Мы представляем здесь заявку на стандартный иммунологический метод (CFSE окрашенных OT-я распространения) предназначен для быстро отслеживать адъювант опосредованных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) поколения в vivo. Этот быстрый оценки возможностей CTL полезен для разработки профилактических вакцин против внутриклеточных возбудителей, а также терапевтического рака вакцины.
Оценка современных подразделение вакцин показывает, что поколения нейтрализующих антител является важным, но не достаточным для отбора адъювантной. Поэтому срочно необходимы адъювантов гуморальные и клеточные иммуно стимулирующее возможности, которые способны содействовать цитотоксических Т лимфоцитов (CTL) ответы. Таким образом верных мониторинг адъювантной кандидатов, которые вызвать кросс грунтовки и впоследствии повышения CTL поколения представляет решающим шагом в разработке вакцин. Здесь мы представляем заявку для метода, который использует SIINFEKL-конкретных (OT-я) Т-клеток следить в кросс Презентация модели антигена овальбумина (OVA) в естественных условиях при наличии различных адъювантной кандидатов. Этот метод представляет собой быстрый тест для выбора адъювантов с лучшими возможностями кросс грунт. С распространением CD8+ T клетки является наиболее ценным признаком кросс грунтовки и он также рассматривается как коррелят адъювант индуцированной кросс-презентации. Эта функция может быть оценен в различных иммунных органов как лимфатических узлах и селезенке. Степени CTL поколения может также контролироваться, тем самым давая информацию о характере местной (главным образом дренаж лимфатических узлов) или системного реагирования (отдаленных лимфатических узлов и селезенки). Этот метод также позволяет несколько модификаций для тестирования препаратов, которые могут препятствовать конкретные пути кросс презентация и также предоставляет возможность для использования в различных штаммов обычных и генетически измененных мышей. Таким образом приложение, которое мы представляем здесь будет полезным для лабораторий вакцины в промышленности и научных кругов, которые разрабатывать или изменять химические адъювантов для исследований и разработок вакцин.
Цитотоксических лимфоцитов T (CTL), вызывая вакцины являются ключевыми терапевтических вмешательств, которые были разработаны для борьбы с определенных видов рака1. CTL также важны для профилактической вакцины против внутриклеточных возбудителей2. Кроме того CTL являются одним из немногих механизмов иммунной обороны, функционально активных популяции риска таких новорожденных3,4 , которых также зависят от CTL борьбы с ранней жизни инфекции5. В этой связи вакцин против респираторных-синцитиальный вирус (RSV), которые были разработаны с адъювантом, которые не вызывают CTL ответы (квасцы) привели к полным провалом вакцины, ведущих к серьезным осложнениям после инфекции у младенцев6. Эти негативные эффекты вакцинации могут быть отменены CD8+ Т-клеток ответ7. Ранее мы показали, что основные цитокинов (тип и интерферонов) вызвало некоторые стимулятором интерферона генов (Стинг) агонистами важны для CTL ответы, порожденных эти адъюванты8, в частности путем измерения распространения OT-я T-клеток после вакцинации и использования этих результатов как мера CTL, вызывая возможности наблюдается в расширенной вакцинации расписания9. Измерение количества OT-я CD8+ T-клеток в дикого типа (WT) C57BL/6 получателей мыши Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE) краситель разрежения является надежной оценки возможности адъювантной вакцины для создания кросс грунт SIINFEKL, (иммуно доминантный пептид овальбумина, OVA). Вариации этой техники широко используются для оценки распространения OT-я CD8+ и OT-II CD4+ T клетки. Например он был использован в отсутствие отдельных цитокинов (KO мышей) или измерить эффективность вакцины после отзыва антигена в WT животных. Мы разработали короткой протокола (4 дня эксперимент) в котором после пассивной передачи CFSE-витражи OT-я CD8 клетки+ T, подкожной иммунизации (с.к.), состоящий из одной дозе 50 мкг бесплатно эндотоксина OVA, дополнена тест адъювантов осуществляется (Рис. 1). Следить за 48 ч после вакцинации результатов обеспечивает надежное доказательство адъювантной способность генерировать CTL ответов. В этой стратегии можно оценить потенции локального иммунного ответа в Дренажный лимфатический узел после иммунизации, а также степени реакции путем измерения активности CTL селезенки (или отдаленных лимфатических узлов).
Современные вакцины являются идеально composedof очищенный антигена и адъювантов, с возможным добавлением системы доставки как липосомы, вирусоподобных частиц, наночастицы или живой векторов. Ключевым аспектом при разработке вакцины необходимо выбрать правильный адъювантной согласно кл…
The authors have nothing to disclose.
Мы в долгу перед нашими техническими помощниками: ю. Bröder и х. Shkarlet, который помог нам в ходе экспериментальных процедур. Эта работа была частично финансируется ЕС гранты (UniVax, контракт № 601738 и TRANSVAC2, контракт № 730964) и Грант Гельмгольца (Хай-IDR). Источники финансирования не влияют исследования дизайн, поколения рукопись или решение представить его для публикации.
BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |