מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.
Microenvironments הסלולר להכיל מגוון של רמזים, כגון גורמי גדילה, מטריצה חוץ-תאית, אינטראקציות המערכת. רמזים אלה הם מתוזמר היטב, חיוניות בוויסות תא פונקציות במערכת חיה. למרות מספר חוקרים ניסו לחקור את הקשר בין גורמים סביבתיים לבין הרצוי תאיים, הרבה נותר עלום. זאת במידה רבה בשל חוסר במתודולוגיה נכונה לחקות כזה רמזים סביבתיים במבחנה, ולבדוק במקביל רמזים סביבתיים שונים על תאי. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמה משולבת של ערוצי microfluidic, מערך nanofiber, ואחריו ניתוח מתא בודד גבוה-תוכן, לבחון את תאי הגזע פנוטיפים ששונו על ידי גורמים סביבתיים ברורים. כדי להדגים את היישום של הפלטפורמה, מחקר זה מתמקד הפנוטיפים של עצמי חידוש תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). כאן, אנו מציגים את הליכי הכנת מערך nanofiber ומבנה microfluidic הזיוף של מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME). יתר על כן, מתוארים השלבים הכוללת של פרופילים, תא מכתים עם מספר סמני פלורסנט, הדמיה פלורסצנטיות מרובות ניתוחים סטטיסטיים, תא בודד.
Pluripotent האנושי תאי גזע (hPSCs)1,2 עצמית לחדש unlimitedly ו להתמיין שושלות רקמות שונות, אשר יכול לחולל מהפכה פיתוח תרופות, טיפולים מבוססי תאים, הנדסת רקמות, רפואה רגנרטיבית 3 , 4 , 5 , 6. מאכלים תרבות כללית, לוחות microtiter, עם זאת, לא נועדו לאפשר מניפולציה תא הפיסיקליות והכימיות מדויק ברמה התאית עם מגוון של ננו – כדי מיקרו-מטר, הוא גורם קריטי עבור הרחבת הסלולר, התחדשות עצמית, בידול. כדי לטפל חיסרון זה, מחקרים חקרו את התפקידים של microenvironments הסלולר בוויסות-גורל החלטות ותא פונקציות4. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים נערכו לשחזר microenvironments הסלולר במבחנה7,8. תהליכי ייצור ננו מיקרו הקמנו אלה microenvironments באמצעות המניפולציה של כימי9,10,11,12,13, 14,15,16,17 ו הפיזי18,19,20 רמזים סביבתיים. עד עכשיו, היו דיווחים לחקור באופן שיטתי את המנגנון הבסיסי של רמזים סביבתיים הכימי והפיזי על החלטות גורל והפונקציות פלטפורמה אחת.
כאן, אנחנו מציגים אסטרטגיה המבוססת על עקרונות עיצוב פשוט להקים פלטפורמה הקרנה חזקה (איור 1). ראשית, אנו מתארים את ההליך בפיתוח של פלטפורמה משולבת ליצירת microenvironments הסלולר רב-תכליתי, מלאכותי באמצעות מערך nanofiber ומבנה microfluidic: מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) (איור 1א’ ו- 2A). המערך nanofiber יש 12 microenvironments שונות שילובים שונים של חומרים nanofiber וצפיפות. Electrospinning שימשה לפברק nanofibers. החומרים nanofiber, כגון פוליסטירן (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22לטין (GT)23, נועדו לבחון את התכונות הכימיות שלהם, דבר שעשוי להשפיע על התא אדהזיה ותחזוקה של pluripotency ( איור 2B). צפיפות Nanofiber היו מגוונות על-ידי שינוי זמן electrospinning, nanofibers שנוצר הוגדרו לפי צפיפות שלהם (החמורה, עם D = XLow/נמוך/בינוני/גבוה). המבנה microfluidic מורכב polydimethylsiloxane (PDMS) מחסה-48 לשכות תרבית תאים, אשר יכולים להיות ממוקם לאורך הממדים סטנדרטי של microplate 96-ובכן. PDMS הוא פולימר מסתיימים, גז-להחלפה משמש בדרך כלל כדי לפברק התקנים microfluidic24. כל ערוץ microfluidic תוכננה להיות 700-מיקרומטר רחב ו- 8.4 מ מ ארוך והיו שני פתחי הכניסה-הקצוות שלה (טבלה 1). התאים היו בגבהים שונים (250, 500, 1000 מיקרומטר) לטיפול הראשוני זורעות תא הצפיפויות 0.3, 0.6 ו 1.2 × 105 תאים/cm, (2) אשר עשוי לתאם עם הישרדות, התפשטות, הבידול של hPSCs25 (איור 2C). מספר התאים נזרע לתא ביחס לצפיפות העמודה מעל הרצפה קאמרית, ובכך התא הראשוני זריעה צפיפות נשלטה על ידי החדרת התליה תא אותו לתוך התרבות תאי בגבהים שונים. כל הערוצים נועדו להיות ≥ 250-מיקרומטר-גבוהה26 כדי למזער את ההשפעות של חמצן נמוך מתח27 ו גזירה28 על התאים. ערוץ לגבהים של 250, 500 ו- 1000 מיקרומטר הם מקוצר כאן כמו XCD עם X = נמוך, בינוני, ו גבוה, בהתאמה. הסביבות עם צפיפויות שונות nanofiber וצפיפות זורעות תא הראשונית קוצרו כמו “צפיפות density_Cell Material_NF” (למשל, GT_HighNF_HighCD: סביבה מאופיין בצפיפות גבוהה nanofibers GT ו גבוהה הראשונית תא זורעות צפיפות).
כתוצאה מכך, אנו נתאר כיצד לבצע ניתוח מתא בודד לחקור באופן שיטתי בהתנהגות התא בתגובה גורמים סביבתיים (איור 1B). כמושג הוכחה-של-, זיהינו את הסביבה התאית אופטימלית עבור hPSC העצמי-חידוש, אשר היא פונקציה מפתח עבור hPSC תחזוקה (איור 1B)29. Cytometry מבוססת תמונה, ואחריו ניתוחים סטטיסטיים, מאפשר פרשנות כמותית של תגובות פנוטיפי הסלולר הפרט סביבות הסלולר. בין מגוון רחב של פונקציות הסלולר, מאמר זה מספק הליך מפורט כדי לזהות את התנאים אופטימאליים לשמירה על התחדשות עצמית hPSC.
פרוטוקול זה מדגים את השיטה ההקרנה הראשונה להקים מערכת תרבות חזקים לשמירה של hPSCs מוסמך. ראשית, אנחנו תיאר כיצד להכין פלטפורמה שמציעות מגוונות ECMs מלאכותיים ותא זריעה צפיפויות באמצעות מכשיר microfluidic משולב עם מערך nanofiber, המערך MACME. שנית, כמותי המבוסס על תמונות תא בודד phenotyping היה שבוצעו50<…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים פרופסור ש Nakatsuji-iCeMS, אוניברסיטת קיוטו, על מתן ES תאים אנושיים. אנו מודים גם פרופסור א מרוימה טוקיו במכון הטכנולוגי התמיכה שלו בשימוש של מיקרוסקופ כוח אטומי. מימון בנדיבות סופק על ידי החברה יפן הקידום של המדע (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006, 24656502); מימון נמסר גם האנרגיה החדשה, ארגון פיתוח טכנולוגיה תעשייתית (NEDO) ושל קרן מדעי החיים Terumo. WPI-iCeMS נתמך על ידי את העולם Premier הבינלאומי מחקר במרכז היוזמה (WPI), משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן. חלק של עבודה זו נתמכה על ידי רכזת ננוטכנולוגיה באוניברסיטת קיוטו, במתקן ננו-עיבוד AIST “ננוטכנולוגיה פלטפורמה פרויקט” בחסות MEXT, יפן.
Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
High-voltage power supply | TechDempaz | ||
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |