Bu makalede, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi taklit eden vivo içinde hücresel microenvironments fiziksel ve kimyasal yüksek üretilen iş manipülasyonu ipuçları ve için hazırlamak için ayrıntılı metodolojisi insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için en iyi hücresel ortam tek hücreli profil oluşturma ile tanımlayın.
Hücresel microenvironments büyüme faktörleri, hücre dışı matrisler ve hücreler arası etkileşimleri gibi yardımlar çeşitli oluşur. Bu cues de orkestra ve canlı bir sistem içinde hücre fonksiyonları düzenlenmesinde önemlidir. Her ne kadar bir dizi araştırmacılar çevresel faktörler ve istenen hücresel işlevler arasındaki ilişkiyi araştırmak için çalıştılar, pek bilinmeyen kalır. Bu büyük ölçüde bu tür çevre ipuçları vitrotaklit ve aynı anda farklı çevresel yardımlar hücreleri üzerinde test için uygun bir metodoloji eksikliği kaynaklanmaktadır. Burada, entegre bir platform mikrosıvısal kanalları ve yüksek-içerik tek hücre analizi, kök hücre fenotipleri farklı çevresel faktörler tarafından değiştirilmiş incelemek için ardından bir nanofiber dizi raporu. Bu platform uygulama göstermek için bu çalışma insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) kendini sürekli yenileyen fenotipleri üzerinde duruluyor. Burada, bir Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi imalatı nanofiber dizi veya mikrosıvısal yapısı için hazırlık yordamlarını mevcut. Ayrıca, profil oluşturma, hücre birden çok floresan işaretleri, birden çok floresan görüntü ve istatistiksel analizler, boyama tek hücrenin genel adımlar açıklanmaktadır.
İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs)1,2 unlimitedly kendi kendini yenilemek ve ilaç geliştirme, hücre tabanlı terapiler, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp devrim olabilir çeşitli doku soy, ayırt etmek 3 , 4 , 5 , 6. genel kültür yemekleri ve microtiter levha, ancak, tasarlanmamıştır hücresel genişleme için kritik bir faktör olduğunu, kesin fiziksel ve kimyasal hücre manipülasyon ile sıra nano – için mikro-metre, hücresel düzeyde etkinleştirmek için kendini yenileme ve farklılaşma. Bu dezavantajı yönelik olarak çalışmalar hücre-kader karar ve hücre fonksiyonları4düzenlenmesinde hücresel microenvironments rolleri araştırdı. Son yıllarda, hücresel microenvironments vitro7,8yeniden oluşturmak için giderek artan sayıda çalışmalar yapılmıştır. Nano ve mikro imalat işlemleri bu microenvironments kimyasal9,10,11,12,13manipülasyonu yoluyla kurduk, 14,15,16,17 ve fiziksel18,19,20 çevre ipuçları. Şimdiye kadar sistematik olarak kimyasal ve fiziksel çevre yardımlar hücre-kader karar ve fonksiyonları içinde tek bir platform üzerinde temel mekanizmaları araştırmak için hiçbir raporlar vardı.
Burada, bir güçlü tarama platform (Şekil 1) kurmak için basit tasarım ilkelerine dayanan bir strateji tanıtmak. İlk olarak, çok yönlü, yapay hücresel microenvironments nanofiber dizi ve bir mikrosıvısal yapısı kullanarak oluşturmak için entegre bir platform geliştirme prosedürü açıklamak: Multiplexed yapay hücresel MicroEnvironment (MACME) dizi (Şekil 1A ve 2A). Nanofiber dizi nanofiber malzeme ve yoğunlukları farklı kombinasyonlarda 12 farklı microenvironments var. Electrospinning nanofibers imal etmek kullanıldı. Nanofiber malzemeleri, polistiren (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22ve jelatin (GT)23, gibi hücre adezyon ve pluripotency ( bakımından etkileyebilecek kimyasal özelliklerini test etmek için tasarlanmıştır Şekil 2B). Nanofiber yoğunlukları çeşitli electrospinning zaman değiştirerek ve oluşturulan nanofibers onların yoğunlukları göre tanımlanmış (DNF, d = XLow/düşük/orta/yüksek). Mikrosıvısal yapısı 96-şey Mikroplaka standart boyut üzerinde konumlandırılmış olabilir 48 hücre kültürü chambers, yataklık polydimethylsiloxane (PDMS) oluşur. PDMS mikrosıvısal cihazlar24imal etmek genellikle kullanılan biyouyumlu ve gaz değiştirilebilen bir polimerdir. Her mikrosıvısal kanal 700-µm olarak tasarlanmıştır geniş ve 8.4 mm uzun ve kenarlarından (Tablo 1), iki giriş vardı. Odalar farklı yükseklikte vardı (250, 500 ve 1000 µm) hangi hayatta kalma, yayılması ve hPSCs25 farklılaşma ile ilişkilendirmek ilk hücre tohum yoğunlukları (0,3 0,6 ve 1,2 × 105 hücreleri/cm2), işlemek (Şekil 2C). Bir odaya seribaşı hücre sayısı sütun yoğunluğu odası kat yukarıda orantılıdır ve böylece ilk hücre yoğunluğu tohum kültür chambers ile farklı yükseklikte içine aynı hücre süspansiyon tanıtımı tarafından kontrol ediliyordu. Tüm kanallar ≥ 250-µm-yüksek26 hücreleri düşük oksijen gerginlik27 ve yamultma stres28 etkilerini en aza indirmek için tasarlanmıştır. 250, 500 ve 1000 µm kanal yüksekten burada kısaltılmış olarak XCD x = düşük, orta ve yüksek, anılan sıraya göre. Farklı nanofiber yoğunlukları ve ilk hücre tohum yoğunlukları ortamlarıyla “Material_NF density_Cell yoğunluğu” kısaltılmış (örneğin, GT_HighNF_HighCD: yüksek yoğunluklu GT nanofibers ve yüksek ilk hücre tohum ile karakterize bir ortam yoğunluk).
Daha sonra sistematik olarak hücre davranış çevresel faktörler (Şekil 1B) yanıt olarak araştırmak için tek hücreli çözümlemesi yapma nasıl açıklar. Bir kanıtı-of-concept olarak, biz en iyi hücresel ortam hPSC öz-yenileme, hangi hPSC bakım (Şekil 1B)29tuşu fonksiyonu tanımlanır. İstatistiksel analizler tarafından takip, yansıma tabanlı sitometresi bireysel hücresel fenotipik yanıt-e doğru hücresel ortamlar nicel yorumu sağlar. Çeşitli hücresel işlevler arasında bu kağıt hPSC öz-yenileme korumak için en uygun koşulları tanımlamak için detaylı bir yordam içermektedir.
Bu iletişim kuralı nitelikli hPSCs bakım için sağlam kültür sistem kurmak için ilk tarama yöntemi gösterir. İlk olarak, nasıl farklı yapay ECMs ve hücre yoğunluğu ile a nanofiber düzenlemek, MACME dizi entegre bir mikrosıvısal aygıtını kullanarak tohum bir platform hazırlamak için nitelendirdi. İkinci, nicel yansıma tabanlı tek hücreli fenotipleme bireysel hücresel sonuçları ve farklı biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri tarafından değiştirilmiş davranışları değerlendirmek iç…
The authors have nothing to disclose.
Biz Prof. N. Nakatsuji iCeMS, Kyoto Üniversitesi, insan ES hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Tokyo Teknoloji Enstitüsü’nde atomik kuvvet mikroskobu kullanımında verdiği destek için Prof. A. Maruyama teşekkür. Finansman cömertçe sağlanan Japonya Derneği tarafından bilim promosyon için (JSP’ler; 22350104, 23681028, 25886006 ve 24656502); fon ayrıca yeni enerji ve Endüstriyel teknoloji geliştirme organizasyonu (Ned-o) ve Terumo Life Science Foundation tarafından sağlandı. TEFE-iCeMS dünyanın önde gelen uluslararası araştırma merkezi girişimi (TEFE), Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji (MEXT), Japonya tarafından desteklenir. Bu çalışmanın bir parçası Kyoto Üniversitesi Nanoteknoloji Hub ve “Nanoteknoloji platformu Projesi” MEXT, Japonya sponsorluğunda AIST Nano-işleme tesisinde tarafından desteklenmiştir.
Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
High-voltage power supply | TechDempaz | ||
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |