Tillverkning av en multiplexade konstgjorda cellulära mikromiljö Array
Summary
Denna artikel beskriver den detaljerna metoden för att förbereda en multiplex konstgjorda cellulära närmiljön (MACME)-matris för hög genomströmning manipulation av fysikaliska och kemiska signaler symtom liknande i vivo cellulära mikromiljö och till identifiera den optimala cellulära miljön för mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) med encelliga profilering.
Abstract
Cellulära mikromiljö består av en mängd olika tecken, till exempel tillväxtfaktorer, extracellulära matriser och intercellulära interaktioner. Dessa signaler är väl iscensatt och är avgörande för att reglera cellfunktioner i ett levande system. Även om ett antal forskare har försökt att undersöka sambandet mellan miljöfaktorer och önskad cellulära funktioner, förblir mycket okänd. Detta beror till stor del på bristen på en lämplig metod att efterlikna sådana miljömässiga ledtrådar i vitrooch samtidigt testa olika miljömässiga ledtrådar på celler. Vi rapporterar här, en integrerad plattform av mikrofabricerade kanaler och en nanofiber array, följt av hög-encelliga innehållsanalys, att undersöka stamceller fenotyper ändras av olika miljöfaktorer. För att demonstrera tillämpning av denna plattform, fokuserar denna studie på fenotyperna själv förnya mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs). Här presenterar vi förberedelse förfarandena för en nanofiber array och mikroflödessystem strukturen vid tillverkning av en multiplex konstgjorda cellulära närmiljön (MACME)-matris. Dessutom beskrivs övergripande steg av de encelliga profilering, cell färgning med flera fluorescerande markörer, flera fluorescens imaging och statistiska analyser.
Introduction
Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs)1,2 själv förnya obegränsat och differentieras till olika vävnad härstamningar, som kan revolutionera läkemedelsutveckling, cellbaserade terapier, vävnadsteknik och regenerativ medicin 3 , 4 , 5 , 6. allmänna kulturen rätter och mikrotiter plattor, dock är inte utformade att möjliggöra exakta fysiska och kemiska cell manipulation på cellnivå med utbud av nano – till mikro-meter, som är en kritisk faktor för cellulära expansion, självförnyelse och differentiering. För att lösa denna nackdel, har studier undersökt av cellulära mikromiljö reglera cell-öde beslut och cell funktioner4roller. Under de senaste åren har ett ökande antal studier genomförts för att rekonstruera cellulära mikromiljö in vitro7,8. Nano – och micro-tillverkning processer har upprättat dessa mikromiljö genom manipulering av kemiska9,10,11,12,13, 14,15,16,17 och fysiska18,19,20 miljömässiga ledtrådar. Tills nu fanns det inga rapporter att systematiskt undersöka de bakomliggande mekanismerna av kemiska och fysiska miljön ledtrådar på cell-öde beslut och funktioner inom en enda plattform.
Här, införa vi en strategi som bygger på enkel designprinciper för att upprätta en robust screening plattform (figur 1). Först beskriver vi proceduren utveckling av en integrerad plattform för att skapa mångsidiga, konstgjorda cellulära mikromiljö med hjälp av en nanofiber-matris och en mikroflödessystem struktur: The Multiplexed konstgjorda cellulära närmiljön (MACME) array (Figur 1A och 2A). Nanofiber matrisen har 12 olika mikromiljö i varierande kombinationer av nanofiber material och densiteter. Electrospinning användes för att fabricera nanofibrer. Nanofiber material, såsom polystyren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22och gelatin (GT)23, utformades för att testa sina kemiska egenskaper, vilket kan påverka celladhesion och underhåll av pluripotency ( Figur 2B). Nanofiber tätheter varierades genom att ändra electrospinning tid och de genererade nanofibrer definierades enligt deras densiteter (DNF, med D = XLow/låg/mellan/hög). Mikroflödessystem strukturen består av Polydimetylsiloxan (PDMS) härbärgerat 48 cellkultur kammare, som kan placeras längs 96 brunnar mikroplattan standard dimensioner. PDMS är ett biokompatibelt och gas-utbytbara polymer som allmänt används för att tillverka mikroflödessystem enheter24. Varje mikroflödessystem kanal var avsedd att vara 700 µm breda och 8,4-mm lång och hade två vikar vid kanterna (tabell 1). Kamrarna hade olika höjder (250, 500 och 1000 µm) att manipulera den initiala cell-sådd tätheter (0,3 0,6 och 1,2 × 105 celler/cm2), som kan korrelera med överlevnad, proliferation och differentiering av hPSCs25 (Figur 2C). Antalet celler som seedade in i en kammare är proportionell till kolumn tätheten över kammaren golvet och därmed första cellen sådd densitet kontrollerades genom att införa samma cellsuspensionen i kultur avdelningar med olika höjder. Alla kanaler utformades för att vara ≥ 250-µm hög26 att minimera effekterna av låg-syre spänning27 och skjuvspänning28 på cellerna. Kanal höjder av 250, 500 och 1000 µm är förkortade här som XCD med X = Low, Mid, High, respektive. Miljöerna med distinkta nanofiber tätheter och inledande cell-sådd densiteter förkortades som ”Material_NF density_Cell täthet” (t.ex. GT_HighNF_HighCD: en miljö som kännetecknas av hög densitet GT nanofibrer och hög initial cell-sådd densitet).
Därefter beskriver vi hur du utför encelliga analyser för att systematiskt undersöka cell beteende som svar på miljöfaktorer (figur 1B). Som ett proof-of-concept identifierat vi den optimala cellulära miljön för hPSC självförnyelse, vilket är en nyckelfunktion för hPSC underhåll (figur 1B)29. Image-baserad flödescytometri, följt av statistiska analyser, möjliggör kvantitativ tolkning av enskilda cellulära fenotypiska svar till cellulära miljöer. Bland en mängd olika cellulära funktioner ger detta dokument en detaljerad för att identifiera de optimala förutsättningarna för att upprätthålla hPSC självförnyelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll visar den första screeningmetoden för att upprätta ett robust kultur system för underhåll av kvalificerad hPSCs. Först beskrev vi hur man förbereder en plattform med olika konstgjorda ECMs och cell sådd densiteter med hjälp av en mikroflödessystem-enhet som är integrerad med en nanofiber array, MACME matrisen. Andra, kvantitativa bildbaserade encelliga fenotypning var utfört50 att utvärdera enskilda cellulära resultat och beteenden förändras genom olika biokemiska o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Prof. N. Nakatsuji på iCeMS, Kyoto University, för att ge mänskliga ES-celler. Vi tackar också Prof. A. Maruyama vid Tokyo Institute of Technology för hans stöd i användningen av mikroskopet atomic force. Generöst finansieringen tillhandahölls av Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 och 24656502); finansiering tillhandahålls var också av den nya energin och Industrial Technology Development Organization (NEDO) och Terumo Life Science Foundation. Den WPI-iCeMS stöds av världen Premier International Research Centre initiativ (WPI), ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT), Japan. En del av detta arbete stöds av Kyoto universitet nanoteknik Hub och AIST Nano-Processing Facility i ”nanoteknik plattform-projekt” som sponsras av MEXT, Japan.
Materials
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
