Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

Summary

Insan embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenilemek ve vücudun tüm hücre tipleri içine ayırt yeteneği ve geliştirme ve hastalık temel sorulara yanıt için bir araştırma aracı olarak hem tıbbi uygulamalar için çok ümit vericidir. Burada, embriyoların iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu ile insan embriyonik kök hücrelerin derivasyon için bir özlü, adım adım protokolü sağlar.

Abstract

Insan embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenilemek ve vücudun tüm hücre tipleri içine ayırt yeteneği ve geliştirme ve hastalık temel sorulara yanıt için bir araştırma aracı olarak hem tıbbi uygulamalar için çok ümit vericidir. Burada, embriyoların iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu ile insan embriyonik kök hücrelerin derivasyon için bir özlü, adım adım protokolü sağlar.

Protocol

Insan embriyonik kök (HES) hücre derivasyon için kullanılan Dondurulmuş insan embriyolarını uygun bilgilendirilmiş onam, Harvard Üniversitesi'nde komitesi ve insan denekler üzerinde embriyonik kök hücre araştırmaları gözetim komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır araştırma protokol çerçevesinde aşağıdaki araştırma için bağışlandı . Aşağıda yazılı bir protokol Cowan ve arkadaşları tarafından yayınlanan parametreler üzerine dayanır. 2004, hafif değişiklikler. Embriyo Kültürü Quinn Advantage çözülme Kit ve kültürünün geliştirilmesine kadar genişletilmiş blastosist aşamasına kadar,% 15 Plasmanate ile desteklenmiş Küresel orta damla kullanarak insan embriyolarının çözülme. Iç hücre kütlesinden Immunosurgery tabanlı izolasyon Hazırlanması: 10cm plakaları her çözüm damla kurarak, zona pellusida ve immunosurgery kaldırılması plakaları (aşağıya bakın) hazırlayın. Buharlaşmasını önlemek için mineral yağ ile Yerleşimi. Derivasyon için tasarlanmıştır embriyo başına tek bir satır hazırlayın. EmbryoMax Asidik Tyrodes olduğu gibi kullanın. embriyonik kök hücre türetme medya: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum Yedek,% 10 Plasmanate,% 2.5 ES hücre test fetal sığır serumu (FBS), 2mm Glutamax-I,% 1 non-esansiyel amino asitler, 50 adet / ml penisilin, 50μg/ml streptomisin, 0.055mM b-merkaptoetanol 5ng/ml bFGF. Tavşan anti-insan kırmızı kan hücre birincil antikor, üretici firmanın önerisi, embriyonik kök hücre türetme medya ile 01:10 seyreltilmiş doğrultusunda sulandırılmış. Gine domuzu tamamlayıcı serum, üretici firmanın önerisi, embriyonik kök hücre türetme medya ile 01:10 seyreltilmiş doğrultusunda sulandırılmış. 37 ° C doku kültürü inkübatör kullanmadan önce bütün plakaları dengelenmesi. Embriyolar transfer olarak kullanmak için 50μl 100μl kapiller pipetler (VWR) çekin. Elmas kalem ve 0.2μm filtresi ile donatılmış ağız pipet tüp kullanımı ile biter kesin. Immunosurgery Prosedürü: Notlar: Bu prosedürde, trophectoderm hücreleri, kompleman aktivitesi ile tandem insan hücrelerine karşı antikorlar yönettiği kısa maruz kalma yok. Bu nedenle blastosist sadece yapısal bütünlüğünü de immünolojik reaksiyon duyarlı olmaktan ICM engeller olarak, protokol, sağlam bir trophectoderm yüksek kaliteli embriyolar ile en iyi şekilde çalışır. Tüm işlemler, ısıtılmış tabla ile donatılmış bir diseksiyon kapsamı kullanılarak yapılan. Adımlar: Embriyoların yapışmasını önlemek için FBS ile embriyo transferi için kullanılan ağız pipet durulayın. Kültür çanak çanak AT embriyonik kök tutarak açılan blastokist transferi. Embriyonik kök damla damla AT serisi ile blastokist transferi prosedürü başlayın. Üçüncü açılan zona pellusida (genellikle 5-30 saniye) kapatılması için izleyebilirsiniz. Aşırı tedavi veya embriyonun bütünlüğünü değil dikkatli olun bozulabilir. Embriyonik kök hücre türetme medya dizi transfer blastosist AT durulayın düşer. Medya ile pipet Preloading hemen tepki AT nötralize etmek için tavsiye edilir. Tüm işlenmiş AT kadar blastosist burada tutulabilir. 37 30 dakika inkübasyon için üçüncü damla ° C doku kültürü inkübatörde bırakarak, primer antikor damla dizi blastokist transferi. Embriyonik kök hücre türetme medya dizi transfer blastosist birincil durulayın düşer. Trophectoderm hücrelerinin parçalanması izlemek için üçüncü bir damla bırakarak, tamamlayıcı damla dizi blastokist transferi. Lyse olarak trophectoderm hücrelerinin "köpüren" için sahnede ilk 30 saniye boyunca blastosist uyun. Lizis bu zaman dilimi içinde görülürse, tamamlanıncaya kadar tepki izlemek için mikroskop sahnede çanak tutmak. Ilk 30 saniye boyunca hiçbir köpüren görülürse trophectoderm çoğu parçalanmış kadar her 5 dakikada bir kontrol, inkübatör dönmek. Bu 5-15 dakika alabilir. Reaksiyon zamanı ve iç hücre kütlesi potansiyel zararı en aza indirmek için yakın reaksiyon izleyin. Transferi blastosist embriyonik kök hücre türetme medya dizi tamamlayıcı faaliyet yıkayın düşer. Blastosist (10μl VWR kılcal tüpler çekilmiş) biraz daha küçük bir çapa sahip cam pipet kullanarak, parçalanmış trophectoderm en uzak şerit aşağı blastosist çizmek ve. g "alt =" 574_Figure-0 "width =" 577 "height =" 270 "/> Levha ICM mitotik olarak inaktive edilmiş fare embriyo fibroblastlar (MEFS) besleyici hücreler üzerine izole. MEFS türetme bir gün önce hazırlanan ve embriyonik kök hücre türetme medya gün açık olmalıdır. 4-Nunc yemekleri türetme ilk adımlar için iyi çalışır. İlk 1-2 gün için tabak Rahatsız etmeyin. Bundan sonra, embriyonik kök hücre kolonileri (1-2 hafta içinde genellikle belirgin) akıbet için günlük olarak kontrol edin. Medya her gün 3 gün başında yarım cilt olarak değiştirilmesi gerekir. ES hücre akıbet ve Pasajlanması Embriyonik kök hücre akıbet yaklaşık 0,5 mm veya daha fazla ulaştığında, mekanik seçerek genişlemesi için hazırdır. Mekanik akıbet yarısı dağıtmak ve taze besleyiciler içeren yeni plakalar transfer. Embriyonik kök hücre kümeleri her biri yaklaşık 30-50 hücreleri olmalıdır. Back-up ilk geçiş (p1) olarak akıbet diğer yarısı bırakın. Genişletmeye devam ediyor akıbet (p0) birkaç kez alınabilir. İkincil koloniler benzer dağınık ve yeni hücre hatları enzimatik tripsin ile Pasajlanması adapte edilebilir pasajlar bu süre 3-5 kadar büyük kültür yemekleri arasında açılabilir. ES hücre farklılaşması en aza indirmek için, kültür medya serum içeriği de yavaş yavaş bu ilk geçişleri sırasında% 1 ve% 0 olmalıdır. Tüm kurulan embriyonik kök hücre hatları erken pasajların bir kısmı aşağı gelecek genişlemeler için dondurularak banked olmalıdır. Buna ek olarak, her bir hücre hattı karyotip analizi ile karakterize edilebilir ve in vitro ve in vivo pluripotency ve farklılaşma çalışmalar tarafından doğrulandığı.

Discussion

Burada sunulan protokol ile araştırmacılar sağlar, özlü, kolay iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu insan embriyonik kök hücre hatları elde etmek için nasıl ana hatları takip edin.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Quinn’s Advantage Thaw Kit		Sage	ART-8016
Global medium		Life Global	GMGB-050
Plasmanate		Talecris	61325
EmbryoMax Acidic Tyrodes		Chemicon/Millipore	MR-004-D
KO-DMEM		Invitrogen/Gibco	10829-018
KO-Serum Replacement		Invitrogen/Gibco	10828-028
ES cell-tested fetal bovine serum, Defined		Hyclone	SH30070.03
Glutamax-I		Invitrogen/Gibco	35050-079
Non-essential amino acids		Invitrogen/Gibco	11140-076
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen/Gibco	15070-063
Recombinant human basic fibroblast growth factor		Invitrogen	13256-029
Beta-mercaptoethanol		Invitrogen/Gibco	21985-023
Rabbit anti-human red blood cell primary antibody		Rockland	109-4139
Guinea-pig complement serum		Sigma	S-1639
Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes		VWR
Mouth pipettes with tubing		VWR		supplied with capillary pipettes from VWR
0.2 microm Acrodisc syringe filter		Pall Life Sciences	PN4192
0.5% Trypsin-EDTA		Invitrogen/Gibco	25300-120
Tissue culture dishes		VWR
Tissue culture dishes		NUNC
Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage
Mouse embryonic fibroblasts (E12.5)