Summary
La capacità di cellule staminali embrionali umane per auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo suggerisce che essi sono molto promettenti per le applicazioni mediche e come strumento di ricerca per affrontare questioni fondamentali per lo sviluppo e la malattia. Qui, mettiamo a disposizione una concisa, passo-passo il protocollo per la derivazione di cellule staminali embrionali umane da embrioni da immunosurgical isolamento della massa cellulare interna.
Abstract
La capacità di cellule staminali embrionali umane per auto-rinnovarsi e differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo suggerisce che essi sono molto promettenti per le applicazioni mediche e come strumento di ricerca per affrontare questioni fondamentali per lo sviluppo e la malattia. Qui, mettiamo a disposizione una concisa, passo-passo il protocollo per la derivazione di cellule staminali embrionali umane da embrioni da immunosurgical isolamento della massa cellulare interna.
Protocol
Congelati embrioni umani usati per staminali embrionali umane (HES) derivazione delle cellule sono stati donati per la ricerca seguenti corretto consenso informato in protocolli di ricerca che sono stati esaminati e approvati sia dal comitato per l'uso di soggetti umani e sulle cellule staminali embrionali comitato di sorveglianza di ricerca presso la Harvard University .
Protocollo scritto che segue si basa su parametri pubblicato riportato da Cowan et al. 2004, con lievi modifiche.
Embrione Cultura
Scongelare gli embrioni umani utilizzando Scongelare Quinn Advantage Kit e la cultura in gocce di medio globale integrata con il 15% Plasmanate fino allo sviluppo allo stadio di blastocisti espansa.
Immunosurgery basata isolamento della massa cellulare interna
Preparazione:
- Preparare le piastre per la rimozione della zona pellucida e immunosurgery (vedi sotto) attraverso la creazione di gocce di ogni soluzione in lastre di 10 cm. Sovrapposizione con olio minerale per prevenire l'evaporazione. Preparare una singola riga per ogni embrione destinato derivazione.
- EmbryoMax Tyrodes acida, l'uso è come.
- hES derivazione delle cellule dei media: il 75% KO-DMEM, 10% KO-siero di ricambio, il 10% Plasmanate, il 2,5% delle cellule ES-testato siero fetale bovino (FBS), 2mM Glutamax-I, 1% di aminoacidi non essenziali, 50 unità / ml di penicillina, streptomicina 50μg/ml, 0.055mM b-mercaptoetanolo, 5ng/ml bFGF.
- Coniglio anti-umano globuli rossi anticorpo primario, ricostituito secondo il suggerimento del produttore, diluito 1:10 con mezzi di derivazione delle cellule HES.
- Cavia siero complemento, ricostituito secondo il suggerimento del produttore, diluito 1:10 con mezzi di derivazione delle cellule HES.
- Equilibrare tutte le piastre a 37 ° C in incubatore cultura del tessuto prima dell'uso.
- Tirare pipette capillari 50μl-100μl (VWR) per l'utilizzo in embrioni trasferire. Tagliate le estremità con la penna di diamante e l'uso con tubi in bocca pipetta dotato di filtro 0.2μm.
Immunosurgery procedura:
Note:
- In questa procedura, le cellule del trophectoderm sono distrutti da una breve esposizione di anticorpi diretti contro le cellule umane in tandem con l'attività del complemento. Pertanto, il protocollo funziona meglio con alta qualità degli embrioni con un trophectoderm intatto, in quanto solo l'integrità strutturale della blastocisti impedisce l'ICM anche da essere suscettibile alla reazione immunologica.
- Tutte le procedure eseguite utilizzando una portata dissezione dotato di palco riscaldato.
Passi:
- Sciacquare la bocca pipetta da utilizzare per il trasferimento degli embrioni con FBS per evitare che si attacchino gli embrioni.
- Trasferimento di blastocisti piatto da cultura a goccia hES detenzione di AT piatto.
- Iniziare procedura di trasferimento di blastocisti da goccia hES attraverso serie di AT gocce. In calo in terzo luogo, guardare per lo scioglimento della zona pellucida (secondi di solito 5-30). Fare attenzione a non sovra-trattamento o l'integrità dell'embrione può essere compromessa.
- Blastocisti di trasferimento attraverso serie di mezzi di derivazione delle cellule hES scende a risciacquare AT. Pipetta precarico con i media si raccomanda di neutralizzare immediatamente a reazione. Blastocisti può essere ritenuto qui fino a quando tutti sono stati AT-trattati.
- Trasferimento di blastocisti attraverso serie di gocce anticorpo primario, lasciando in terza goccia per 30 minuti di incubazione a 37 ° C in un tessuto culturale incubatore.
- Blastocisti di trasferimento attraverso serie di mezzi di derivazione delle cellule hES scende a risciacquare primaria.
- Trasferimento di blastocisti attraverso serie di gocce di complemento, lasciando in terza goccia a guardare per la lisi dei globuli trophectoderm. Osservare blastocisti per i primi 30 secondi sul palco di "bolle" di cellule trophectoderm come lisare. Se si osserva la lisi entro questo lasso di tempo, tenere piatto sul palco microscopio per monitorare la reazione fino al completamento. Se non bolle si osserva durante i primi 30 secondi, tornare a incubatore, controllando ogni 5 minuti fino a quando la maggior parte delle trophectoderm ha lisate. Questa operazione può durare 5-15 minuti. Monitorare attentamente la reazione di ridurre al minimo i tempi di reazione e potenziali danni alla massa cellulare interna.
- Blastocisti di trasferimento attraverso serie di mezzi di derivazione delle cellule hES scende a lavare via l'attività del complemento.
- Utilizzando una pipetta di vetro con un diametro che è leggermente più piccola della blastocisti (tirato da 10μl VWR tubi capillari), disegnare la blastocisti su e giù per spogliare la maggior parte dei trophectoderm lisate.
g "alt =" 574_Figure-0 "width =" "height =" 577 270 "/> - Piastra ICM isolare su cellule feeder di fibroblasti di topo mitoticamente inattivato embrione (MEF). MEF deve essere preparato il giorno prima derivazione e passati a cellule di derivazione hES mezzi giornata di. 4-anche i piatti NUNC funzionare bene per i primi passi di derivazione.
- Non disturbare piastra per i primi 1-2 giorni. Successivamente, controllare ogni giorno per conseguenza di colonie di cellule staminali embrionali (in genere evidente entro 1-2 settimane). Media dovrebbe essere cambiato in volumi di un mezzo ogni inizio altro giorno in giorno 3.
ES escrescenza cellulare e passaging
Quando la cellula escrescenza hES ha raggiunto circa 0,5 millimetri o più, è pronto per l'espansione di raccolta meccanica.
- Meccanicamente disperdere la metà dei escrescenza e trasferimento in nuovi piatti contenenti alimentatori fresca. Ammassi di cellule staminali embrionali dovrebbe essere circa 30-50 cellule ciascuno. Lascia altra metà della crescita degli come back-up per il primo passaggio (p1). L'escrescenza (p0) possono essere selezionati da diverse volte in quanto continua ad espandersi.
- Colonie secondarie possono essere allo stesso modo disperso e ampliata attraverso i piatti della cultura più grande fino passaggi 3-5, momento in cui le nuove linee cellulari possono essere adattati alle passaging enzimatica con tripsina. Il contenuto siero dei media cultura dovrebbe essere gradualmente ridotta a 1% e 0% nel corso di questi passaggi iniziali per minimizzare la differenziazione delle cellule ES.
- Tutti stabilito linee di cellule staminali embrionali dovrebbe essere incassato da congelamento giù una parte di passaggi presto per future espansioni.
- Inoltre, ogni linea cellulare dovrebbe essere caratterizzata da analisi del cariotipo e validato da studi pluripotenza e la differenziazione in vitro e in vivo.
Discussion
Il protocollo qui presentato fornisce ai ricercatori un conciso, facile da seguire schema di come derivare embrionali umane linee di cellule staminali da immunosurgical isolamento della massa cellulare interna.
Acknowledgments
AEC è un collega della bara Jane Childs Memorial Fund per la ricerca medica e Merck Research Laboratories. Ringraziamo D. Egli e C. Cowan per la consulenza sperimentali e discussione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global medium | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| ES cell-tested fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Recombinant human basic fibroblast growth factor | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| Rabbit anti-human red blood cell primary antibody | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Guinea-pig complement serum | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes | VWR international | ||
| Mouth pipettes with tubing | VWR international | supplied with capillary pipettes from VWR | |
| 0.2 microm Acrodisc syringe filter | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tissue culture dishes | VWR international | ||
| Tissue culture dishes | Nalge Nunc international | ||
| Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (E12.5) |
References
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
