Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

Summary

La capacidad de las células madre embrionarias humanas de auto-renovación y diferenciación en todos los tipos celulares del cuerpo sugiere que una gran promesa para aplicaciones médicas y como herramienta de investigación para abordar las cuestiones fundamentales en el desarrollo y la enfermedad. Aquí, ofrecemos un breve paso a paso el protocolo para la derivación de células madre embrionarias humanas a partir de embriones por el aislamiento immunosurgical de la masa celular interna.

Abstract

La capacidad de las células madre embrionarias humanas de auto-renovación y diferenciación en todos los tipos celulares del cuerpo sugiere que una gran promesa para aplicaciones médicas y como herramienta de investigación para abordar las cuestiones fundamentales en el desarrollo y la enfermedad. Aquí, ofrecemos un breve paso a paso el protocolo para la derivación de células madre embrionarias humanas a partir de embriones por el aislamiento immunosurgical de la masa celular interna.

Protocol

Congelados embriones humanos utilizados para la derivación de células madre embrionarias humanas (HES) fueron donados para la investigación con previo consentimiento informado adecuado bajo protocolos de investigación que fueron revisados ​​y aprobados tanto por el comité sobre el uso de seres humanos y las células madre embrionarias comité de supervisión de la investigación en la Universidad de Harvard .

Protocolo escrito a continuación se basa en los parámetros publicados reportados por Cowan et al. 2004, con ligeras modificaciones.

Cultivo de embriones

Descongelar los embriones humanos usando Kit Quinn ventaja deshielo y la cultura en gotas de medio global complementado con un 15% Plasmanate hasta que el desarrollo de la etapa de blastocisto expandido.

Immunosurgery basada en el aislamiento de la masa celular interna

Preparación:

1. Preparar platos para la eliminación de la zona pelúcida y immunosurgery (ver más abajo) mediante la creación de gotas de cada solución en placas de 10 cm. Superposición con aceite mineral para evitar la evaporación. Prepare una sola fila por embriones destinados a la derivación.
   • EmbryoMax Tyrodes ácidas, como es el uso.
   • hES medios de comunicación celular derivación: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum de reemplazo, el 10% Plasmanate, el 2,5% de células ES a prueba de suero fetal bovino (FBS), 2 mM Glutamax-I, el 1% no aminoácidos esenciales, 50 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 50μg/ml, 0.055mM b-mercaptoetanol, 5ng/ml bFGF.
   • Conejo anti-humano de anticuerpos de glóbulos rojos primaria, reconstituido de acuerdo con la sugerencia del fabricante, se diluye a las 1:10 con los medios de comunicación hES derivación celular.
   • Conejillo de indias suero complemento, reconstituido de acuerdo con la sugerencia del fabricante, se diluye a las 1:10 con los medios de comunicación hES derivación celular.
     
     
     
     
     
     
2. Equilibrar todas las placas a 37 ° C en la incubadora de cultivo de tejidos antes de su uso.
3. Tire de 50μl, 100μl pipetas capilares (VWR) para su uso en la transferencia de embriones. Corte los extremos con lápiz de diamante y el uso con un tubo de la boca de pipeta equipado con un filtro de 0.2μm.

Immunosurgery procedimiento:

Notas:

• En este procedimiento, las células de la trophectoderm son destruidos por la breve exposición a los anticuerpos dirigidos contra las células humanas en conjunto con la actividad del complemento. Por lo tanto, el protocolo funciona mejor con embriones de alta calidad con un trophectoderm intacta, ya que sólo la integridad estructural del blastocisto evita que el ICM de también ser susceptibles a la reacción inmunológica.
• Todos los procedimientos llevados a cabo utilizando un endoscopio equipado con disección etapa se calienta.

Pasos a seguir:

1. Enjuague pipetear con la boca que se utilizará para la transferencia de embriones con FBS para evitar que los embriones se peguen.
2. La transferencia de blastocistos de placa de cultivo de hES caída celebración de AT plato.
3. Comience el procedimiento mediante la transferencia de blastocistos de caída hES a través de una serie de AT gotas. En tercera gota, para ver la disolución de la zona pelúcida (segundo por lo general 5-30). Tenga cuidado de no sobre-tratamiento o la integridad del embrión puede verse comprometida.
   
   
   
   
4. Blastocisto de transferencia a través de una serie de medios de comunicación hES derivación de células se reduce a enjuagar AT. Pipeta de precarga con los medios de comunicación se recomienda para neutralizar de inmediato la reacción. Blastocistos puede ser considerado aquí hasta que todos hayan sido procesados.
5. La transferencia de blastocistos a través de una serie de gotas de anticuerpo primario, dejando en la tercera gota durante 30 minutos de incubación a 37 ° C en un incubador de cultivo de tejidos.
6. Blastocisto de transferencia a través de una serie de medios de comunicación hES derivación de células se reduce a enjuagar primaria.
7. La transferencia de blastocistos a través de una serie de gotas de complemento, dejando en la tercera gota de ver para la lisis de las células trophectoderm. Observe blastocisto de los primeros 30 segundos en el escenario de "burbujas" de las células trophectoderm como lisis. Si se observa la lisis dentro de este plazo, mantener un plato sobre platina del microscopio para controlar la reacción hasta su finalización. Si no hay burbujas que se observa durante los primeros 30 segundos, retorno a la incubadora, comprobando cada 5 minutos hasta que la mayoría de los trophectoderm ha lisadas. Esto puede tomar 5-15 minutos. Monitorear la reacción de cerca para minimizar el tiempo de reacción y el daño potencial de la masa celular interna.
   
   
   
   
8. Blastocisto de transferencia a través de una serie de medios de comunicación hES derivación de células se reduce a lavar la actividad del complemento.
9. Usando una pipeta de vidrio con un diámetro ligeramente más pequeño que el blastocisto (sacado de 10μl tubos capilares VWR), dibuja el blastocisto arriba y hacia abajo para quitar a la mayoría de los trophectoderm lisadas.
   
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10. Placa de ICM aislar a las células de conexión de los fibroblastos de embrión de ratón mitóticamente inactivadas (MEFs). MEFs debe estar preparado el día antes de la derivación y cambió a la celda hES derivación día de los medios de comunicación. 4 platos y NUNC funcionan bien para los primeros pasos de la derivación.
11. No moleste a la placa de 1-2 días. A partir de entonces, todos los días para ver resultado de colonias de células madre embrionarias (generalmente evidente en 1-2 semanas). Los medios de comunicación se debe cambiar en los volúmenes de media cada día, comenzando otra el día 3.

ES consecuencia celulares y pases

Cuando la extensión de células hES ha llegado aproximadamente a 0,5 mm o más, está listo para la expansión de recogida mecánica.

1. Mecánicamente dispersar la mitad de la extensión y la transferencia de las nuevas placas que contienen los alimentadores fresco. Grupos de células madre embrionarias debe ser aproximadamente de 30 a 50 celdas cada uno. Agregar la otra mitad de la extensión como un back-up para el primer paso (P1). La consecuencia (P0) se pueden seleccionar de varias veces a medida que continúa expandiéndose.
   
   
   
   
   
2. Colonias secundaria puede ser igualmente dispersado y expandido a través de placas de cultivo más grande hasta pasajes 3-5, momento en el que las nuevas líneas celulares se pueden adaptar a los pases enzimática con tripsina. El contenido en suero de los medios de cultivo también debe reducirse gradualmente hasta el 1% y 0% en los pasajes iniciales de reducir al mínimo la diferenciación de células ES.
3. Todas las líneas establecidas de células madre embrionarias debe ser depositado por la congelación por parte de principios de los pasajes para futuras expansiones.
4. Además, cada línea celular se caracteriza por el análisis de cariotipos y validado por estudios de pluripotencia y la diferenciación in vitro e in vivo.
   

Discussion

El protocolo que aquí se presenta ofrece a los investigadores con un conciso y fácil de seguir, resumen de la forma de obtener líneas embrionarias humanas de células madre mediante el aislamiento immunosurgical de la masa celular interna.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quinn’s Advantage Thaw Kit	Sage	ART-8016
Global medium	Life Global	GMGB-050
Plasmanate	Talecris	61325
EmbryoMax Acidic Tyrodes	Chemicon International	MR-004-D
KO-DMEM	Invitrogen	10829-018
KO-Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
ES cell-tested fetal bovine serum, Defined	Hyclone	SH30070.03
Glutamax-I	Invitrogen	35050-079
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-076
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063
Recombinant human basic fibroblast growth factor	Invitrogen	13256-029
Beta-mercapt–thanol	Invitrogen	21985-023
Rabbit anti-human red blood cell primary antibody	Rockland Immunochemicals	109-4139
Guinea-pig complement serum	Sigma-Aldrich	S-1639
Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes	VWR international
Mouth pipettes with tubing	VWR international		supplied with capillary pipettes from VWR
0.2 microm Acrodisc syringe filter	Pall Corporation	PN4192
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-120
Tissue culture dishes	VWR international
Tissue culture dishes	Nalge Nunc international
Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage
Mouse embryonic fibroblasts (E12.5)