Summary
In questa carta, è descritto un metodo per misurare il consumo di ossigeno utilizzando ad alta risoluzione manometrica in permeabilized toraci di Drosophila. Questa tecnica richiede una minima quantità di tessuto rispetto alla tecnica classica isolamento mitocondriale e i risultati ottenuti sono più fisiologicamente rilevanti.
Abstract
Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, rappresenta un modello emergente per lo studio del metabolismo. Infatti, drosophila hanno strutture omologhe a organi umani, possiedono vie metaboliche altamente conservate e hanno una durata relativamente breve che consente lo studio dei meccanismi fondamentali differenti in un breve periodo di tempo. Sorprende, tuttavia, che uno dei meccanismi essenziali per il metabolismo cellulare, la respirazione mitocondriale, non è stato accuratamente studiato in questo modello. È probabile che la misura della respirazione mitocondriale in drosofila richiede solitamente un numero molto grande di individui e i risultati ottenuti non sono altamente riproducibili. Qui, è descritto un metodo che permette la misurazione precisa del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando la minima quantità di tessuto dalla drosofila. In questo metodo, toraci sono sezionati e permeabilizzate sia meccanicamente con una pinza tagliente e chimicamente con saponina, permettendo diversi composti di attraversare la membrana cellulare e modulano la respirazione mitocondriale. Dopo il permeabilization, un protocollo viene eseguito per valutare la capacità dei diversi complessi del sistema di trasporto dell'elettrone (ETS) di ossidare substrati diversi, così come la loro risposta per un disaccoppiatore e parecchi inibitori. Questo metodo presenta molti vantaggi rispetto ai metodi utilizzando isolamenti mitocondriali, in quanto è più fisiologicamente rilevante perché i mitocondri sono ancora interagendo con le altre componenti cellulari e la morfologia mitocondriale è conservata. Inoltre, la preparazione del campione sono più veloci, e i risultati ottenuti sono altamente riproducibili. Combinando i vantaggi della drosofila come un modello per lo studio del metabolismo con la valutazione della respirazione mitocondriale, importanti nuove intuizioni possono essere svelati, soprattutto quando le mosche sono sperimentando diversi ambientale o fisiopatologico condizioni.
Introduction
Moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è stato utilizzato come organismo modello per la ricerca genetica per sopra un secolo1. Lo studio di questo organismo non ha solo portato a significative conoscenze fondamentali sull'ereditarietà legata al sesso2, mutazione tasso3, lo sviluppo del sistema neurale e la determinazione di destino cella4, ma anche recentemente è emerso come un strumento prezioso per studiare i meccanismi inerenti alle diverse malattie come Alzheimer e Parkinson5,6. Inoltre, è un modello popolare per studiare il processo di invecchiamento, in quanto può essere sollevate in gran numero per un breve periodo di tempo e hanno una durata breve. Inoltre possiedono strutture omologhe degli organi umani, come un cuore, corpi grassi (funziona allo stesso modo come il tessuto adiposo bianco e fegato), oenocytes (hepatocyte-come le cellule), insulina producendo le cellule (equivalente a cellule β-pancreatiche), nonché la emolinfa trasporta metaboliti (analogo al sangue dei vertebrati)7. Inoltre, le vie centrali del metabolismo intermedio (tra cui la via di segnalazione dell'insulina/insulina-come il fattore di crescita e i percorsi del bersaglio della rapamicina-TOR) sono altamente conservato7. Per questi motivi, Drosophila recentemente sono state sfruttate per descrivere i meccanismi fondamentali che controllano il metabolismo, soprattutto in condizioni patologiche inerenti umani malattie metaboliche come il diabete8. Una componente importante del metabolismo è il mitocondrio che integra le vie multiple ed esegue una delle più importanti funzioni biologiche della vita, produzione di ATP, tramite il processo di fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Considerando il loro ruolo centrale nel metabolismo dell'organismo, non è sorprendente che le disfunzioni mitocondriali sono coinvolti in molte malattie come il morbo di Parkinson9 e morbo di Alzheimer malattie10, così come nella sclerosi laterale amiotrofica 11 , 12. sono anche determinanti fondamentali del processo di invecchiamento. Infatti, sono i principali produttori di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella cellula, che può essere dannosa per la cella ad alta concentrazione a danni ossidativi11. Invecchiamento inoltre è stata associata all'accumulo di DNA danneggiato o mutato mitocondriale13, mitophagy disfunzioni14,15 , così come danno della biogenesi mitocondriale16. I mitocondri sono anche determinanti dell'omeostasi della cella come possono utilizzare diversi substrati per regolare diverse funzioni cellulari secondo l'abbondanza o la scarsità di macronutrienti17,18.
Infatti, le diverse sostanze nutritive nella dieta (carboidrati, lipidi e proteine) sono digerite, assorbite e trasportate nelle cellule. Vengono poi trasformati nel citosol, e i substrati derivati vengono trasportati nella matrice mitocondriale dove si producono equivalenti riducenti, quali NADH e FADH219. Questi equivalenti riducenti sono quindi ossidati dai diversi complessi enzimatici del sistema di trasporto dell'elettrone (ETS). Questi complessi vengono incorporati nella membrana mitocondriale interna, come complesso I e II complesso. Inoltre, altri complessi enzimatici come il glicerolo-3-fosfato deidrogenasi mitocondriale e la deidrogenasi di prolina rappresentano percorsi alternativi per la voce di elettroni in ETS20,21. Questi complessi 'alternativi' sono particolarmente importanti in insetti, come secondo le specie, possono partecipare attivamente per aumentare la respirazione20,22,23,21. Elettroni da questi sistemi di alimentazione di ETS sono trasferiti ad l'ubiquinone e successivamente al complesso III e quindi al complesso IV, fino al ricettore finale, ossigeno molecolare. Questo trasferimento di elettroni genera una Forza Protonomotrice attraverso la membrana mitocondriale interna guida la fosforilazione di ADP in ATP al complesso V (Figura 1). Considerando il ruolo centrale dei mitocondri nell'omeostasi della cella, studiando il metabolismo mitocondriale utilizzando il relativo modello d. melanogaster rappresenta un potente strumento per delineare i meccanismi di fondo di varie fisiopatologico condizioni o sotto stress cellulare e ambientale. Sorprendentemente però, solo una manciata di studi effettivamente misurati la respirazione mitocondriale in Drosophila24,25,26. Infatti, gli esperimenti con l'obiettivo di valutare il consumo di ossigeno mitocondriale richiedono l'isolamento dei mitocondri. Anche se vantaggioso per la misurazione delle diverse funzioni mitocondriali (ad esempio produzione di ROS o rapporto di P/O come indicatore di efficienza mitocondriale27,28), questi isolamenti richiedono generalmente piuttosto grandi quantità del tessuto da diversi individui24,29. Questo requisito per elevate quantità di tessuto e di individui è un importante fattore limitante, soprattutto se si considera che tutti gli individui dovrebbero essere della stessa età e preferibilmente dello stesso sesso per gli esperimenti, rendendo la misura della respirazione in tempi diversi punti laborioso nella migliore delle ipotesi. Inoltre, mentre gli isolamenti mitocondriali possono fornire significativi comprensione dei meccanismi fondamentali che regolano il metabolismo mitocondriale, i metodi utilizzati per isolare i mitocondri hanno diversi inconvenienti come la difficoltà di ottenere risultati replicabili , la rottura della rete mitocondriale e alterazione di mitocondriale struttura e funzione29,30,31.
Lo scopo di questo studio è di presentare un protocollo robusto per misurare il consumo di ossigeno mitocondriale in Drosophila usando solo una minima quantità di tessuto da pochissimi individui. Questo protocollo consiste nel misurare ossigeno mitocondriale consumo in situ utilizzando fibre muscolari permeabilized29 da toraci di Drosophila in combinazione con alta risoluzione respirometry32,33, 34 , 35. questo metodo ha anche altri vantaggi rispetto al metodo classico isolamento mitocondriale poiché le interazioni con gli altri componenti della cellula come bene come mitocondriale struttura e funzione sono più conservati in permeabilizzate fibre29,31,36, che rende questo approccio più fisiologicamente rilevanti. Con questo protocollo, funzioni mitocondriali possono essere accuratamente valutate utilizzando manometrica ad alta risoluzione in solo tre toraci di Drosophila, con substrati permettendo la determinazione del consumo di ossigeno alle diverse fasi dell'ETS. Di conseguenza, questo protocollo potrebbe aiutare rispondere alle domande fondamentali circa i meccanismi fondamentali che controllano il metabolismo nel contesto delle diverse condizioni ambientali o patofisiologiche sfruttando il modello di Drosophila.
Per misurare il consumo di ossigeno alle diverse fasi dell'ETS e valutare come i diversi substrati contribuiscono alla respirazione, diversi substrati (Figura 1), disaccoppiatore, e inibitori sono usati30 dopo permeabilizzazione della tessuto. In particolare, aggiunte sequenziale di diversi substrati vengono eseguite per stimolare l'entrata di elettroni attraverso diversi complessi dell'ETS. Un disaccoppiatore, Carbonil cianuro 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), viene quindi aggiunto a concentrazione ottimale per misurare la respirazione non accoppiati, cioè, la respirazione non fosforilante stimolata al massimo consumo di ossigeno. Inibizioni sequenziale dei complessi che i, II e III stiamo quindi eseguita per monitorare il consumo di ossigeno residuo che è a causa di reazioni di ossidazione del non-ETS. Infine, capacità di respirazione massima complesso IV può essere valutata tramite l'iniezione di N, N, N', N, - tetrametil - p-fenilendiammina (TMPD), un elettrone artificiale provider e ascorbato. È importante notare che gli esperimenti sono condotti a 24 °C, dal momento che è la temperatura alla quale vengono generati i mosche.
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Protocol
1. reagenti preparazione
- Preparare le seguenti soluzioni per la dissezione e la permeabilizzazione del tessuto.
- Preparare la soluzione di conservazione: 2,77 CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, 20mm della taurina, 15mm fosfocreatina di Na2, imidazolo di 20 mM, 0.5 mM dithiothreitol e 50 mM K-MES, pH 7.1 (possono essere memorizzati a-20 ° C).
- Preparare la soluzione di saponina: 5 mg di saponina in 1 mL di soluzione di conservazione (preparare freschi ogni giorno).
- Preparare le seguenti soluzioni per la misurazione della respirazione.
- Preparare il supporto di respirazione: 120 mM KCl, 5mm KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2e 0,2% di BSA (w/v), pH 7,2.
- Preparare i substrati, disaccoppiatore, inibitori. Sciogliere tutti i substrati in H2O e sciogliere il disaccoppiante FCCP, come pure gli inibitori in etanolo assoluto (tranne malonato che è diluito in H2O). Neutralizzare la maggior parte dei substrati le malonato (Vedi Tabella materiali). Tutte le concentrazioni, espresso nel protocollo sono concentrazioni finali all'interno di camere di 2 mL.
2. preparazione e taratura del respirometro ad alta risoluzione.
- Lavare il chambers, cappucci e tappi di respirometro tre volte con etanolo al 70% e tre volte con acqua distillata.
- Calibrare in concentrazione zero ossigeno: dispensare 2,3 mL di terreno di respirazione negli alloggiamenti e aggiungere 10 mg di sodio ditionito. Sebbene il volume massima della camera è di 2 mL, 2,3 mL vengono aggiunti per assicurare che nessuna bolla di aria rimane sotto il tappo durante la chiusura delle camere. Chiudere gli alloggiamenti con i tappi e misurare la concentrazione di ossigeno per un minimo di 10-20 Calibra gli elettrodi a concentrazione zero dell'ossigeno con il risultante tasso di consumo di ossigeno.
- Lavare gli alloggiamenti con acqua distillata, Incubare in etanolo assoluto per 10 minuti e poi sciacquare con acqua distillata.
- Calibrare in saturazione dell'aria: dispensare 2,3 mL di mezzo di respirazione negli alloggiamenti, di inserire i tappi, aspirare l'eccesso del prodotto sopra i tappi e poi sollevare i tappi con il distanziatore. Mezzo di respirazione in eccesso è dispensato negli alloggiamenti (volume di 2 mL in totale) per evitare la presenza di bolle d'aria dopo la chiusura delle camere.
- Monitorare il consumo di ossigeno per 45 minuti a un'ora, fino a quando la concentrazione di ossigeno (traccia blu) è stabile intorno a 250 nM a 24 ° C.
3. dissezione di mosche e permeabilizzazione del tessuto
- Assicurarsi che tutti i passaggi vengono eseguiti sul ghiaccio.
- Anestetizzare sei mosche maschi dello stesso ceppo, stessa età e ha sollevato la stessa dieta sul ghiaccio per facilitare la dissezione delle mosche (selvaggio-tipo w1118, 15 giorni di età, alimentati sul mezzo di farina di mais).
- Usando un bisturi e pinze a punta fine, sezionare le mosche (togliere le teste e addomi) per mantenere solo toraci contenente i muscoli di volo. Questo passaggio può essere fatto con l'occhio nudo. Gestire i toraci risultante con una pinza appuntita.
- Trasferire tre toraci dissecati in una capsula di Petri contenente 2 mL di soluzione di conservazione ghiacciata usando il forcipe di 25 mm.
- Con le pinze a punta fine, meccanicamente permeabilize toraci inserendo la punta della pinza toraci e ripetutamente lacerare il tessuto per ottenere una rete vagamente connessa.
- In una piastra a 24 pozzetti, riempire due pozzi con 12,5 µ l della soluzione di saponina e 1 mL di soluzione di conservazione per ottenere una concentrazione finale di 62,5 µ g/mL di saponina. Riempire i due pozzetti adiacenti con 1 mL di mezzo di respirazione.
- Con le pinze a punta fine, trasferire tre toraci permeabilized nella soluzione diluita saponina e incubare con lieve agitazione su un agitatore orbitale, il ghiaccio, per 20 min.
- Dopo l'incubazione di quest'ultima, è possibile trasferire le fibre nei pozzetti adiacenti riempiti con il mezzo di respirazione con lieve agitazione, sul ghiaccio, per 5 min lavare via la saponina.
4. la determinazione del peso secco
- Asciugare i toraci permeabilized su una superficie assorbente e flip 3 - 4 volte utilizzando le pinze a punta fine per assicurarsi che tutta l'umidità viene rimosso.
- Pesare i tre toraci insieme su una microbilancia. Si noti il peso ottenuto come verrà utilizzato per normalizzare i tassi di consumo di ossigeno mitocondriale.
- Trasferire i tessuti immediatamente in una goccia di mezzo di respirazione sul ghiaccio.
5. ossigeno consumo tariffe determinazione
- Aprire gli alloggiamenti del respirometro (rimuovere i tappi) e aggiungere 10 mM di piruvato e 2 mM di malate in ogni camera.
- Aggiungere i tessuti permeabilized direttamente nelle cavità riempita con il mezzo di respirazione.
- Sostituire i tappi utilizzando il distanziale.
- Con una siringa da 60 mL, raccogliere ossigeno direttamente da una bombola di ossigeno e iniettare 2-5 mL di ossigeno attraverso il capillare di tappo di ogni camera per assicurarsi che la diffusione dell'ossigeno attraverso il tessuto non limiterà il consumo di ossigeno.
- Inserire una siringa Hamilton il capillare di ogni tappo per assicurarsi che toraci rimangono nella camera.
- Chiudere completamente le camere quando la concentrazione di ossigeno è circa 400 nM, raggiungendo livelli di ossigeno sopra saturazione dell'aria (circa 160% saturazione dell'aria) all'interno delle camere.
- Arrestare e riavviare gli agitatori per controllare le bolle d'aria nelle camere.
- Immettere la massa di tessuto precedentemente pesato per normalizzare i tassi di respirazione di massa di tessuto (mg), visualizzazione consumo di ossigeno del Massachussets-specifico (pmol O2 consumed.s-1. mg-1 del tessuto).
- Una volta che il consumo di ossigeno è stabilizzato (traccia rossa), aggiungere 5 mM ADP con una siringa di Hamilton.
- Dopo ogni iniezione, sciacquare le siringhe con acqua distillata, etanolo al 70% e nuovamente di acqua distillata.
- Una volta che il consumo di ossigeno è di nuovo stabile, iniettare 5 µ l di una 4 mM del citocromo c.
- Procedere alle iniezioni sequenziale dei substrati seguenti per valutare il consumo di ossigeno mitocondriale in fasi diverse dell'ETS:
- Aggiungere 5 µ l di una prolina di 2 M.
- Aggiungere 10 µ l di un succinato di 1m.
- Aggiungere 30 µ l di un 1m glicerolo-3-fosfato.
- Iniettare il disaccoppiante FCCP in maniera titolazione a passi di 0,5-1 µM (2 µ l di una soluzione di 1 mM) fino a quando la concentrazione ottimale è raggiunta, cioè, la concentrazione per raggiungere il più alto consumo di ossigeno possibile senza inibizione (attenzione: vedere tabella di materiali).
- Iniettare i seguenti inibitori in sequenza per inibire completamente il flusso di elettroni nel sistema ETS al fine di misurare il consumo di ossigeno residuo (ROX) cioè non respiratori reazioni quali reazioni ossigenasi tra gli altri:
- Aggiungere 1 µ l di una rotenone di 1 mM (attenzione: vedere Tabella materiali).
- Aggiungere 5 µ l di una malonato di 2m (attenzione: vedere Tabella materiali).
- Aggiungere 1 µ l di una 5 mM antimycin A (attenzione: vedere Tabella materiali).
- Aggiungere ascorbato di 0,2 mM e 0,5 mM TMPD in sequenza negli alloggiamenti, iniziando con l'ascorbato per misurare il consumo di ossigeno di complesso IV.
- Aggiungere 20 mM di sodio azide per inibire il complesso IV (attenzione: vedere Tabella materiali).
- Una volta che il segnale è stabile, aprire gli alloggiamenti con il distanziale, ri-ossigenare gli alloggiamenti con l'iniezione di 2 mL di ossigeno puro e chiudere le camere quando la concentrazione è di circa 250-300 nmol.mL-1.
- Misurare il segnale per 10-15 min e calcolare lo sfondo chimico, vale a dire, il consumo di ossigeno a causa di autossidazione di TMPD.
6. pulizia del respirometro
- Dopo le misurazioni, sciacquare una volta gli alloggiamenti con acqua distillata e sciacquare gli alloggiamenti tre volte in etanolo al 70%.
- Incubare in etanolo assoluto per 10 min inattivare gli inibitori.
- Lavare tre volte con acqua distillata, riempire gli alloggiamenti con etanolo al 70% e sostituire i tappi e i tappi fino al prossimo utilizzo.
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Representative Results
Una traccia di rappresentante del consumo di ossigeno mitocondriale mediante il protocollo descritto sopra è fornita nella Figura 2. Il piruvato e malate iniettato nelle camere insieme con le fibre muscolari permeabilized si riferiscono alla respirazione CI-perdita, vale a dire, quando il complesso I di ETS è stimolato dal NADH prodotte attraverso l'ossidazione del piruvato e malate tramite il ciclo dell'acido tricarbossilico (CI). Durante questo tasso di respirazione, l'ossigeno mitocondriale è mantenuta principalmente per compensare la perdita del protone, cioè, protoni attraversando dallo spazio intermembrana alla matrice mitocondriale, quando trifosfato di adenosina synthase non è attivo (perdita)30. Quando viene aggiunto l'ADP, il trifosfato di adenosina synthase è attivato e gli elettroni sono trasferiti dal complesso I per il complesso IV con simultanea fosforilazione dell'ADP in ATP (CI-OXPHOS), con conseguente aumento del consumo di ossigeno mitocondriale. Il rapporto di accoppiamento OXPHOS è calcolato come perdita CI-CI-OXPHOS ed è di solito presa come un buon indicatore di qualità mitocondriale e di accoppiamento mitocondriale30. In Drosophila, questo rapporto deve superare almeno 6.0 (Figura 3). Se è inferiore a questo valore, potrebbe indicare un problema con la preparazione del tessuto o una disfunzione mitocondriale. L'aggiunta del citocromo c consente la determinazione dell'integrità della membrana mitocondriale esterna e pertanto viene utilizzato come un controllo di qualità della preparazione (Figura 4). Infatti, il citocromo c è vagamente associato alla membrana mitocondriale interna e viene lavato in genere se la membrana mitocondriale esterna è danneggiata durante il processo di permeabilizzazione. Di conseguenza, aggiunta esogena citocromo c aumenterà significativamente il consumo di ossigeno se la membrana mitocondriale esterna è danneggiata e l'endogeno citocromo c viene persa. Un aumento di meno di 10-15% nel consumo di ossigeno (Figura 4) illustra solitamente appropriato integrità della membrana mitocondriale esterna29. Nella Figura 3 e 4, le tracce di verde sono state ottenute da permeabilizzazione non adeguata e la manipolazione dei campioni (eccessivi lacerazione del tessuto per Figura 3e pesati dopo un tempo più lungo sulla superficie assorbente per Figura 4), considerando che le tracce rosse rappresentano campioni adeguatamente permeabilizzate e gestito. Questi risultati evidenziano che permeabilizzazione adeguate condizioni sono fondamentali per una valutazione affidabile del consumo di ossigeno mitocondriale.
I seguenti substrati utilizzati durante gli esperimenti forniscono elettroni ad l'ubiquinone e ha permesso di aumentare il flusso di elettroni in ETS. La prolina è un aminoacido che può essere utilizzato come substrato di energia in particolare insetti23, ma anche nei mammiferi durante l'inedia acuta o durante condizioni patologiche37. L'aggiunta della prolina in sezioni permette di valutare il contributo della deidrogenasi di prolina (ProDH) per il flusso di elettroni nel sistema ETS, quando gli elettroni scorrono da entrambi complesso I e ProDH e partecipano al processo di fosforilazione ossidativa (CI + ProDH-OXPHOS). Con aggiunta di succinato, il contributo del complesso II (succinato deidrogenasi) a ETS può essere osservato (CI + ProDH + CII-OXPHOS). Iniezione di glicerolo-3-fosfato (G3P), aumenta ulteriormente il consumo di ossigeno mitocondriale come questo substrato stimola il mitocondriale glicerolo-3-fosfato deidrogenasi (G3PDH) che è parte del glicerofosfato navetta e transfer elettroni a ETS (CI + ProDH + CII + G3PDH-OXPHOS). Sia ProDH e G3PDH hanno dimostrato di essere particolarmente attivi in parecchie specie di insetti e di conseguenza sono importanti in questo protocollo con Drosophila20,21,22,23,32 .
Quando si ottiene il disaccoppiante che FCCP viene aggiunto, la respirazione non accoppiati (stato di ETS), vale a dire, il consumo massimo di ossigeno che rappresenta la massima capacità del sistema ETS (CI + ProDH + CII + G3P-ETS). Il FCCP è un protonophore che trasporta i protoni dallo spazio intermembrana alla matrice mitocondriale senza passare attraverso il complesso V. Il FCCP deve essere titolato con attenzione, come le concentrazioni sotto risultato ottimale nel consumo di ossigeno non-maximal e tassi di respirazione non stabili mentre concentrazioni superiori risultato ottimale nell'inibizione del consumo di ossigeno mitocondriale (Figura 5). Una volta aggiunti i substrati e il disaccoppiatore, inibizione dei complessi che i, II e III possiamo essere in sequenza eseguito con il rotenone, malonato antimycin A, rispettivamente. Con ogni inibitore utilizzato, si osserva una diminuzione nel consumo di ossigeno mitocondriale, fino a raggiungere il più basso consumo di ossigeno dopo l'aggiunta di antimycin A. Il tasso ha raggiunto dopo l'aggiunta di tutti gli inibitori è il consumo di ossigeno residuo30. Rappresenta il consumo di ossigeno dovuto le reazioni ossidative non mitocondriale quali reazioni ossigenasi e produzione di specie reattive ad esempio, ed è pertanto da sottrarre da tutte le altre tariffe misurato.
TMPD è un trasportatore di elettrone artificiale che fornisce gli elettroni direttamente al complesso IV, bypassando tutti i complessi a Monte, che permette la misurazione della capacità massima respirazione IV complessa. Questo substrato è tuttavia soggetta a autossidazione, così l'ascorbato deve essere aggiunto priore ai TMPD di limitare, ma non completamente evitare questo autossidazione. Per correggere l'autossidazione rimanente di TMPD, l'azoturo di sodio inibitore complesso IV viene aggiunto alle camere e il consumo di ossigeno viene poi registrato per 10-15 minuti. Questo consumo di ossigeno rappresenta pertanto la priorità bassa di chimica, o in altre parole l'autossidazione di TMPD che dovrebbero essere presi in considerazione per il calcolo della capacità di respirazione massima complesso IV.
Figura 1 . Rappresentazione schematica di trasporto mitocondriale dell'elettrone dal sistema di trasporto degli elettroni e fosforilazione ossidativa nella membrana interna mitocondriale. I: complesso I; II: complesso II; III: complesso III; IV: complesso IV; V: trifosfato di adenosina synthase; Acetil-CoA: Acetil coenzima A; Cyt c: citocromo c; e–: elettrone; G3P: glicerolo-3-fosfato; G3PDH: deidrogenasi di glycerol-3-fosfato mitocondriale; H+: protone; PRODH: deidrogenasi di prolina; TCA: ciclo dell'acido tricarbossilico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Tracce rappresentative della concentrazione di ossigeno mitocondriale (traccia blu) e consumo (traccia rossa) su permeabilized toraci di Drosophila. Ogni iniezione è rappresentato con una freccia che indica il composto iniettato (Pyr: piruvato; mal: malate; ADP; Cyt c: citocromo c; Pro: prolina; Succ: succinato; G3P: glicerolo-3-fosfato; FCCP: Carbonil cianuro 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone; Rot: rotenone; Malo: malonato; Formica r: antimycin A; TMPD: N, N, n' ', N, - tetrametil - p-fenilendiammina; ASC: ascorbato; SAZ: azoturo di sodio). Ogni tasso di consumo di ossigeno mitocondriale è indicata nel grafico, quando il consumo di ossigeno (linea rossa) è stato stabilizzato. C l'effetto del citocromo denota l'integrità della membrana mitocondriale esterna (Vedi testo per maggiori dettagli). Consumo di ossigeno residuo rappresenta il consumo di ossigeno a causa di reazioni secondarie ossidativo nelle cellule e deve essere sottratto a tutte le altre tariffe misurate. Priorità bassa chimica denota il consumo di ossigeno solo a causa di autossidazione di TMPD e deve essere presa in considerazione per il calcolo della capacità massima respirazione IV complesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Tracce rappresentative di una valida (traccia rossa, camera a) e inadeguata (traccia verde, camera B) risposte all'aggiunta di ADP. La traccia rossa corrisponde alla camera A e la traccia verde corrisponde alla sezione B, durante lo stesso esperimento. La traccia rossa è stata ottenuta da toraci adeguatamente permeabilizzate mentre la traccia verde è stata ottenuta dopo eccessivamente lacerazione dei tessuti durante la permeabilizzazione. Quando viene aggiunto l'ADP, si prevede un aumento del consumo di ossigeno, come la traccia di rossa. OXPHOS rapporti di accoppiamento sono calcolati come perdita CI-CI-OXPHOS e vengono presentati nel grafico. Un rapporto di meno di 6.0 in Drosophila suggerisce un problema nell'accoppiamento mitocondriale ed è caratteristica di degradazione di campione o di disfunzione mitocondriale rappresentato dalla traccia verde. Pyr: piruvato; mal: malate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Tracce rappresentative di una valida (traccia rossa, camera a) e inadeguata (traccia verde, camera B) risposta all'aggiunta di citocromo c. La traccia rossa corrisponde alla camera A e la traccia verde corrisponde alla sezione B, durante lo stesso esperimento. Traccia rossa è stata ottenuta da toraci adeguatamente permeabilizzate e gestito, mentre la traccia verde è stata ottenuta dopo toraci volutamente sono stati essiccati per un tempo più lungo sulla superficie assorbente prima della pesatura. Citocromo c non aumenta solitamente il consumo di ossigeno mitocondriale, come si è visto sulla traccia rossa, che indica che la membrana mitocondriale esterna è intatta. Se, tuttavia, aggiunta di esogeno citocromo c aumenta significativamente il consumo di ossigeno mitocondriale di più del 15%, come si è visto sulla traccia verde, suggerisce che la membrana mitocondriale esterna è danneggiata e quindi che il campione è degradato e dovrebbe essere scartato. Pyr: piruvato; mal: malate; Cyt c: citocromo c. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Tracce rappresentative della concentrazione di ossigeno mitocondriale (traccia blu) e consumo (traccia rossa) dopo titolazione del FCCP. Diverse iniezioni di FCCP alle diverse concentrazioni devono essere eseguite con attenzione per determinare il consumo di ossigeno massimo innescato da questo disaccoppiatore. Le concentrazioni insufficienti non consentono la valutazione del massimo consumo di ossigeno e sono caratterizzate da tassi di respirazione non stabili, mentre FCCP in eccesso inibisce il consumo di ossigeno mitocondriale. Le frecce indicano le diverse iniezioni di FCCP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Prezzo della riproducibilità del consumo di ossigeno mitocondriale durante un tipico esperimento ottenuto utilizzando le due camere diverse (traccia rossa, camera a; traccia verde, camera B) di un respirometro. La traccia rossa corrisponde alla camera A e la traccia verde corrisponde alla sezione B, durante lo stesso esperimento utilizzando drosofila dalla stessa età, sesso, colare e sollevato la stessa dieta, nonché il protocollo descritto. Entrambi i campioni sono stati normalizzati con la massa di tessuto asciutto pesato come descritto nel protocollo (0,53 e 0,66 mg per sezioni A e B, rispettivamente). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, è descritto un metodo per la preparazione del campione prima le misure del consumo di ossigeno mitocondriale in drosofila. Questo metodo è stato sviluppato per risolvere diversi problemi relazionati ai protocolli utilizzando isolamenti mitocondriali, in particolare in termini di durata e numero di esemplari richiesto. Invece di lavorare con isolamenti mitocondriali solitamente che richiedono grandi quantità di tessuti ottenuti da individui diversi, questo esperimento viene eseguito sulle fibre muscolari permeabilized da toraci di qualche drosofila. In questo protocollo, solo tre individui sono necessari per visualizzare risultati ottimali. Pertanto, la misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale in vari momenti è possibile, come è più realizzabile per sincronizzare un gruppo più piccolo di mosche avendo la stessa età e dello stesso sesso.
In primo luogo, è importante utilizzare Drosophila della stessa età, sesso, ceppo e cresciuto nelle stesse condizioni di ottenere bassa variabilità nei risultati (Figura 6), come respirazione può cambiare con l'età, il sesso, il genotipo e la dieta delle mosche. La fase più critica nell'esecuzione del presente protocollo è la procedura di permeabilizzazione della toraci. È molto importante procedere rapidamente per evitare la degradazione del tessuto, ed è anche importante assicurarsi che i toraci sono ben permeabilizzate per avere i tassi massimi di consumo di ossigeno. Per garantire che la permeabilizzazione è stata eseguita correttamente e che l'integrità strutturale e funzionale dei mitocondri sono conservati dopo il permeabilization, OXPHOS accoppiamento ratio (perdita CI-CI-OXPHOS, Figura 3), nonché la risposta di citocromo c (Figura 4) sono utilizzati come controlli di qualità. C'è un compromesso di prendere in considerazione tra lavorando rapidamente e assicurandosi che la permeabilizzazione è ben eseguita. È anche fondamentale di lavorare sempre su ghiaccio quando si manipolano i toraci dissecate. Per ottenere i risultati più riproducibili (Figura 6), è necessario permeabilizzazione omogenea e praticando la tecnica per la permeabilizzazione aiuta a fare in modo che si ripetono gli stessi movimenti. Un altro passaggio fondamentale è la determinazione del peso secco del campione. Infatti, dopo che vengono incubate toraci, sono molto sensibile, fragile e soggetto a degradazione. Pertanto, analogamente per la permeabilizzazione, rapidamente procedendo alla determinazione del peso a secco è importante. D'altra parte, è importante determinare il peso con precisione, come i risultati sono normalizzati per la massa del tessuto. La quantità di toraci utilizzato può anche essere ottimizzata. Il protocollo può essere adattato per l'utilizzo di un singolo torace per camera35, ma un certo livello di risoluzione potrebbe essere perso nella misurazione del consumo di ossigeno per quanto nella determinazione del peso secco. La quantità di toraci può essere aumentata se necessario, ma è importante notare che i più mitocondri nel campione, più alto il consumo di ossigeno e gli alloggiamenti dovranno pertanto essere riossigenato. La riossigenazione può essere fatto aprendo gli alloggiamenti e inietti l'ossigeno, ma aumenterà la probabilità di introdurre bolle d'aria nella camera. Pertanto, se possibile, provare a evitare di dover riossigenare le camere (tranne quando complesse capacità di respirazione massima IV deve essere determinato). Prima di eseguire gli esperimenti, ottimizzazione delle concentrazioni di substrato è anche necessaria per raggiungere il più alto consumo di ossigeno mitocondriale senza osservare effetti inibitori a causa di un'eccessiva concentrazione. Gli alloggiamenti del respirometro hanno anche essere accuratamente pulito al fine di evitare potenziali contaminazioni. È importante avviare la pulizia con acqua distillata e poi con etanolo al 70% per sbarazzarsi di potenziali contaminazioni biologiche. A seguito di questo, un'incubazione in etanolo assoluto per 10 min è consigliato per evitare la contaminazione degli inibitori idrofobi. Infine, gli alloggiamenti con acqua distillata di risciacquo e riempimento con etanolo al 70% eviterà potenziali contaminazioni fino all'utilizzo successivo.
Il protocollo può essere facilmente modificato per studiare l'effetto di altri substrati o inibitori differenti. Ad esempio, una proteina interessante per studiare è l'elemento portante mitocondriale del piruvato (MPC). Il ruolo di questa proteina è di trasportare il piruvato generato nel citosol nella matrice mitocondriale. Recentemente, è stato suggerito per svolgere un ruolo importante nella modulazione del metabolismo durante condizioni patologiche come ad esempio durante il tipo 2 diabete38. Per studiare l'effetto della proteina MPC il metabolismo mitocondriale, è utile iniziare le iniezioni con piruvato solo che invece di piruvato e malato allo stesso tempo. Così, l'effetto del piruvato è studiato in modo indipendente dall'effetto di malate, come quest'ultimo viene iniettato per solo sostenere il ciclo dell'acido tricarbossilico e garantire che intermedi non sono esaurite. È anche possibile utilizzare inibitori di MPC39 per valutare se una limitazione di questo trasportatore, piuttosto che l'ossidazione del piruvato è osservato. Quindi, sarebbe possibile osservare un potenziale cambiamento della fonte combustibile preferito per respirazione40. È anche possibile omettere alcuni substrati per semplificare il protocollo se non è rilevante per lo studio. Ad esempio, per studiare una disfunzione del complesso ho solo, esso non è necessario utilizzare tutti i sottofondi presentati nel presente protocollo.
Questo protocollo presenta alcune limitazioni che deviare da condizioni in vivo . Le misure del consumo di ossigeno mitocondriale sono registrate quando il mezzo di respirazione è sopra saturazione dell'aria, come ossigeno puro viene iniettato per evitare la limitazione della diffusione dell'ossigeno all'interno del tessuto30. Inoltre, le concentrazioni di substrati vengono iniettate in eccesso, che non riflettono le condizioni in vivo . È anche importante notare che l'età, sesso, ceppo e dieta di Drosophila possono influenzare i risultati. Questi parametri sono quindi da tenere in considerazione quando si interpretano i risultati. Questo metodo è tuttavia più vicino al fisiologico condizioni rispetto a metodi utilizzando isolamenti mitocondriali per misurare il consumo di ossigeno mitocondriale, come le interazioni con le altre componenti cellulari e l'integrità strutturale dei mitocondri e morfologia sono conservati31. È importante notare che gli isolamenti mitocondriali sono più vantaggiosi quando ulteriori parametri come produzione di ROS o efficienza mitocondriale (P/O rapporto) devono essere misurati27.
Questo metodo può essere utilizzato per raggiungere obiettivi diversi, che vanno dalla comprensione delle disfunzioni mitocondriali e i meccanismi di fondo delle malattie metaboliche, per testare gli effetti di diversi composti su funzioni mitocondriali sotto patologico condizioni. Inoltre, può essere utilizzato per osservare gli effetti di diversi stress ambientali sul metabolismo mitocondriale, quali i cambiamenti nella dieta o temperatura. Ad esempio, è possibile studiare l'efficacia di molecole bioattive sintetiche sulle funzioni mitocondriali e nel trattamento delle disfunzioni mitocondriali. Questo metodo è anche un ottimo strumento per studiare le funzioni mitocondriali in diversi momenti, che lo rende molto pertinenti per lo studio dei meccanismi fondamentali legate al processo di invecchiamento. La valutazione del metabolismo mitocondriale attraverso il consumo di ossigeno utilizzando permeabilized toraci sarà certamente di aiuto per migliorare la nostra conoscenza circa il ruolo del metabolismo mitocondriale quando la cella è esposta a condizioni difficili.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dalla Nazionale Scienze e ingegneria Research Council (NSERC, scoperta grant) e Université de Moncton NP. LHB desidera ringraziare i finanziamenti a sostegno dell'Istituto canadese della Université de Moncton, Nuovo Brunswick Innovation Foundation (NBIF) e Health Research (CIHR). Il lavoro di EHC è supportato dall'Alzheimer Society of Canada, Canada di cervello, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, New Brunswick Health Research Foundation e Université de Moncton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
| Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
| Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
| Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
| Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
| MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
| Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
| BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
| Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
| Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
| sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
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