 12. 그들은 또한 노화 과정의 근본적인 결정 요인. 실제로, 그들은 산화 손상11높은 농도에서 세포에 해로운 수 셀 반응성 산소 종 (선생님)의 주요 생산자. 노화 또한 미토 콘 드리 아 속16의 손상 뿐만 아니라 손상 된 돌연변이 미토 콘 드리 아 DNA13, mitophagy 장애14,15 의 축적에 연결 되었습니다. 미토 콘 드리 아는 또한 세포의 항상성의 주요 결정 요인 그들은 풍부 또는 부족 macronutrients17,18의 여러 세포 기능을 조정 하려면 다른 기질을 이용할 수 있다.
실제로, 다른 영양소 (탄수화물, 지질 및 단백질) 다이어트에는 소화, 흡수와 세포에 수송. 그들은 다음, cytosol에 변화 그리고 파생된 기판 그들이 있는 줄이는 해당 하는 NADH와 FADH219를 생산 하는 미토 콘 드 리아 매트릭스로 이송 됩니다. 이러한 감소 등가물은 다음 전자 교통 시스템 (ETS)의 다른 효소 복합물에 의해 산화 된다. 이 단지는 복잡 한 같은 미토 콘 드리 아 내 막에 포함 된 복잡 한 제. 또한, 미토 콘 드리 아 글리세롤 3 인산 염 효소, 프롤린 효소 등 효소 다른 단지 ETS20,21에 전자의 항목에 대 한 대체 경로 나타냅니다. '대안'이 단지는 곤충, 특히 중요 한으로 종에 따라 그들은 적극적으로 참여할 수 호흡20,,2223,21증가 하. 전자 시스템을 먹이이 ETS에서 마지막 수락자 분자 산소까지는 ubiquinone 및 이후 복잡 한 iii, 그리고 복잡 한 4, 전송 됩니다. 이 전자 전송 안 미토 콘 드리 아 막 복잡 한 V (그림 1)에서 ATP를 ADP의 인 산화를 운전에 걸쳐 양성자 동기 힘을 생성 합니다. 세포의 항상성, 미토 콘 드리 아 대사 관련 모델 D. melanogaster 대표를 사용 하 여 공부에 미토 콘 드리 아의 역할의 다양 한 기본 메커니즘의 윤곽을 그리 다 수 있는 강력한 도구 pathophysiological 고려 조건 또는 셀룰러 및 환경 스트레스. 그러나 의외로, 소수의 연구만 실제로 측정 초파리24,,2526에서 미토 콘 드리 아 호흡. 실제로, 미토 콘 드 리아 산소 소비를 평가 하는 것을 목표로 실험 미토 콘 드리 아의 격리가 필요 합니다. 다른 미토 콘 드리 아 기능 (예: 선생님 생산 또는 미토 콘 드 리아 효율27,28의 표식으로 P/O 비율)의 측정에 대 한 유리, 이러한 격리는 일반적으로 오히려 다량 필요 조직의 여러 개인24,29에서. 조직과 개인의 높은 금액에 대 한이 요구는 중요 한 제한 요소, 특히 모든 개인이 같은 나이 이어야 한다 고려 하 고 가급적 실험에 대 한 동일한 성의 다른 시간에 호흡 측정을 만들기 최상의 힘 드는 포인트. 또한, 미토 콘 드 리아 격리 미토 콘 드리 아 대사를 경 세 하는 기본적인 기계 장치에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 미토 콘 드리 아를 격리 하는 데 사용 하는 방법 복제 하기 어려움 등 여러 단점을가지고 미토 콘 드리 아 네트워크, 그리고 미토 콘 드리 아 구조와 기능29,,3031의 변경의.
이 연구의 목적은 최소한의 양의 아주 몇몇 개인에서 조직만을 사용 하 여 초파리에 미토 콘 드리 아 산소 소비량을 측정 하는 강력한 프로토콜을 제시 하는 것입니다. 이 프로토콜의 미토 콘 드리 아 산소 소비에서 제자리에 고해상도 respirometry32,33, 와 함께에서 permeabilized 근육 섬유29 초파리 직업적인에서를 사용 하 여 측정 구성 34 , 35.이 메서드는 또한 추가적인 장점 때문에 셀의 다른 구성 요소와 상호 작용으로 잘으로 미토 콘 드리 아의 구조와 기능에 더 보존 permeabilized 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 방법에 비해 섬유29,,3136,이 접근을 더 순수 관련 시키는. 이 프로토콜, 미토 콘 드 리아 기능 수 있습니다 정확 하 게 평가 초파리의 3 개의 직업적인 ETS의 몇 가지 다른 단계에서 산소 소비의 결심을 허용 하는 기판으로 고해상도 respirometry를 사용 하 여. 따라서,이 프로토콜은 초파리 모델을 활용 하 여 많은 환경 또는 병 태 생리 조건에서 대사를 제어 하는 기본 메커니즘에 대 한 주요 질문에 답변을 도울 수 있었다.
하는 ETS의 몇 가지 다른 단계에서 산소 소비량을 측정 하 고 어떻게 다른 기판 평가 호흡, 다른 기판 (그림 1), uncoupler을 그리고 억제제 사용된30 의 permeabilization 후에 조직입니다. 특히, 다른 기판의 순차적 추가 자극 하는 ETS의 다른 단지를 통해 전자의 항목을 수행 됩니다. uncoupler 생성 시안 화물 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), 비 결합 호흡을 측정 하기 위해 최적의 농도에 추가, 즉, phosphorylating 비 호흡 극대 산소 소비를 자극. I, II, 및 III 다음 비 ETS 산화 반응으로 인해 잔여 산소 소비를 모니터링을 수행 하는 단지의 순차적 임무 N, N, N의 주입에 의해 복잡 한 IV 최대한 호흡 능력을 평가 하는 마지막으로,', N-Tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD)는 인공 전자 업체, 그리고 하는데. 그것은 그것 이기 때문에 파리는 발생 하는 온도 실험 24 °C에서 실시 하는 것을 주의 하는 것이 중요.
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Protocol
1. 시 약 준비
- 해 부 및 조직의 permeabilization에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
- 보존 솔루션 준비: 2.77 m m 케이크2EGTA, 7.23 m K m2EGTA, 5.77 m m 나2ATP, 6.56 m m MgCl2, 황소자리, 20 mM 15 mM 나2phosphocreatine, 이미 20 m m, 0.5 m m dithiothreitol, 그리고 50mm K-MES, pH 7.1 (저장 될 수 있다 -20 ° C).
- 사포닌 솔루션 준비: 보존 솔루션의 1 mL에 사포닌의 5 밀리 그램 (신선한 매일 준비).
- 호흡의 측정에 대 한 다음 솔루션을 준비 합니다.
- 호흡 매체 준비: 120 m m KCl, 5mm KH2포4, 3 mM HEPES, 1mm EGTA, 1 mM MgCl2및 0.2 %BSA (w/v), pH 7.2.
- 기판, uncoupler, 억제제를 준비 합니다. H2O, 모든 기질을 녹이 고 에탄올 (malonate는 H2O 희석)를 제외 하 고 절대에 억제제로 서 uncoupler FCCP 해산. 기판으로 malonate ( 재료의 표참조)의 대부분을 무력화. 프로토콜에 주어진 모든 농도 2 mL 챔버 내부 최종 농도.
2. 준비와 고해상도 Respirometer의 교정.
- 챔버, 모자, 그리고 세 번 70% 에탄올과 세 번 증류수 respirometer의 마 개를 세척.
- 제로 산소 농도에서 보정: 피펫으로 실에서 호흡 매체의 2.3 mL 10 밀리 그램의 나트륨 dithionite 추가. 챔버의 최대 볼륨은 2 mL, 비록 2.3 mL 챔버를 닫을 때 아무 기포 마 개에서 유지 하기 위해 추가 됩니다. 챔버는 마 개를 닫고 결과 산소 소비 속도와 제로 산소 농도에서 전극 10-20 분 보정에 대 한 산소 농도 측정 합니다.
- Distillated 물 챔버를 세척 하 고 10 분, 절대 에탄올에 품 어 다음 증류수로 씻어.
- 공기 채도에서 보정: 피펫으로 실에서 호흡 매체의 2.3 mL는 stoppers, stoppers, 위에 초과 중간 발음 넣은 다음 공백 요소와 stoppers 리프트. 초과 호흡 매체는 챔버를 닫은 후 공기 방울의 존재를 피하기 위해 실 (2 mL 전체 볼륨)에서 pipetted입니다.
- 한 시간, 산소 농도 (블루 추적) 250 주위 안정 될 때까지 45 분에 대 한 산소 소비량을 모니터링 24 ° c.에 nM
3. 파리와 조직 Permeabilization의 해 부
- 얼음에 모든 단계를 수행 되었는지 확인 합니다.
- 6 남성 파리 같은 스트레인의 anaesthetize, 같은 나이 (야생-타입 w1118, 15 일 cornmeal 매체에 먹이) 파리의 해 부를 촉진 하기 위하여 얼음에 같은 다이어트에 제기.
- Using 메스와 뾰족한 집게, 비행 근육을 포함 하는 직업적인만 계속 (머리 및 인체 제거) 파리를 해 부. 이 단계는 육안으로 할 수 있습니다. 뾰족한 집게와 결과 직업적인 처리 합니다.
- 25 mm 페 트리 접시는 집게를 사용 하 여 차가운 보존 솔루션의 2 개 mL를 포함 하는 3 개의 해 부 직업적인 전송.
- 뾰족한 집게는 직업적인은 집게의 끝을 삽입 하 여 기계적으로 직업적인을 permeabilize와 반복적으로 찢 어 떨어져 느슨하게 연결 된 네트워크를 조직.
- 24-잘 접시에 두 개의 우물을 12.5 µ L의 사포닌 솔루션 및 사포닌의 62.5 µ g/mL의 최종 농도를 보존 솔루션의 1 mL 채우십시오. 호흡 매체의 1 mL로 두 개의 인접 한 우물을 채우십시오.
- 뾰족한 집게 3 permeabilized 직업적인 희석된 사포닌 솔루션에 전송 하 고는 궤도 셰이 커, 얼음에 20 분 동안에 온화한 동요와 함께 품 어.
- 후자의 부 화 후 씻어 내는 사포닌을 5 분 동안 얼음에 약한 동요와 함께 호흡 중간으로 가득 인접 한 우물에 섬유를 전송 합니다.
4입니다. 건조 중량의 결정
- 흡수 성 표면에 permeabilized 직업적인 건조 하 고 3-4 회 뾰족한 집게를 사용 하 여 모든 습기가 제거 되도록 플립.
- 3 직업적인을는 중량에 무게. Note 획득된 무게 미토 콘 드 리아 산소 소비 속도 정상화 하는 데 사용할 것입니다.
- 얼음에 조직 호흡 매체의 한 방울에 즉시 전송 합니다.
5. 산소 소비 속도 결정
- respirometer의 챔버를 열고 (제거는 stoppers) 각 챔버에 10 mM pyruvate의와 malate의 2 mM를 추가.
- Permeabilized 조직 호흡 매체와 채워진 챔버에 직접 추가 합니다.
- 마 개는 스페이서를 사용 하 여 교체 합니다.
- 60 mL 주사기는 산소 탱크에서 직접 산소를 수집 하 고 조직을 통해 산소 유포 산소 소비를 제한 하지 것입니다 있는지 확인 하려면 각 챔버의 스 토퍼 모 세관을 통해 산소의 2 ~ 5 mL를 주입 합니다.
- 해밀턴 주사기를 직업적인 챔버에 남아 있는지 확인 하려면 각 스 토퍼의 모 세관에 넣습니다.
- 산소 농도 약 400 때 챔버를 완전히 닫습니다 nM, 공기 채도 위에 산소 레벨 달성 (약 160% 공기 포화) 약 실 내부.
- 중지 하 고 약 실에서 공기 방울에 대 한 확인을 교 반기.
- 조직 질량 특정 산소 소비 pmol O2 consumed.s-1.mg-1 조직의 표시 질량 (mg), 조직의 호흡 속도 정상화 이전 무게의 질량을 입력 합니다.
- 일단 산소 소비 (빨간색 추적) 안정화는, 5mm ADP 해밀턴 주사기를 추가 합니다.
- 각 주입 후 증류수, 70% 에탄올으로 주사기를 헹 구 고 다시 증류수.
- 산소 소비는 다시 안정, 일단 5 µ L 시 토 크롬 c의 4 m m의 주사.
- ETS의 다른 단계에서 미토 콘 드리 아 산소 소비를 평가 하기 위해 다음 기판의 순차 주사 하십시오.
- 2 M 프롤린의 5 µ L를 추가 합니다.
- 1 M 호박의 10 µ L를 추가 합니다.
- 1 M 글리세롤-3-인산의 30 µ L를 추가 합니다.
- 0.5-1의 단계에 의해 적정 방식에서 uncoupler FCCP 주입 최적 농도까지 µ M (1 m m 솔루션의 2 µ L)는에 도달, 즉, 금지 없이 가능한 높은 산소 소비를 달성 하기 위해 집중 (주의: 테이블 참조 재료의).
- 전적으로 잔여 산소 소비 (ROX)을 측정 하기 위하여 ETS에 전자 플럭스를 억제 하기 위해 순차적으로 다음 억제제를 주입 다른 사람의 사이에서 oxygenase 반응 등 즉 비 호흡 반응:
- 1 m m로 테 논의 1 µ L 추가 (주의: 재료의 표참조).
- 5 µ L 2 M malonate의 추가 (주의: 재료의 표참조).
- 5 mM antimycin A의 1 µ L 추가 (주의: 재료의 표참조).
- 추가 하는데 0.2 m m와 0.5 m m TMPD 순차적으로 실로 복잡 한 4에 의해 산소 소비량을 측정 하는데부터 시작 합니다.
- 추가 복잡 한 IV를 억제 하기 위해 나트륨 아 지 드의 20 mM (주의: 재료의 표참조).
- 신호는 안정, 일단 챔버는 스페이서와 함께, 다시 순수한 산소의 2 개 mL를 주입 하 여 챔버 산소 개폐 실 때 농도 250-300 nmol.mL-1.
- 10-15 분에 대 한 신호를 측정 하 고 계산 화학 배경, 즉, TMPD의 autoxidation 때문에 산소 소비.
6. 청소는 Respirometer의
- 측정 후 증류수와 챔버를 한번 씻어 하 고 린스 70% 에탄올에 세 번 약 실.
- 10 분에 억제제를 비활성화에 대 한 절대 에탄올에 품 어.
- 증류수로 세 번 씻어, 약 실 70% 에탄올를 다음 사용률까지는 마 개 및 뚜껑 교체.
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Representative Results
위에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 미토 콘 드리 아 산소 소비의 대표 추적 그림 2에 제공 됩니다. Pyruvate와 malate permeabilized 근육 섬유 함께 챔버에 주입 이라고 CI 누출 호흡, 즉, 복잡 한 ETS의은 의해 자극 하는 경우는 NADH 생산 pyruvate와 통해 malate의 산화는 tricarboxylic 산 주기 (CI)입니다. 이 호흡 속도 동안 미토 콘 드 리아 산소 주로 ATP synthase 활성화 (누출)30때 미토 콘 드리 아를, intermembrane 공간에서 교차 하는 양성자 양성자 누출, 즉에 대 한 보상 유지 됩니다. ADP, ATP synthase 활성화 하며 전자 전송 때 I (CI-OXPHOS), ATP에 ADP의 동시 인 산화와 복잡 한 4 인 미토 콘 드 리아 산소 소비를 증가 하는 복잡 한에서. OXPHOS 커플링 비율 CI-OXPHOS/CI-누설으로 계산 되 고 보통의 미토 콘 드리 아 및 미토 콘 드 리아 커플링30의 좋은 지시자로가지고 간다. 초파리에이 비율 적어도 6.0 (그림 3)를 초과 한다. 이면이 값 보다 조직 준비 또는 미토 콘 드리 아 역 기능 문제를 나타낼 수 있습니다. 시 토 크롬 c의 추가 외부 미토 콘 드리 아 막의 무결성의 결심을 허용 하 고 그러므로 준비 (그림 4)의 품질 관리로 사용. 사실, 시 토 크롬 c 내부 미토 콘 드리 아 막에 바인딩된 느슨하게 하 고는 일반적으로 씻 겨 외부 미토 콘 드 리아 멤브레인 permeabilization 프로세스 동안 손상 된 경우. 그 결과, 외 인 시 토 크롬 c를 추가 크게 증가 산소 소비 외부 미토 콘 드 리아 멤브레인 손상 하 고 생 시 토 크롬 c는 손실 됩니다. 산소 소비 (그림 4)에서 10-15%의 증가 일반적으로 외부 미토 콘 드 리아 멤브레인29의 적절 한 무결성을 보여줍니다. 그림 3 및 4, 녹색 추적 가져온 비 적절 한 permeabilization를 ( 그림 3, 조직의 끊어지고 과도 하 고 그림 4에 대 한 흡수 성 표면에 장시간 후 무게), 샘플의 처리 반면 붉은 흔적이 permeabilized 적절 하 게 처리 하 여 샘플을 나타냅니다. 이러한 결과 적절 한 permeabilization 조건은 미토 콘 드 리아 산소 소비량의 신뢰성 평가 위한 중요 한 강조 표시 합니다.
실험 중에 사용 하는 다음 기판은 ubiquinone 전자를 제공 하 고 ETS에 전자 플럭스를 증가 수 있습니다. 프롤린 급성 기아 또는 병 적인 조건37특히 곤충23, 뿐만 아니라 포유류 에너지 기질으로 사용 될 수 있는 아미노산 이다. 때 전자는 흐르는 두 단지에서 나 ProDH OXPHOS 프로세스 (CI + ProDH-OXPHOS)에 참여 하 고 약 실에 프롤린의 추가 ETS에서 전자 플럭스 프롤린 효소 (ProDH)의 기여를 평가 하 있습니다. 호박의 추가, 복잡 한 2 차 (호박 효소)는 ETS에 기여 (CI + ProDH + CII-OXPHOS) 관찰할 수 있습니다. Glycerophosphate 셔틀 및 전송의 일부는 미토 콘 드리 아 글리세롤 3 인산 염 효소 (G3PDH)을 자극 하는이 기판으로 글리세롤-3-인산 (G3P)의 주입 더 미토 콘 드 리아 산소 소비를 증가 ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS)에 전자 둘 다 ProDH와 G3PDH 여러 종의 곤충에 특히 활성 표시 되며 따라서 초파리20,,2122,23,32이이 프로토콜에 중요 한 .
FCCP 추가 uncoupler 비 결합 호흡 (ETS 상태) 얻은 때, 즉, ETS (CI + ProDH + CII + G3P-ETS)의 최대 용량을 나타내는 최대 산소 소비. FCCP 복잡 한 V를 통과 하지 않고는 미토 콘 드리 아를 intermembrane 공간에서 양성자를 수송 하는 protonophore 이다. FCCP 농도 비 최대 산소 소비와 미토 콘 드리 아 산소 소비 (그림 5)의 저해에 최적의 결과 이상의 농도 동안 비 안정 호흡 속도에서 최적의 결과 아래로 신중 하 게 적정 될 수 있다. 일단 고 기판은 uncoupler 추가, 단지 I, II, 및 III 순차적으로 수의 억제로 테 논, malonate, 그리고 antimycin, 각각 사용 하 여 수행 합니다. 각 억제제 사용, 미토 콘 드 리아 산소 소비에 있는 감소는 관찰, A. antimycin의 추가 후 최저 산소 소비를 도달할 때까지 속도 후 모든 억제제의 추가 잔여 산소 소비30에 도달. 그것은 예를 들어 oxygenase 반응 및 반응 종 생산 같은 비-미토 콘 드 리아 산화 반응으로 산소 소비를 대표 하 고 따라서 다른 모든 요금에서 공제를 측정 했다.
TMPD는 복잡 한 4에 직접 전자를 제공 하 여 우회 모든 복합물 상류, 복잡 한 IV 최대한 호흡 능력의 측정을 허용 하는 인공 전자 운송업 자. 그러나이 기판은 그래서 하는데 수 있다 autoxidation, 하는 경향이 제한 하지만 완전히이 autoxidation을 피하기 위해 TMPD에 사전 추가 하는. TMPD의 나머지 autoxidation를 해결 하기 위해 복잡 한 IV 억제제 나트륨 아 지 드 챔버에 추가 되 고 산소 소비 다음 10-15 분에 대 한 기록 됩니다. 이 산소 소비는 따라서 화학 배경, 또는 다른 말로 하면 복잡 한 IV 최대한 호흡 용량의 계산에 고려 한다 TMPD의 autoxidation를 나타냅니다.
그림 1 . 전자 교통 시스템 및 산화 인 산화는 미토 콘 드리 아 내 막에 의해 미토 콘 드리 아 전자 수송의 도식 대표. I: 복잡 한; II: 복잡 한 II; III: 복잡 한 III; IV: 복잡 한 IV; 된 ATP synthase; 아 세 틸 coa: 아 세 틸 보 효소 A; Cyt c: 시 토 크롬 c; e-: 전자; G3P: 글리세롤-3-인산 염; G3PDH: 미토 콘 드리 아 글리세롤 3 인산 염 효소; H+: 양성자; PRODH: 프롤린 효소; TCA: tricarboxylic 산 주기입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 미토 콘 드리 아 산소 농도 (블루 추적)와 초파리의 permeabilized 직업적인에 소비 (빨간 추적)의 대표적인 흔적. 각 주사 주입 하는 화합물을 나타내는 화살표와 함께 표시 됩니다 (Pyr: pyruvate; 말: 말라; ADP; Cyt c: 시 토 크롬 c; 프로: 프롤린; Succ: 호박; G3P: 글리세롤-3-인산 염; FCCP: 카보닐기 시안 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone; 부패:로 테 논; 생말로: malonate; 개미 a: antimycin TMPD: N, N, N', N-Tetramethyl-p-phenylenediamine; Asc: 하는데; SAZ: 나트륨 아 지 드). 산소 소비 (빨간 추적) 안정 되었습니다 때 각 미토 콘 드 리아 산소 소비 속도 그래프에 표시 됩니다. 시 토 크롬 c 효과 외부 미토 콘 드리 아 막의 무결성을 나타냅니다 (대 한 자세한 내용은 텍스트 참조). 잔여 산소 소비 때문에 세포에서 산화 측 반응 산소 소비 나타내고 측정 다른 모든 가격을 뺄 수 있다. 화학 배경 TMPD의 autoxidation 때문 에서만 산소 소비를 나타냅니다 하 고 복잡 한 IV 최대한 호흡 용량의 계산에 고려 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 유효한 (빨간 추적, 챔버 A)의 대표적인 흔적 및 부적당 한 (녹색 추적, 챔버 B) ADP의 추가에 대 한 응답. 빨간색 추적 챔버 A에 해당 하 고 녹색 추적 같은 실험 기간 동안 B, 약 실에 해당 합니다. 붉은 추적 직업적인 적절 하 게 녹색 추적 과도 permeabilization 동안 조직을 찢 어 후 얻은 반면 permeabilized에서 얻은 했다. ADP 추가 될 때 붉은 추적 같은 산소 소비 증가 예상. OXPHOS 커플링 비율 CI-OXPHOS/CI-누설으로 계산 하 고 그래프에 표시 됩니다. 초파리에서 6.0 미만의 비율 미토 콘 드 리아 커플링에 문제를 제안 하 고 샘플 저하 또는 녹색 추적으로 표시 하는 미토 콘 드 리아 기능 장애의 특징입니다. Pyr: pyruvate; 말: 말라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 유효한 (빨간 추적, 챔버 A)의 대표적인 흔적 및 부적당 한 (녹색 추적, 챔버 B) 시 토 크롬 c의 추가에 대 한 응답 빨간색 추적 챔버 A에 해당 하 고 녹색 추적 같은 실험 기간 동안 B, 약 실에 해당 합니다. 반면 녹색 추적은 직업적인 고의로 무게 전에 흡수 성 표면에 더 긴 시간 동안 건조 했다 후 얻은 빨간 추적 직업적인 적절 하 게 permeabilized 및 처리에서 얻은 했다. 시 토 크롬 c는 일반적으로 증가 하지 미토 콘 드 리아 산소 소비로 외부 미토 콘 드 리아 멤브레인은 그대로 나타내는 빨간색 추적에서 본. 그러나 그것은 제안 외부 미토 콘 드 리아 멤브레인 손상 되 고 따라서 샘플은 타락 하 고 해야 될 경우,, 외 인 시 토 크롬 c의 추가 크게 증가 15% 이상의 미토 콘 드리 아 산소 소비로 녹색 추적에서 본, 삭제 됩니다. Pyr: pyruvate; 말: 말라; Cyt c: 시 토 크롬 c. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 미토 콘 드리 아 산소 농도 (블루 추적)와 FCCP의 적정 후 소비 (빨간 추적)의 대표적인 흔적. 여러 농도에서 FCCP의 다른 주사는 신중 하 게이 uncoupler에 의해 발생 하는 최대 산소 소비를 결정 하기 위해 수행 해야 합니다. 부족 한 농도 최대 산소 소비량의 평가 허용 하지 않습니다 그리고 FCCP 초과 미토 콘 드 리아 산소 소비를 억제 하는 반면 비 안정 호흡 속도 의해 특징입니다. 화살표는 FCCP의 다른 주사를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 재현성의 미토 콘 드리 아 산소 소비 속도 두 개의 다른 챔버 (빨간색 추적, 챔버 A; 녹색 추적, 챔버 B)는 respirometer의를 사용 하 여 얻은 전형적인 실험 중. 붉은 추적 챔버 A에 해당 되며 녹색 추적 챔버 동일한 시간 동안 B 같은 나이에서 초파리를 사용 하 여 실험, 섹스, 스트레인 및 설명 하는 프로토콜 뿐 아니라 같은 다이어트에 제기 합니다. 두 샘플 건조 조직 프로토콜에 설명 된 대로 무게의 질량으로 표준화 했다 (0.53 및 0.66 mg 챔버 A와 B에 대 한 각각). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 연구에서는 초파리에서 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정 전에 샘플 준비 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 기간 및 필요한 개인의 수의 점에서 특히 미토 콘 드리 아 격리를 사용 하 여 프로토콜에 관련 된 다른 문제를 극복 하기 위해 개발 되었다. 일반적으로 조직의 여러 개인에 게 서 얻은 큰 금액을 요구 하는 미토 콘 드 리아 격리 사용 대신,이 실험에서 몇 초파리의 직업적인 permeabilized 근육 섬유에 수행 됩니다. 이 프로토콜에만 3 개인 최적의 결과를 표시할 필요 합니다. 따라서, 다양 한 시간 포인트에서 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정으로 동기화 하는 데 같은 나이의 같은 섹스의 작은 그룹을 더 달성 가능 하다.
첫째, 그것은 같은 나이, 성별, 스트레인의 초파리를 사용 하는 것이 중요 하 고 결과 (그림 6), 낮은 분포도를 동일한 조건에서 제기 호흡 나이, 성별, 유전자 형, 그리고 파리의 다이어트와 함께 변경할 수 있습니다. 이 프로토콜의 실행에서 가장 중요 한 단계는 직업적인 permeabilization 절차입니다. 그것은 매우 중요 한 조직의 저하를 피하기 위해 신속 하 게 진행 하 고 그것은 또한는 직업적인 극대 산소 소비 속도를 permeabilized 잘는 다는 것을 확인 하는 것이 중요. permeabilization 올바르게 수행 되 고 permeabilization, OXPHOS 커플링 (CI OXPHOS/CI 누수, 그림 3), 비 후는 미토 콘 드리 아의 구조 및 기능적 무결성 유지 됩니다 뿐만 아니라 시 토 크롬 c (그림 4)에 대 한 응답 품질 컨트롤로 사용 됩니다. 신속 하 게 작업 하 고 있는 permeabilization 잘 실행 확인 하 사이 고려 하는 단점이 있다. 그것은 또한 항상 조작 해 부 직업적인 얼음에 작동에 중요 한입니다. 가장 재현성 결과 (그림 6)를, 균질 성 permeabilization는 필요는 permeabilization 같은 운동 반복 되 다는 것을 확인 하는 데 도움이 대 한 기법을 연습 하 고. 또 다른 중요 한 단계는 샘플의 건조 중량의 결정 이다. 실제로, 후에 직업적인 알을 품는, 그들은 매우 중요 한, 연 약하고 저하 하는 경향이입니다. 따라서, 유사 하 게 permeabilization, 건조 중량의 결정을 신속 하 게 진행이 중요 합니다. 다른 한편으로, 그것은 결과 조직의 질량 정규화로 정확도와 무게를 결정 하는 것이 중요. 직업적인 사용의 수량 또한 최적화할 수 있습니다. 챔버35, 당 단일 가슴을 사용 하는 프로토콜을 적용할 수 있습니다 하지만 해상도의 특정 수준을 건조 중량의 결정으로 산소 소비량의 측정에서 손실 될 수 있습니다. 필요한 경우, 직업적인의 수량을 증가 될 수 있다 그러나 그는 더 많은 미토 콘 드리 아 샘플에서 높은 산소 소비와 약 실 해야한다 따라서 reoxygenated 수를 주의 하는 것이 중요 하다. 이 reoxygenation는 챔버를 열어 행 해질 수 있다 산소, 주사 하지만 챔버에 공기 방울을 삽입 하는 확률을 증가 시킬 것 이다. 따라서, 만약에 가능 하다 면, (를 제외 하 고 때 복잡 한 IV 최대한 호흡 용량이 결정 되는) 챔버 reoxygenate을 하려고 합니다. 실험을 실행 하기 전에 기질 농도의 최적화 때문에 과도 한 집중 억제 효과 관찰 하지 않고 높은 미토 콘 드 리아 산소 소비를 달성 하는 데 필요한 이기도 합니다. respirometer의 챔버는 또한 잠재적인 오염을 방지 하기 위해 철저 하 게 청소 해야 합니다. 그것은 distillated 물 그리고 잠재적인 생물학적 오염 제거에 70% 에탄올으로 청소를 시작 해야 합니다. 이 분에 대 한 절대 에탄올에 외피 다음 것이 좋습니다 소수 성 억제제의 오염을 방지. 마지막으로, distillated 물 챔버를 헹 구 고 70% 에탄올과 그들을 작성 하는 것 다음 활용까지 잠재적인 오염 피할 것 이다.
다른 기질, 또는 다른 억제제의 효과 연구 하는 프로토콜을 쉽게 수정할 수 있습니다. 예를 들어 공부 하는 재미 있는 단백질은 미토 콘 드 리아 pyruvate 캐리어 (MPC) 이다. 이 단백질의 역할 pyruvate 미토 콘 드리 아 모체로 cytosol에서 생성을 수송 하는 것입니다. 최근에, 그것은 유형 2 당뇨병38동안 같은 병 적인 상태에 있는 동안 물질 대사의 변조에 중요 한 역할을 제안 되었습니다. 미토 콘 드리 아 대사에 단백질 MPC의 효과 연구 하는 동시에 pyruvate와 malate 대신 pyruvate와 주사를 시작 하 유용 합니다. 따라서,는 pyruvate의 효과 공부 하지 독립적으로 malate, 효과에서 후자 tricarboxylic 산 주기 지원 및 중간체가 고갈 되지 않도록만 주입으로. 그것도 MPC39 의 억제제를 사용 하 여이 전송의 제한 하는 경우 평가 수 보다는 pyruvate 산화 관찰. 그런 다음, 호흡40에 대 한 기본 연료 소스에 잠재적인 변화를 관찰 가능한 것입니다. 그것은 또한 연구와 관련이 없는 경우 프로토콜을 단순화 하기 위해 몇 가지 기질을 생략 가능입니다. 예를 들어 복잡 한의 역 기능을 공부 하 난만, 아니다 모든 기판에이 프로토콜을 사용 하는 데 필요한.
이 프로토콜 vivo에서 조건에서 전환 하는 몇 가지 제한이 제공 합니다. 미토 콘 드 리아 산소 소비량의 측정으로 순수한 산소30조직 내 산소 확산의 한계를 방지 하기 위해 주입 공기-채도, 위에 호흡 매체는 때 기록 됩니다. 또한, 기판의 농도 vivo에서 조건 반영 하지는 초과, 주입 됩니다. 그것은 또한 나이, 성별, 긴장과 초파리의 다이어트 결과도 영향을 수 주의 하는 것이 중요입니다. 이 매개 변수는 결과 해석할 때 고려 될 따라서. 그러나이 메서드는 미토 콘 드리 아 격리를 사용 하 여 다른 세포 구성 요소 및 미토 콘 드리 아의 구조적 무결성과 상호 작용으로 미토 콘 드 리아 산소 소비를 측정 하는 방법 보다 가까이 생리 적 조건 및 형태는 보존된31. 선생님 생산 또는 미토 콘 드 리아 효율 (P/O 비율) 측정된27될 필요가 같은 미토 콘 드 리아 격리 더 유리한 때 추가 매개 변수는 중요 하다.
미토 콘 드 리아 장애의 이해 및 대사 질환의 근본적인 메커니즘에서 병리학에서 미토 콘 드리 아 기능에 다른 화합물의 효과 테스트에 이르기까지 다양 한 목표를 달성 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 조건입니다. 또한, 그것은 다이어트 또는 온도 변화 등 미토 콘 드리 아 대사에 여러 가지 환경 스트레스의 효과 관찰 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어 생리 합성 분자 미토 콘 드리 아 기능에 및 미토 콘 드리 아 장애의 치료에서의 효율성 연구 가능 하다. 이 방법은 매우 노화 과정에 관련 된 기본적인 메커니즘의 연구에 대 한 관련 시키는 다른 시간 지점에서 미토 콘 드리 아 기능을 공부 하는 좋은 도구 이기도 합니다. Permeabilized 직업적인을 사용 하 여 산소 소비를 통해 미토 콘 드리 아 대사 평가 셀 어려운 상황에 노출 되 면 미토 콘 드리 아 대사 역할에 대 한 우리의 지식을 더 확실히 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 NP 국립 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC, 발견 부여) 및 대학교 드 몽 튼에서 교부 금에 의해 투자 되었다. LHB 건강 연구 (CIHR), 뉴 브 런 즈 윅 혁신 재단 (NBIF) 및 대학교 드 몽 튼의 캐나다 연구소에서 자금 지원을 하 고 싶습니다. EHC의 작품은 캐나다, 뇌 캐나다, NSERC, 캐나다 유방암 재단, 뉴 브 런 즈 윅 혁신 재단, 뉴브런즈윅 건강 연구 재단의 알 츠 하이 사회와 대학교 드 몽 튼에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
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