توضح هذه المقالة منهجية مفصلة لإعداد مجموعة متعدد المكروية خلوية اصطناعية (ماكمي) عن التلاعب الفائق الفيزيائية والكيميائية العظة محاكاة في فيفو ميكرونفيرونمينتس الخلوية وإلى تحديد البيئة المثلى الخلوية للخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) مع خلية واحدة التنميط.
ميكرونفيرونمينتس الخلوية تتكون من مجموعة متنوعة من الرموز، مثل عوامل النمو ومصفوفات خارج الخلية والتفاعلات بين الخلايا. هذه الرموز هي مدبرة جيدا وذات أهمية حاسمة في تنظيم وظائف الخلية في نظام معيشة. على الرغم من أن عددا من الباحثين حاولوا التحقيق في العلاقة بين العوامل البيئية والوظائف الخلوية المرجوة، ما زال غير معروف. هذا إلى حد كبير بسبب عدم وجود منهجية سليمة لتقليد هذه الرموز البيئية في المختبر، وفي نفس الوقت اختبار منبهات بيئية مختلفة في الخلايا. هنا، نحن تقرير منصة متكاملة من القنوات موائع جزيئية ومجموعة نانوفيبير، يليها تحليل خلية واحدة عالية-المحتوى، لبحث تعمل الخلايا الجذعية التي غيرت بعوامل بيئية متميزة. وللتدليل على تطبيق هذا النظام الأساسي، تركز هذه الدراسة على تعمل ذاتيا تجديد الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). نقدم هنا، إجراءات إعداد مصفوفة نانوفيبير وهيكل موائع جزيئية في تلفيق صفيف متعدد المكروية الخلوية الاصطناعية (ماكمي). وعلاوة على ذلك، يتم وصف الخطوات الإجمالية من خلية واحدة التنميط، خلية تلطيخ مع عدة علامات مضيئة ومتعددة الأسفار التصوير، والتحليلات الإحصائية،.
البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (هبسكس)1،2 الذاتي تجديد غير محدود، وتفرق في مختلف الأنسجة الأنساب، التي يمكن أن تحدث ثورة في تطوير الأدوية والعلاجات المستندة إلى الخلية، وهندسة الأنسجة والطب التجديدي 3 , 4 , 5 , 6-أطباق الثقافة العامة ولوحات ميكروتيتير، ومع ذلك، ليست مصممة لتمكين التلاعب الخلية الجسدية والكيميائية الدقيقة على المستوى الخلوي مع طائفة من نانو إلى الصغرى-متر، وعامل حاسم لتوسيع الخلوية، التجديد الذاتي، والتمايز. ولمعالجة هذا العيب، حققت الدراسات أدوار ميكرونفيرونمينتس الخلوية في تنظيم قرارات مصير الخلية و وظائف الخلية4. في السنوات الأخيرة، أجريت عددا متزايداً من الدراسات لإعادة بناء ميكرونفيرونمينتس الخلوية في المختبر7،8. وقد أنشأت عمليات تصنيع نانو والصغرى هذه ميكرونفيرونمينتس من خلال التلاعب بالمواد الكيميائية9،10،11،،من1213، 14،15،،من1617 و المادية18،،من1920 العظة البيئية. وحتى الآن، لم ترد تقارير التحقيق بصورة منهجية الآليات الكامنة لمنبهات البيئية الكيميائية والفيزيائية في الخلية-مصير القرارات والمهام داخل منصة واحدة.
وهنا، نقدم استراتيجية تقوم على أساس مبادئ تصميم بسيط إنشاء منصة فحص قوية (الشكل 1). أولاً، يمكننا وصف الإجراء تطوير منهاج عمل موحد لإنشاء ميكرونفيرونمينتس الخلوية تنوعاً، الاصطناعية باستخدام مصفوفة نانوفيبير وبنية موائع جزيئية: صفيف متعدد اصطناعية الخلوية المكروية (ماكمي) (الشكل 1ألف و 2 ألف). يحتوي الصفيف نانوفيبير 12 ميكرونفيرونمينتس مختلفة في تركيبات مختلفة من المواد نانوفيبير والكثافة. واستخدمت اليكتروسبينينج لاختلاق النانو. المواد نانوفيبير، مثل البوليستيرين (PS)21، بوليميثيلجلوتاريميدي (بمجي)22و23من الجيلاتين (GT)، صممت لاختبار خواصها الكيميائية، التي قد تؤثر على التصاق الخلايا والحفاظ على بلوريبوتينسي ( الشكل 2ب). كانت تتفاوت كثافة نانوفيبير بتغيير الوقت اليكتروسبينينج وتم تعريف النانو التي تم إنشاؤها وفقا لهذه الكثافة (الفلبينية، مع د = إكسلوو/منخفض/منتصف/عالي). يتكون هيكل موائع جزيئية من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) إيواء 48 خلية ثقافة الدوائر، والذي يمكن وضعه على طول قياسي أبعاد ميكروسكوبية 96-جيدا. PDMS بوليمر متوافق حيويا وتبديل الغاز تستخدم عموما لاختلاق أجهزة موائع جزيئية24. كل قناة موائع جزيئية قد صمم ليكون 700 مكم واسعة و 8.4 ملم بوقت طويل وكان مداخل اثنين في الحواف (الجدول 1). الدوائر بارتفاعات مختلفة (250، 500، و 1000 ميكرومتر) للتلاعب الأولية البذر خلية الكثافة (0.3 و 0.6 1.2 × 105 خلايا/سم2)، التي قد ترتبط بالبقاء على قيد الحياة، والانتشار، والتفريق بين هبسكس25 (الشكل 2–ج). عدد الخلايا في المصنف إلى غرفة تتناسب مع كثافة العمود فوق أرضية الغرفة، وهكذا الخلية الأولى بذر الكثافة كان يسيطر عليها إدخال تعليق الخلية نفسها في دوائر الثقافة مع ارتفاعات مختلفة. جميع قنوات مصممة لتكون ≥ 250 ميكرون عالية26 التقليل من آثار التوتر المنخفض الأكسجين27 وإجهاد القص28 في الخلايا. يتم اختصار قناة آفاق من 250 و 500 و 1000 ميكرومتر هنا ك XCD مع X = منخفض، منتصف، وعالية، على التوالي. تم تقصير في البيئات مع كثافة نانوفيبير متميزة وكثافة البذر الخلية الأولى ك “الكثافة density_Cell Material_NF” (مثلاً، GT_HighNF_HighCD: بيئة تتسم بالكثافة GT النانو وخلية أولية عالية-البذر الكثافة).
وفي وقت لاحق، نحن تصف كيفية إجراء تحليلات خلية واحدة التحقيق بصورة منتظمة في سلوك الخلية استجابة للعوامل البيئية (الشكل 1ب). كإثبات لمفهوم، حددنا البيئة الخلوية الأمثل لتجديد هبسك المتمتعة بالحكم الذاتي، ومهمة رئيسية ل صيانة (الشكل 1ب) هبسك29. الخلوي المستندة إلى الصور، متبوعاً بالتحليلات الإحصائية، يسمح للتفسير الكمي الفردية الاستجابات المظهرية الخلوية للبيئات الخلوية. من بين مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية، تقدم هذه الورقة إجراء مفصل تحديد الشروط المثلى للحفاظ على هبسك الذاتي تجديد.
هذا البروتوكول يوضح طريقة الفحص الأولى ﻹنشاء نظام ثقافة قوية للصيانة هبسكس المؤهلين. أولاً، يمكننا وصف كيفية إعداد برنامج يضم ECMs الاصطناعية المتنوعة وخلية البذر الكثافة باستخدام جهاز موائع جزيئية متكاملة مع مجموعة نانوفيبير، الصفيف ماكمي. الكمية، والثاني يستند إلى صورة وحيدة الخلية phen…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر الأستاذ أ. ناكاتسوجي في إيسيمس، جامعة كيوتو، لتوفير حقوق دإط الخلايا. ونشكر أيضا ماروياما ألف الأستاذ في “معهد طوكيو للتكنولوجيا” لدعمه في استخدام مجهر القوة الذرية. سخاء قدم التمويل من “الجمعية اليابانية” “تعزيز العلوم” (JSPS؛ 22350104، 23681028، 25886006، و 24656502)؛ كما تم توفير التمويل “الطاقة الجديدة” ومنظمة تطوير التكنولوجيا الصناعية (نيدو) و “مؤسسة علوم الحياة تيرومو”. WPI-إيسيمس معتمد من قبل في العالم رئيس الوزراء الدولي أبحاث المركز مبادرة (WPI)، ووزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون)، اليابان. جزء من هذا العمل يدعمه مركز تكنولوجيا النانو جامعة كيوتو ومرفق تجهيز نانو داريجا في “مشروع منصة تقنية النانو” تحت رعاية يأمرون، اليابان.
Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
High-voltage power supply | TechDempaz | ||
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |