Vi presenterar här en ansökan om en standardiserad immunologisk teknik (CFSE målat OT-jag spridning) avsedd att snabbt övervaka adjuvant-medierad cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) generation invivo. Detta snabb uppskattning av CTL kapacitet är användbar för utveckling av profylaktiska vacciner mot intracellulära patogener samt terapeutiska cancervacciner.
Bedömning av moderna underavdelning vacciner avslöjar att generationen av neutraliserande antikroppar är viktigt men inte tillräckligt för adjuvant urval. Därför behövs omgående adjuvans med både humorala och cellulära immun-stimulerande funktioner som klarar främja cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) svaren. Således, trogen övervakning av adjuvant kandidater som inducerar cross-grundning och därefter förbättra CTL generation utgör ett avgörande steg för utvecklingen av vaccin. Här presenterar vi en ansökan om en metod som använder SIINFEKL-specifika (OT-jag) T-celler att övervaka cross-presentationen av modellen antigenet ovalbumin (OVA) i vivo i närvaro av olika adjuvant kandidater. Denna metod representerar en snabb test att välja adjuvans med bästa cross-priming kapacitet. Spridningen av CD8+ T celler är mest värdefulla indikeringen av cross-grundning och det är också betraktas som ett korrelat av adjuvant-inducerad cross-presentation. Denna funktion kan bedömas i olika immun organ som lymfkörtlarna och mjälten. Omfattningen av den CTL generationen kan också övervakas, vilket ger insikter på en lokal karaktär (dränerande lymfkörtel främst) eller en systemisk reaktion (avlägsna lymfkörtlar och mjälte). Denna teknik ytterligare gör flera ändringar för att testa läkemedel som kan hämma specifik cross-presentation vägar och erbjuder även möjligheten att användas i olika stammar av konventionella och genetiskt modifierade möss. Sammanfattningsvis, vilja det program som vi presenterar här vara nyttig för vaccin laboratorier i näringslivet eller den akademiska världen att utveckla eller ändra kemiska tillsatsmedel för vaccinforskning och utveckling.
Cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) inducera vacciner är viktiga terapeutiska interventioner som har utvecklats för att bekämpa vissa typer av cancer1. CTL är också viktiga för profylaktiska vacciner mot intracellulära patogener2. CTL är dessutom en av de få immuna försvar mekanismerna funktionellt aktiva i riskgrupper såsom nyfödda3,4 , vilka också är beroende av CTL att bekämpa tidiga liv infektioner5. I detta avseende resulterade vacciner mot Respiratory Syncytial Virus (RSV) som har utvecklats med ett adjuvans som inte framkallar CTL svaren (Alun) i ett totalt misslyckande av vaccinet leder till allvarliga komplikationer vid infektioner i spädbarn6. Dessa negativa effekter av vaccination kan vändas genom en CD8+ T-cell svar7. Vi har tidigare visat att de viktigaste cytokiner (typ I interferoner) framkallas av vissa stimulator av interferon gener (STING)-agonister är avgörande för CTL Svaren genereras av dessa tillsatser8, delvis genom att mäta spridningen av OT-I T-celler efter vaccination och med dessa resultat som ett mått på CTL inducerande kapacitet hos extended vaccination scheman9. Mätning av spridning av OT-jag CD8+ T-celler i en vildtyp (WT) C57BL/6 mottagare mus av carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) dye utspädning är en robust uppskattning av adjuvans vaccin förmåga att generera Cross-priming av SIINFEKL, (immuno-dominerande peptiden av äggalbumin, ägg). Varianter av denna teknik används för bedömning av spridningen av OT-jag CD8+ och OT-II CD4+ T celler. Det har exempelvis använts i avsaknad av valda cytokiner (KO möss) eller att mäta vaccinets effekt efter antigen minns i WT djur. Vi tagit fram ett kort protokoll (4 dagar experiment) där efter passiv överföring av CFSE-färgade OT-jag CD8+ T celler, en subkutana (s.c.) immunisering som består av en dos av 50 µg av endotoxinfria OVA kompletteras med test adjuvans administreras (Figur 1). Uppföljningen av resultaten 48 h efter vaccination ger ett tillförlitligt bevis på adjuvant förmåga att generera CTL svaren. Genom denna strategi är det möjligt att bedöma styrkan hos det lokala immunsvaret i dränerande lymfkörteln efter immunisering samt omfattningen av svaret genom att mäta aktiviteten CTL i mjälte (eller avlägsna lymfkörtlar).
Moderna vacciner är idealiskt composedof renat antigen och adjuvans, med eventuella tillägg av ett leveranssystem som liposomer, virusliknande partiklar, nanopartiklar eller levande vektorer. En viktig aspekt när du utformar ett vaccin är att välja rätt adjuvans enligt kliniska behov. En del av tillämpningsområdet kan innebära gynnar en humorala vs. cellulära immunsvaret (eller båda), valet av en lokal vs. en systemisk immunsvar (eller båda) och typ av minne som vaccinet måste generera i målpopulationen. En…
The authors have nothing to disclose.
Vi står i skuld till våra tekniska assistenter: U. Bröder och H. Shkarlet, som hjälpt oss under experimentella rutiner. Detta arbete har delvis finansierats av EU-bidrag (UniVax, kontrakt nr 601738 och TRANSVAC2, kontrakt nr 730964) och Helmholtz föreningen bidrag (HAI-IDR). Finansiering källor påverkade inte forskningen design, generation av manuskript eller beslutet att lägga fram det för publicering.
BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |