Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Adjuvan'ın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı Vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme

doi: 10.3791/57401 Published: June 19, 2018

Summary

Burada bir standart immünolojik tekniği için bir uygulama mevcut (CFSE lekeli OT-Ben nükleer silahların yayılmasına karşı) hızla adjuvan-aracılı sitotoksik T lenfosit (CTL) üretimi izlemek amacıyla içinde vivo. Bu hızlı tahmini bir CTL kapasite hücre içi patojenlere karşı koruyucu aşıları aynı zamanda tedavi kanser aşıları gelişimi için yararlıdır.

Abstract

Modern alt birim aşılar değerlendirilmesi antikorları nötralize üretimi önemli ancak adjuvan seçim için yeterli olduğunu ortaya koymaktadır. Bu nedenle, adjuvan sitotoksik T lenfositler (CTL) yanıt teşvik edebiliyoruz humoral ve hücresel immün uyarıcı yetenekleri ile acilen ihtiyaç vardır. Böylece, çapraz-astar ikna etmek ve daha sonra CTL üretimi geliştirmek adjuvan adayları sadık izleme aşı geliştirmede önemli bir adımı temsil eder. Burada biz SIINFEKL özgü kullanan bir yöntem için bir uygulama mevcut (OT-ben) T hücreleri farklı adjuvan adayların huzurunda modeli antijen ovalbumin (OVA) vivo içinde çapraz sunumunu izlemek için. Bu yöntem en iyi çapraz-astar yetenekleri ile adjuvan seçmek için hızlı bir test temsil eder. CD8 yayılması+ T hücreleri çapraz-astar en değerli belirtisi olduğunu ve aynı zamanda adjuvan kaynaklı çapraz-sunum ilişkili kabul edilir. Bu özellik, lenf düğümleri ve dalak gibi farklı bağışıklık organlarında değerlendirilebilir. CTL oluşturma kapsamını da izlenebilir, böylece bir yerel doğa üzerinde anlayışlar veren (lenf nodu esas olarak boşaltılmasına) ya da sistemik yanıtın (uzak lenf düğümleri ve/veya dalak). Bu tekniği daha da belirli çapraz-sunum yolları inhibe olabilir ve ayrıca geleneksel ve genetiği değiştirilmiş fare farklı suşları kullanılmak üzere imkanı sunuyor ilacını test için birden fazla değişiklik sağlar. Özetle, burada mevcut uygulama geliştirmek veya aşı araştırma ve geliştirme için kimyasal adjuvan değiştirme aşı laboratuarlar sanayi veya Akademi için faydalı olacaktır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aşılar inducing sitotoksik T lenfositler (CTL) belirli türde kanser1mücadele için geliştirilmiş anahtar tedavi müdahaleler vardır. CTL de intrasellüler patojenlerin2karşı koruyucu aşıları için önemli. Ayrıca, CTL bir kaç bağışıklık savunma mekanizmaları da erken hayat enfeksiyonlar5mücadele için CTL üzerinde bağlıdır kime risk nüfus yenidoğan bebeklerin3,4 gibi işlevsel olarak etkin bulunmaktadır. Bu bağlamda, CTL yanıt (şap) temin etmez bir adjuvan ile geliştirilen aşılar karşı solunum sinsityal virüs (RSV) aşı bebeklerde6adet enfeksiyondan üzerine ciddi komplikasyonlara yol tam bir başarısızlık sonuçlandı. Aşı bu olumsuz etkileri bir CD8 tarafından ters+ T hücre yanıt7. Biz daha önce interferon genler (STING) agonistler bazı uyarıcı tarafından elde edildi (tip ı interferonlar) ana sitokinler bu adjuvan8tarafından kısmen yayılması ölçerek oluşturulan CTL yanıt için gerekli olduğunu göstermiştir OT-ı T hücreleri sonra aşı ve yetenekleri inducing CTL ölçüsü gözlenen bu sonuçları kullanarak aşılama programları9erişmek. OT yayılması ölçümü-ben CD8+ T hücreleri bir vahşi türü (WT) C57BL/6 alıcı fare carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) boya tarafından seyreltme bir aşı adjuvan yeteneği oluşturmak için sağlam bir tahmin olduğunu. SIINFEKL, (ovalbumin, OVA IMMUNO-baskın peptid), çapraz-astar. Bu tekniğin varyasyonları yaygın OT yayılması değerlendirilmesi için kullanılan-ben CD8+ ve OT-II CD4+ T hücreleri. Örneğin, seçili sitokinler (KO fareler) ya da antijen hatırlama WT hayvanlarda sonra aşı etkinliği ölçmek için yokluğunda kullanılmıştır. Hangi OT CFSE lekeli pasif transfer sonra kısa protokol (4 gün deneme) geliştirmiştir-ben CD8+ T hücreleri, 50 bir doz oluşan bir cilt altı (SC) bağışıklama endotoksin-Alerjik OVA test adjuvan ile desteklenmiş µg yönetilen (Şekil 1). 48 h sonrasi hipererjik sonuçları takip adjuvan kapasitesi CTL yanıt-e doğru oluşturmak için güvenilir bir kanıtı sağlar. Bu strateji, dalak (veya uzak lenf düğümleri) CTL etkinliğini ölçerek ölçüde yanıt yanı sıra bağışıklama sonra drenaj lenf nodu yerel Bağışıklık yanıtında potens değerlendirmek mümkündür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışmada kullanılan tüm fareler C57BL/6 kökenli idi. Bütün hayvanlar patojen-Alerjik koşullar altında tutuldu. Tüm deneyler Alman hayvanları koruma kanunu (TierSchG BGBl. normatif göre gerçekleştirilen BEN S 1105; 25.05.1998) ve izni numarası altında 33.4-42502-04-13/1281 ve 162280 hayvan deneyleri etik ve devlet ofis (tüketicinin korunması, alt Saksonya eyalet Office ve gıda güvenliği), alt Saksonya Komitesi tarafından kabul edildi.

1. CFSE OT boyama-ı T hücreleri ve evlat edinen Transfer

Not: OT-ben fareler T hücre reseptör (TCR) sabit α ve β zincirleri birlikte OVA, IMMUNO-baskın peptid tanımak express transgenically oluşturulan hayvanlar vardır SIINFEKL10,11. Sonuç olarak, bu fareler SIINFEKL özgü CD8 oldukça yüksek bir dizi var+ T hücreleri normal ya da OVA aşı fareler (≤ % 1)13ile karşılaştırıldığında (%97)12 .

  1. İzlenebilir CD8 yalıtım+ T hücreleri OT-ben fareler T lenfosit özgü Thy1bir (Thy1.1) gen ifade:
    1. 6-9 haftalık OT ötenazi-ben fare CO2 Solunduğunda servikal çıkığı14tarafından takip. Cerrahi makas, cerrahi pense ve forseps yardımıyla vücut cilt ayırma ile deri kesim tarafından dalak ve büyük lenf düğümleri (sadece kasık, aksiler ve servikal çiftleri) teşrih ve yer onları Petri yemekler (60 x 15 mm) içeren her bir 100 µm gözenek kafes Kupası doku bileme ve hücre serbest bırakılması için.
    2. Buzda muhafaza tam RPMI Orta (RPMI 1640, % 10 v/v FCS, 100 U/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin) 3-5 ml Petri yemekler (her bir kafes Kupası) korumak.
    3. Organları bir şırınga dalgıç veya benzer bir steril aleti yardımıyla püre (önceki kesme gerekli değildir) ve 15 mL santrifüj tüpleri elde edilen tek hücre süspansiyon toplamak.
    4. Hücre süspansiyon vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. 10 mL soğuk PBS hücrelerde Santrifüjü tarafından yıkama ve dalak üzerinden eritrositler pelet 1 mL/dalak amonyum klorür arabelleği (ACK arabellek, piyasada bulunan) yeniden askıya tarafından parçalayıcı. Buz üzerinde 1,5 dk için hücreleri kuluçkaya ve daha sonra (daha önce yapılan gibi) Santrifüjü tarafından 10 mL soğuk PBS hücrelerle yıkayın.
    5. Pelet PBS (pH 7.2) içeren % 5 fetal Sığır serum Manyetik izolasyon için 1 mL aynı tüpte yeniden askıya.
  2. Manyetik izolasyon gerçekleştirmek için CD8 negatif seçime devam etmek+ T hücreleri üretici yönergelerine uygun bir manyetik izolasyon kit kullanarak veya iletişim kuralları15yayınlandı.
  3. CFSE boyama gerçekleştirmek için önce CD8 saymak+ T hücreleri elde OT-ben fare bir otomatik hücre sayaç (parçacık counter) kullanarak. 1-5 x 107 hücre/mL 5 mikron PBS CFSE 15 ml şahin tüp ışıkta korunuyorsunuz 37 ° C'de 7 dakika ile 1-5 mL hacminde leke.
  4. Hücrelere fetal Sığır serum aynı cilt (1:1) ekleyerek CFSE boyama gidermek ve onları ışıktan korunan 37 ° C'de ek 7 min için kuluçkaya. PBS 10 mL hücrelerle iki kez yıkayın.
  5. Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. 3-5 x 106 hücreler/fare 100 µL intravenöz enjekte için 3-5 x 107 hücre/mL PBS için cep numarasını ayarla (IV) kuyruk damar yolu ile.
  6. Kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirmek için uygun restrainers farelerde hareketsiz. Sıcak arka alan ve kuyruk farelerin 20-25 cm uzakta fare kuyruğu ven vazodilatasyon izin vermek 1-3 dakika arasında bir kırmızı ışık lamba kullanarak enjekte edilir.
    Not: Bu kolaylığı ven algılama ve hücre süspansiyon yönetimi için yardımcı olur.
  7. (Eliyle fareler ve lamba arasında yer) sağlamak değil de fareler için sıcak ve kuyruk damarları açıkça izlenebiliyor, enjeksiyon için devam olduğunu. Hücreleri bir 1 mL şırınga ile 25'lik iğne16kullanarak yan veya dorsal kuyruk damar içine enjekte.

2. aşılama (+/-adjuvan OVA Endo-ücretsiz)

  1. OT ile nakledilen fareler koyun-hücreleri (adım 1.7, Şekil 1) bir anestezi odasında ve bir anestezi makinesi14tarafından isoflurane oksijen yönetmek.
  2. Ne zaman fare anestezi altında tamamen uyuyor, odasından çıkar ve temiz enjeksiyon gerçekleştirmek için bir elektrikli saç kesme makinesi kullanarak gluteus superficialis (yanal alt sırt) alan üzerinde fare kürk tıraş uygulama alanını iyi bir görünüm ile.
  3. Aşının, SC 25'lik iğne kullanarak traş alanında 50 µL enjekte.

3. yalıtım lenfositleri ve Akış Sitometresi Analizi için boyama

  1. Yalıtım lenfositleri ve splenocytes
    1. Aşı fareler tarafından servikal yerinden çıkması takip CO2 Solunduğunda ötenazi.
    2. Boşaltma ve uzak lenf düğümleri ve dalak ayıklamak ve ayrı Petri yemeklerinde 100 µm gözenek örgü bardak doku bileme ve hücre serbest bırakılması için içeren koyun. 1.1.2 1.1.3 aracılığıyla adımları.
    3. Süpernatant Santrifüjü sonra dikkatle boşaltmak ve hücre granül (yaklaşık 100 µL) kalan PBS aynı birimdeki yeniden askıya alma.
  2. Akış Sitometresi Analizi için boyama
    1. Tablo 1' de tasvir konsantrasyonlarda boyama antikorlar içeren bir ana karışımı bir 15 mL santrifüj tüpü hazırlayın, böylece 2 x verimli boyama mix yoğunlaşmıştır. Yeterli hacim örnek başına 100 µL için ana karışımı hazırlayın. Mix hücreleri ve ana mix 1:1 ve 30 dk için 4 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Son boyama hacim örnek başına 200 µL (hücre Pelet + 100 µL antikor ana Mix 100 µL) olmalıdır.
    2. Hücreleri tarafından iki kez aralıklarla iki kez PBS, 10 mL ekleme 1.1.3 içinde açıklandığı gibi yıkayın.
    3. 0.5-1 lekeli hücreleri yeniden askıya PBS mL toplama ve transferi akış sitometresi tüpler süspansiyon. Her zaman buz üzerinde örnekleri tutmak ve ışıktan korunan.

4. akış sitometresi

  1. Her zaman 70-100 µm filtreleri kullanarak hücre örnekleri ön filtre.
  2. Tek boyama tazminat denetimleri tablo 1 (boncuk veya hücreleri) ayrıntılı fluorophores için hazır olun.
    Not: Tazminat sitometresi veya analiz yazılımı17,18,19 yılında gerçekleştirilen ve tüm örnekler için uygulanan gerekir.
  3. Şekil 2' de tasvir gating strateji izleyin. Kısaca, kapı nüfus ileri dağılım yüksekliği ileri dağılım alanı (Şekil 2A) ve tekrar yan yan dağılım alanı (SSA, Şekil 2B) birini dışlamak için geniş dağılım vs.
  4. Kapı BV 650 (auto-floresan) vs FITC (CFSE) doğru CFSE ayırımcılık için komplo tarafından Şekil 2B popülasyondan yüksek otomatik floresan hücreleri hücrelerden lekeli. Boncuk veya BV 650 için tazminat denetimlere Birleşik antikor ile lekeli hücreler içerir. Bu arsa (Şekil 2C) BV 650 vs FITC OT kapı için kullanılır-ben CFSE hücreleri lekeli.
  5. Şekil 2 c nüfus için Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) APC (CD8) vs vs alıcı fareler donörden türetilmiş hücre ayırmak için kapı.
    Not: Hücreleri OT türetilmiş-ben donör fareler WT (C57BL/6, alıcı) hücrelerin farelerde elde edilen Thy1.2+ (CD90.2) (Şekil 2B) ise Thy1.1+ (CD90.1), değildir. Bazı laboratuvarlar OT var-ben bir Thy1.2 arka plan ve WT (C57BL/6) bir Thy1.1 içinde fareler. Bu durumda Thy1.2 karşı antikor OT için kullanmak zorunda-geçişi hücre.
  6. CD8 yeniden kapı+ hücreleri Thy1.1+ popülasyondan APC (CD8) BV 450 (CD4) oluşan bir kapıya komplo tarafından (Şekil 2E).
  7. CD8 çubuk grafik görünümünü kullanarak Şekil 2E içinde geçişli nüfus görüntülemek+ CFSE (FITC, 530/15 Kanal - mavi lazer-), gösterilen hücre kapısı proliferated nüfus yoğunluklarını 10 dahil ederek2 düzeyine kadar nerede bölünmemiş denetim nüfus (yoğunluklarda ~ 105, CFSE boyama ve akış sitometresi voltaj ayarı etkinliğini bağlı olarak) vardır (Şekil 2F).
  8. Ölü hücreleri paralel yayılması değerlendirme olarak değerlendirmek amacıyla bir ek Kapısı (Şekil 2 değil görüntülenen) çizim FITC vs L/D işaretleyici (450/20 kanal, UV Lazer) olun.
  9. Tazminat denetimleri için en az 5000 olaylar ve 10.000 olayları (gate E, Şekil 2) bir akış sitometresi adlı örneklerinden elde etmek. Düşük veya orta akış sitometresi çalıştırmak (20.000 olaylar/s akış hızı fazla olamaz).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adjuvan (ADJ1 ve ADJ2) farklı bir birleşimini kullanarak uygulamaları test etmek için biz CTL üretimi kapasitesi adoptively transfer edilen OT yayılması ölçerek değerlendirildi var-ben CD8+ T hücreleri tarafından akış sitometresi (Şekil 2). Bunun için biz daha önce drenaj lenf düğümleri ve dalak (Tablo 1) izole hücrelerden lekeli. CD8 yayılması ölçme tarafından+ T hücreler lenf düğümleri ve dalak, biz daha yüksek CTL üretimi kapasitesi ADJ2 drenaj lenf nodlarında (Şekil 3) göre ADJ1, OVA yalnız veya PBS denetime teyit başardık. Buna ek olarak, biz ADJ2 sistemik bir kompartımanda (dalak) bir CTL yanıt üretmek mümkün değildi, oysa ADJ1 dalak CD8 tarafından proliferasyon gösteren yüksek düzeyde+ T hücreleri değil, gözlemledim sadece denetimleri (PBS ve OVA) ama aynı zamanda üstün karşılaştırıldığında ADJ1 için. Bu hızlı vivo içinde yayılması tahlil kullanarak eylem ADJ2, anatomi, güçlü eylem sistemik bir CTL jeneratör değil ama bir yerel olarak teyit edebilir. Ayrıca, ADJ1 enjeksiyon (drenaj lenf düğümleri) yerel sitesinde her ikisi de gibi sistemik ile artan bir OT davranır-ben dalak içinde yayılması. Elde edilen sonuçlar adjuvan'ın faaliyet ve ölçüde gözlenen etkileri ADJ2 (yerel) ve ADJ1 (sistemik) tarafından örneği kendi karakterize sağlamak.

Figure 1
Şekil 1: tahlil zaman çizelgesi. Tahlil zaman çizelgesi ilk OT temsil eder-Ben T hücre gün gün 1, 0, SC aşı ve örnekleme dalak ve lenf bezleri 2 gün sonra boşaltma aktarma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: akış diyagramı gating strateji takip CD8 yayılması ölçmek için+ T hücreleri (OT-ben Thy1.1+) tarafından akış sitometresi. İki örnek daha iyi görüntüleme için farklı renklerde (kırmızı ve açık mavi) temsil edilir. A-b Tek hücre birini ilk iki Gates'te art arda gelen ileri dağılım yükseklikte vs ileri dağılım alanı ve geniş dağılım yan yan dağılım alanı vs komplo tarafından ayrımcılığa. C. B geçitli hücreler (hücre bölümler/nükleer silahların yayılmasına karşı azalmak burada gösterir) onların CFSE yoğunluk 530/30 YG kanaldaki karşı çizilen onların floresans yoğunluklarda BV 650 kanal (otomatik floresans) tarafından görüntülenir. Bu kapıyı ayrımcılık tarafından doğru CFSE pozitif hücre seçimini sağlar yüksek otomatik floresans sahip olanlar. Ö CFSE pozitif hücrelerinin Pe-Cy7 onların yüksek floresan yoğunluğu ile geçişli (Thy1.1, OT için işaretleyici-ben hücreleri) kendi APC yoğunluğu (CD8) vs. E. BV APC (CD8) karşı için daha önce çizilen 450 (CD4) Thy1.1 pozitif hücrelerinin doğru CD8 seçmek için geçişli+ T hücreleri. F. daha önce geçişli CD8+ hücreleri çizilen bir histogram sonunda proliferated nüfus kapı için CFSE yoğunluk karşı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: CTL üretimi tahrik adjuvan. Lokal veya sistemik CTL yanıt-e doğru çıkarmak için yetenek 2 farklı adjuvan tedavi (ADJ1 ve ADJ2) antijen ve PBS denetimleri için tasvir edilir. Adoptively aktarılan OT yayılması-ı T hücreleri muayene drenaj lenf nodu (inguinal örneği subkutan (SC) yönetim için) ve dalak, şekil satırlarda belirtildiği gibi. Hücre çoğalması ilgili tüm tedavilerde (sütunlar) doğru ölçüde bağışıklık yanıtının karşılaştırmak üzere yerel (drenaj lenf nodu) veya eylem sistemik (dalak) aralığı içinde ölçülür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Boya - antikor Klon Fluorophore/kanal-filtre Konsantrasyon 2 X
Thy1.1 (CD90.1) HIS51 PE-Cy7-780/60 YG 1:750
CD8 53-6,7 APC - 670/14 R 1:280
CD4 RM4-5 BV 421-450/50 V 1: 100
CFSE - FITC - 530/30 YG (CFSE boyama protokole göre)
DCM (ölü hücre Marker) - -/ ULTRAVİYOLE - 450/50 UV 1:500

Tablo 1: akış sitometresi için antikor stainings. Fluorophore-Birleşik antikor klonlar kullanılan ve konsantrasyonları (2 x) boyama önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Modern aşılar ideal Avusturyalıanti arıtılmış antijen ve adjuvan lipozomlar, virüs gibi parçacıklar, nano tanecikleri veya canlı vektörel çizimler gibi bir iletim sistemi mümkün ilavesi ile vardır. Bir aşı tasarlarken önemli bir yönü klinik gereksinimlerinize uygun bir doğru adjuvan seçmektir. Kapsamı parçası humoral ve hücresel immün yanıt (veya her ikisi), sistemik bir immün yanıt (veya her ikisi) vs yerel seçim ve aşı hedef popülasyon oluşturmak için gereken bellek tür lehine içerebilir. Bir önemli yönü adjuvan değerlendirilmesi hızla CTL oluşturmak için kapasitesini tespit etmektir. Biz burada hızla OT ölçerek CTL yanıt vivo içinde bir fare modeli özelliklerini belirlemek için zaten bilinen teknikleri dayalı bir yöntem sundu-ı CD8 T hücre çoğalması. Bu yöntem için tahmin adjuvan tarafından elde edildi bağışıklık yanıtının potens sağlar (OT yayılması-ı T hücreleri) sadece 4 iş günü içinde. Bu yöntem daha fazla etkili eylem ve eylemler adjuvan immün yanıt (yerel sistemik vs) açısından karşılaştırılması kolaylaştırır. Burada, bir örnek farklı adjuvan tedavi (ADJ1 vs. ADJ2) aşı bağışıklık yanıtı nasıl etkileyeceğini göstermiştir. ADJ2 eylem nerede bağışıklık yanıtı drenaj lenf nodlarında etkinleştirir yerel yönetim ile sınırlı iken ADJ1 eylemiyle aynı doz daha yaygın bir CTL yanıt hem yerel ve sistemik düzey ama üretme drenaj lenf nodlarında ADJ2 daha az güç ile.

Bir adjuvan'ın CTL kapasite başarılı değerlendirilmesi için kritik adımlar genç OT seçenek var-Ben hayvanlar (olarak bir kaynak CD8 T hücreleri) ve OVA endotoksin ücretsiz kullanım bağışıklama için. OT beri-ben fareler transjenik hayvanlar OVA peptid SIINFEKL bir MHC içinde tanımak CD8 T hücreleri üretmek için oluşturulan değildir-Ben bağlam, onun yapay seçilim fare TCR artırır hiper proliferatif CD8 görünüşü+ T hücreleri20 yaş ile. Bir aksiler lenf düğümleri iltihabı böylece yaşlı OT, daha yaygın bir özelliğidir-ben fare. Bu dikkate alarak, bu genç OT kullanmak için tavsiye edilir-Ben hayvanlar mümkün olduğunda (6-9-hafta-yaşlı hayvanlar) hücrelerden herhangi yalıtma önlemek için organları (lenf nodlarının ya dalak) genişlemiş. Büyük olasılıkla nükleer silahların yayılmasına karşı kontrol eder ve tedaviler arasındaki farkları elde değil bu yana Proliferasyona CD8 T hücreleri ile genişlemiş organları kullanımı tüm tahlil etkiler. Adjuvan CTL üretimi kapasitesi ayrımcılık için benzer bir hatadır endotoksin-Alerjik OVA21,22 (bkz: kıyasla daha güçlü bir bağışıklık yanıtı temin endotoksin izleri ile OVA protein kullanarak oluşturulabilir Malzemeler ve kimyasalları), endotoxins güçlü IMMUNO-modülatörler başına 23olduğundan. Bu nedenle, bağışıklama için kullanılan OVA protein endotoksin-Alerjik olması gerekir. Endotoksin-Alerjik OVA, 20 veya 50 µg kullanımı bağışıklama yolun 50 µg subkutan adjuvan test etmek için uygun bir doz varlık bağlıdır. Ayrıca, CFSE yüksek konsantrasyonda kullanımı literatürde24 lekeli hücreleri öldürmek için bildirilen ve ayrıca tahlil sonucu başarısızlık olabilir.

Bazı değişiklikler veya ilerleme-e doğru farklı teknikleri iletişim kuralında kullanılan deney tekrarlanabilirlik artırmak için hayvanlar, stresi azaltmak için uygulamaya edildi. Örneğin, sadece arka ve kuyruk fareler ve tüm hayvan değil Isıtma tarafından Isıtma hayvanların en aza indirmek için veya subkutan enjeksiyon önlemek için stres aşılama önce hayvanlar anesthetizing tarafından ilgili. Anestezi gerekli değildir tarafından hayvan refahı düzenlemeleri Subkutan Enjeksiyon için ama bizim deneyim, tekrarlanabilirlik stres tepkisi tarafından tanıtılan varyasyonları azaltarak artırır.

Bir büyük bu yöntem CFSE hücre membran lekeleri beri onun yüksek parlaklık genellikle sitozol gelen sinyalleri tespiti bozar kısıtlamasıdır. Bu nedenle, CTL kapasite onayı gerekiyorsa, IFN γ salgılanmasını belirli salgı tahlil 25tarafından ve hücre içi sitokin boyama tarafından değerlendirilmelidir.

CTL üretimi kapasitesi adjuvan tarafından sadece 4 gün içinde tahmin etmek için nükleer silahların yayılmasına karşı ölçümü kullanımı daha kısa sürede avantajı geleneksel CTL26 deneyleri ve daha iyi bir aday durumda nerede daha fazla deneme vardır diğer yöntemler ile onay gereklidir.

OVA için bir antijen sınırlı olmasına rağmen ve bu nedenle OT kullanımı-ı T hücreleri, sunulan yöntem burada belgili tanımlık harekete geçirmek proliferated hücrelerinin sıraladıktan sonra farklı adjuvan tarafından indüklenen özelliklerini sağlar. Olası uygulamaları biridir proliferated OT içinde farklı adjuvan tarafından indüklenen metabolik imzalar incelenmesi-ı T hücreleri ve bellek27gelişimi ile ilişkileri. Ek ikincil gösterimleri uyarılmış hücreler sitokinler veya akış sitometresi tarafından degranulation işaretleri veya sitotoksik kapasitelerini içinde vivo CTL testleri8, yaparak ifade gibi biyolojik özelliklerini değerlendirmek olabilir 26 , 28. Bu uygulama farelerde kullanımı sınırlama olduğundan, insanlar için tahminlerim kötüye gösterimleri insanlaşmış fareler29,30,31tarihinde dayalı tarafından gerçekleştirilebilir.

Bu yöntem ilk tarama olarak hücresel yanıt aktivatörleri seçimi için kullanılmak üzere sağlam ve değiştirilebilir veya proliferated T hücrelerinin daha fazla çözümleme için birleştiğinde için yeterince esnek Ayrıca biz burada sundu gibidir. Özet olarak, bu hızlı içinde vivo değerlendirme adjuvan CTL oluşturma kapasitesinin eylem onların adjuvan aday moleküllerin modu hızlı bir karakterizasyonu ilgilenen aşı laboratuvarlarda Akademi ve sanayi için ideal bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz bizim teknik görevlileri için borçlu bulunmaktadır: U. Bröder ve H. Shkarlet, deneysel işlemler sırasında bize yardım etti. Bu eser kısmen EU hibe (sözleşme UniVax, Sözleşme No 601738 ve TRANSVAC2, No. 730964) ve bir Helmholtz Derneği hibe (HAI-IDR) tarafından finanse edildi. Finansman kaynakları araştırma etkilemek değil tasarım, makale veya yayın için göndermek için karar nesil.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer BD Special Order Flow Cytometer
CFSE Molecular Probes C34554 Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit Biolegend 480007 Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Molecular Probes L23105 Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 eBioscience 25-0900-82 antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100712 antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 BD 740007 antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer Beckman Coulter 9914591DA Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) Hyglos(Germany) 321000 Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon Corning 352360 Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials Beckman Coulter 899366014 Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2) Harlan (Rossdorf, Germany) Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) Harlan (Rossdorf, Germany) Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes Fischer (Corning) 14-959-5 Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes Fischer (Corning) 05-527-90 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL) Fischer (Gibco) 20-012-027 Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp) Dirk Rossmann GmbH (Germany) 405096 Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane) Abbott Laboratories (USA) 5260.04-05. Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber Parkland Scientific V3000PK Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium Gibco (distributed by ThermoFischer) 11-875-093 Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 15-140-148 Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 10082147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml) Gibco (distributed by ThermoFischer) A1049201 Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes Nunc (distributed by ThermoFischer) 150340 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter CellTrics (Sysmex) 04-004-2317 CellTrics® 50 μm, sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
  2. Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
  3. Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
  4. Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
  5. Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
  6. Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
  7. Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
  8. Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
  9. Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
  10. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  11. Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
  12. Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
  13. Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
  14. Otto, K. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 555-569 (2004).
  15. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (2016).
  16. Shimizu, S. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 527-542 (2004).
  17. Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
  18. Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).
  19. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
  20. Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
  21. Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
  22. Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. L54-L63 (2012).
  23. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
  24. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. 79-85 (2009).
  25. Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
  26. Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
  27. O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
  28. Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
  29. Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
  30. Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
  31. Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
Adjuvan'ın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı <em>Vivo içinde</em> değerlendirilmesi için aşı geliştirme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).More

Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter