Fabrikasjon av en multiplex kunstig mobilnettet MicroEnvironment matrise
Summary
Denne artikkelen beskriver detaljert metodikk for å forberede en multiplekset kunstig Cellular MicroEnvironment (MACME)-matrise for høy gjennomstrømming manipulering av fysiske og kjemiske pekepinner mimicking i vivo mobilnettet microenvironments og til identifisere optimal mobilnettet miljø for menneskelig pluripotent stamceller (hPSCs) med encellede profilering.
Abstract
Mobilnettet microenvironments består av en rekke signaler, som vekstfaktorer, ekstracellulære matriser og intercellulære interaksjoner. Disse pekepinner er godt organisert og er avgjørende i å regulere celle funksjoner i en levende system. Selv om mange forskere har forsøkt å undersøke sammenhengen mellom miljøfaktorer og ønsket cellulære funksjoner, fortsatt mye ukjent. Dette er hovedsakelig på grunn av mangel på en riktig metode for å etterligne slike miljømessige signaler i vitro, og samtidig teste ulike miljømessige signaler på celler. Her rapporterer vi et integrert plattform microfluidic kanaler og en nanofiber matrise, etterfulgt av høyt innhold én celle analyse, undersøke stamcelleforskningen fenotyper endres av forskjellige miljøfaktorer. For å demonstrere anvendelsen av denne plattformen, fokuserer denne studien på av fenotyper av selvtillit fornyelse menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs). Her presenterer vi forberedelse prosedyrene for et nanofiber utvalg og microfluidic strukturen i produksjon av en multiplekset kunstig Cellular MicroEnvironment (MACME)-matrise. Videre, samlet av encellede profilering, celle farging med flere fluorescerende markører, flere fluorescens imaging og statistiske analyser, fremgangsmåtene.
Introduction
Menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs)1,2 selvstendig fornye unlimitedly og skille ut forskjellige vev linjene, som kan revolusjonere narkotika utvikling, celle-basert behandling, vevet engineering og regenerativ medisin 3 , 4 , 5 , 6. generell kultur retter og være ferdig innen plater, men er ikke utformet slik at presis fysiske og kjemiske celle manipulasjon på cellenivå med et utvalg av nano – til mikro-meter, som er en kritisk faktor for mobilnettet ekspansjon, selvtillit fornyelse, og differensiering. For å løse denne ulempen, har studier undersøkt rollene til mobilnettet microenvironments i å regulere celle skjebne beslutninger og celle funksjoner4. De siste årene, har et økende antall studier vært gjennomført for å rekonstruere mobilnettet microenvironments i vitro7,8. Nano – og mikro-metallbearbeiding prosesser har etablert disse microenvironments gjennom manipulering av kjemiske9,10,11,12,13, 14,15,16,17 og fysiske18,19,20 miljømessige signaler. Inntil nå er det ikke systematisk undersøke de underliggende mekanismene av kjemiske og fysiske miljømessige signaler på cellen skjebne beslutninger og funksjoner i en enkelt plattform.
Her introduserer vi en strategi basert på enkel designprinsipper å etablere en robust screening plattform (figur 1). Først vi beskrive utviklingen prosedyren av en integrert plattform for å lage allsidig, kunstige mobilnettet microenvironments ved hjelp av en nanofiber-matrise og en microfluidic struktur: The multiplekset kunstig Cellular MicroEnvironment (MACME) matrise (Figur 1A og 2A). Nanofiber matrisen har 12 ulike microenvironments med ulike kombinasjoner av nanofiber materialer og tettheter. Electrospinning ble brukt til å dikte opp nanofibers. Nanofiber materialer, som polystyren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22og gelatin (GT)23, ble utviklet for å teste deres kjemiske egenskaper som kan påvirke celleadhesjon og vedlikehold av pluripotency ( Figur 2B). Nanofiber tettheter var varieres med electrospinning gang og de genererte nanofibers ble definert etter deres tettheter (BRUTT, med D = XLow/lav/Mid/høy). Microfluidic strukturen består av polydimethylsiloxane (PDMS) skjuler 48 celle-kultur chambers, som kan plasseres i standard dimensjoner i 96-brønnen microplate. PDMS er en biokompatible og gass-utskiftbare polymer som vanligvis brukes til å dikte microfluidic enheter24. Hver mikrovæskekanalen laget som 700-µm bred og 8.4 mm lang og hadde to innganger i kantene (tabell 1). Chambers hadde ulike høyder (250 500 og 1000 µm) å manipulere de første cellen-såing tettheter (0,3 og 0,6 1.2 × 105 celler/cm2), som kan relatere til overlevelse, spredning og differensiering av hPSCs25 (Figur 2C). Antall celler seeded i et kammer er proporsjonal med kolonnen tetthet over kammeret gulvet, og dermed første celle seeding tetthet ble kontrollert ved å innføre samme celle suspensjon i kultur kamre med ulike høyder. Alle kanaler var ment å være ≥ 250 µm høy26 å redusere effekten av lav oksygen spenning27 og skjæring stress28 på cellene. Kanal høyder av 250 500 og 1000 µm er forkortet her som XCD x = lav, Mid, og høy, henholdsvis. Miljøer med forskjellige nanofiber tettheter og første celle-såing tettheter var forkortet som “Material_NF density_Cell tetthet” (f.eks GT_HighNF_HighCD: et miljø preget av høy tetthet GT nanofibers og høy første celle-såing tetthet).
Deretter beskriver vi hvordan å utføre encellede analyser systematisk undersøke celle atferd svar for miljøfaktorer (figur 1B). Som en proof-of-concept identifisert vi det optimale mobilnettet miljøet for hPSC selv-fornyelse, som er en viktig funksjon hPSC vedlikehold (figur 1B)29. Image-basert cytometri, etterfulgt av statistiske analyser, gir kvantitative tolkning av individuelle mobilnettet fenotypiske svar på cellular miljøer. Blant en rekke cellulære funksjoner gir dette dokumentet en detaljert prosedyre for å identifisere de optimale forholdene for å opprettholde hPSC selvtillit fornyelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen viser den første screening metoden å etablere et robust kultur system for vedlikehold av kvalifiserte hPSCs. Først beskrev vi hvordan forberede en plattform med mangfoldig kunstig ECMs og celle seeding tettheter ved hjelp av en microfluidic enhet integrert med et nanofiber utvalg, MACME array. Andre, kvantitativ bildebasert encellede phenotyping var utført50 å vurdere personlige mobilnettet resultater og atferd endres av forskjellige biokjemiske og Biofysiske funksjoner. I d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke Prof N. Nakatsuji iCeMS, Kyoto University, for å gi human ES celler. Vi takker også Prof A. Maruyama ved Tokyo Institute of Technology for sin støtte i bruk av atomic force mikroskopet. Midler ble sjenerøst gitt av Japan Society for fremme av vitenskap (JSP, 22350104, 23681028, 25886006 og 24656502); midler ble også gitt av ny energi og industriell teknologi utvikling organisasjon (NEDO) og Terumo Life Science Foundation. WPI-iCeMS støttes av World Premier International Research Centre initiativ (WPI), utdannings, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT), Japan. En del av dette arbeidet ble støttet av Kyoto University nanoteknologi Hub og AIST Nano behandling anlegget i “Nanoteknologi plattform Project” sponset av MEXT, Japan.
Materials
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
