Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Snelle In Vivo beoordeling van adjuvante van cytotoxische T-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling

doi: 10.3791/57401 Published: June 19, 2018

Summary

Wij presenteren hier een aanvraag voor een standaard immunologische techniek (CFSE gekleurd OT-ik proliferatie) willen snel controleren adjuvans-gemedieerde cytotoxische T lymfocyten (CTL) generatie in vivo. Deze snelle inschatting van CTL capaciteiten is nuttig voor de ontwikkeling van profylactische vaccins tegen intracellulaire pathogenen, alsmede therapeutische kanker vaccins.

Abstract

Dat de generatie van neutraliserende antilichamen belangrijk, maar niet voldoende voor adjuvante selectie is, zo blijkt uit de evaluatie van moderne subeenheid vaccins. Hulpstoffen met zowel de humorale als de cellulaire immuno-stimulerende mogelijkheden die kunnen bevorderen van cytotoxische T-lymfocyten (CTL) Reacties zijn daarom dringend noodzakelijk. Dus, trouwe monitoring van adjuvante kandidaten, die cross-priming induceren en vervolgens verbeteren CTL generatie vertegenwoordigt een cruciale stap in de ontwikkeling van een vaccin. Hier presenteren we een aanvraag voor een methode die SIINFEKL-specifieke gebruikt (OT-ik) T-cellen om te controleren de Kruis-presentatie van het model antigeen ovoalbumine (OVA) in vivo in aanwezigheid van verschillende adjuvans kandidaten. Deze methode geeft een snelle test om te selecteren met de beste mogelijkheden voor cross-priming hulpstoffen. De proliferatie van CD8+ T cellen is de meest waardevolle indicatie van cross-priming en het wordt ook beschouwd als een correlaat van adjuvans-geïnduceerde Kruis-presentatie. Deze functie kan worden geëvalueerd in verschillende immuun organen zoals lymfklieren en de milt. De omvang van de CTL generatie kan ook worden gecontroleerd, waardoor inzichten over de aard van een lokale (drainage lymfeklier voornamelijk) of een systemische aanpak (verre lymfeklieren en/of milt). Deze techniek verder maakt het mogelijk meerdere wijzigingen voor het testen van de drugs die specifieke Kruis-presentatie-trajecten kunnen remmen en biedt ook de mogelijkheid om te worden gebruikt in verschillende stammen van conventionele en genetisch gemodificeerde muizen. Kortom, zal de toepassing die wij hier presenteren nuttig voor vaccin laboratoria in industrie of academici die ontwikkelen of aanpassen van chemische hulpstoffen voor vaccin onderzoek en ontwikkeling zijn.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cytotoxische T-lymfocyten (CTL) inducerende vaccins zijn belangrijke therapeutische interventies die zijn ontwikkeld ter bestrijding van bepaalde soorten kanker1. CTL zijn ook belangrijk voor profylactische vaccins tegen intracellulaire pathogenen2. Bovendien, CTL zijn een van de paar immuun afweermechanismen functioneel actief in risicogroepen zoals pasgeborenen3,4 , wie ook afhangen van CTL ter bestrijding van vroege leven infecties5. In dit verband resulteerde vaccins tegen het respiratoir syncytieel Virus (RSV) die zijn ontwikkeld met adjuvans die niet CTL Reacties (aluin uitlokken doet) in een complete mislukking van het vaccin leidt tot ernstige complicaties op infecties bij zuigelingen6. Deze negatieve effecten van vaccinatie kunnen worden teruggedraaid door een CD8+ T cel reactie7. Wij hebben eerder aangetoond dat de belangrijkste cytokines (type ik interferon) ontlokte door sommige stimulator van interferon genen (STING) agonisten essentieel voor de reacties van de CTL gegenereerd door deze hulpstoffen8, gedeeltelijk zijn door het meten van de proliferatie van OT-ik T cellen na vaccinatie en het gebruik van deze resultaten als een maatregel van CTL inducerende mogelijkheden waargenomen uitgebreid vaccinatie schema's9. De meting van de proliferatie van OT-ik CD8+ T cellen in een wild type (WT) C57BL/6 ontvangende muis door carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) kleurstof verdunning is een robuuste schatting van het vermogen van de adjuvante van een vaccin voor het genereren van Kruis-priming van SIINFEKL, (de immuno-dominante peptide van ovoalbumine, eicellen). Variaties van deze techniek worden veel gebruikt voor de beoordeling van de proliferatie van OT-ik CD8+ en OT-II CD4+ T cellen. Bijvoorbeeld, is het gebruikt in de afwezigheid van geselecteerde cytokinen (KO muizen) of voor het meten van de doeltreffendheid van het vaccin na antigeen in dieren WT recall. We een korte protocol (4 dagen experiment) bedacht waarin na passieve overdracht van CFSE gebeitste OT-ik CD8+ T cellen, een onderhuidse (SC) immunisatie bestaande uit één dosis van 50 µg endotoxine-vrije eicellen aangevuld met test hulpstoffen wordt beheerd (Figuur 1). De follow-up van de resultaten 48 h na de vaccinatie biedt een betrouwbare bewijs van hoedanigheid van de adjuvante voor het genereren van CTL reacties. Door deze strategie is het mogelijk om te beoordelen van de potentie van de lokale immuunrespons in de zuig lymfeklier na immunisatie, alsmede de omvang van het antwoord door het meten van de activiteit van de CTL in de milt (of verre lymfeklieren).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle muizen gebruikt in deze studie werden van de C57BL/6-achtergrond. Alle dieren werden gehouden onder omstandigheden pathogenen vrije. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de normatieve van de Duitse dierenbescherming wet (TierSchG BGBl. IK S 1105; 25.05.1998) en zijn goedgekeurd door de lagere Saksen Commissie de ethiek van dier experimenten en het Bureau van de staat (lagere Saksen staat Office van bescherming van de consument en voedselveiligheid), onder nummer van de vergunning 33,4-42502-04-13/1281 en 162280.

1. CFSE-verkleuring van de OT-ik T cellen en adoptief overdracht

Opmerking: OT-ik muizen zijn transgenically gegenereerde dieren die uitdrukking geven aan een T-cel receptor (TCR) met vaste α en β-ketens die elkaar de immuno-dominante peptide van eicellen herkennen, SIINFEKL10,11. Dientengevolge, deze muizen hebben een aanzienlijk hoge aantal SIINFEKL-specifieke CD8+ T cellen (97%)12 in vergelijking met normale of eicellen-gevaccineerde muizen (≤ 1%),13.

  1. Isolatie van traceerbaar CD8+ T cellen van OT-ik muizen uiting van T-lymfocyten-specifieke Thy1een (Thy1.1)-allel:
    1. Euthanaseren van 6-9 weken oud OT-ik muizen door CO2 inademing gevolgd door cervicale dislocatie14. Ontleden van de milt en de grote lymfklieren (alleen voor inguïnale, de axillaire en de cervicale paren) door het snijden van de huid met een chirurgische schaar, los van de huid van het lichaam met behulp van chirurgische Tangen en pincet en plaats ze in petrischalen (60 x 15 mm) elk met een 100 µm porie mesh cup weefsel slijpen en cel vrijlating.
    2. Petrischalen (elk met één net kopje) in 3-5 mL van volledige RPMI medium (RPMI 1640 10% v/v FCS, 100 U/mL penicilline, 50 µg Mo/mL streptomycine) gehouden op het ijs bijhouden.
    3. Prak de organen met behulp van een zuiger van de spuit of een soortgelijk steriele instrument (vooraf snijden is niet nodig) en de resulterende eencellige suspensie in 15 mL centrifuge buizen te verzamelen.
    4. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Wassen van de cellen in 10 mL koude PBS door centrifugeren en lyse van de erytrocyten van de milt door opnieuw het opschorten van de pellet in 1 mL/milt van ammoniumchloride buffer (ACK buffer, verkrijgbare). Incubeer de cellen gedurende 1,5 minuten op ijs en vervolgens de cellen met 10 mL koude PBS wassen door middel van centrifugeren (zoals eerder gedaan).
    5. Resuspendeer de pellet in de dezelfde buis in 1 mL PBS (pH 7,2) met 5% foetale runderserum voor magnetische isolatie.
  2. Voor het uitvoeren van magnetische isolatie, gaat u verder met de negatieve selectie van CD8+ T cellen met behulp van een magnetische isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant of protocollen15gepubliceerd.
  3. Voor het uitvoeren van CFSE kleuring, eerst het aantal CD8+ T cellen verkregen OT-ik muizen door middel van een geautomatiseerde cel itemlogboeken (particle counter). Vlek 1-5 x 107 cellen/mL in een volume van 1-5 mL met 5 µM CFSE in PBS gedurende 7 minuten bij 37 ° C, beschermd tegen licht in een tube van 15 ml falcon.
  4. Doven de kleuring van de CFSE door een gelijk volume (1:1) foetale runderserum toe te voegen aan de cellen, en hen uit te broeden voor extra 7 minuten bij 37 ° C beschermd tegen licht. De cellen met 10 mL PBS tweemaal wassen.
  5. Met behulp van een geautomatiseerde cel counter cellen tellen. Het celaantal intraveneus injecteren van 3-5 x 106 cellen/muis in 100 µL instellen op 3-5 x 107 cellen/mL PBS (i.v.) via de ader van de staart.
  6. Immobiliseren standaardinteracties staart ader injecties, de muizen in passende fixeren. Warm de rug en staart van de muizen te worden geïnjecteerd met behulp van een rood-licht lamp, geplaatst tussen 20 tot 25 cm afstand van de muizen voor 1-3 min. toe staart ader vasodilatatie.
    Opmerking: Hiermee kunt u gemak ader detectie en beheer van de celsuspensie.
  7. Zorgen (met de hand geplaatst tussen de muizen en de lamp) dat het niet is te warm voor de muizen en wanneer de staart aderen duidelijk zichtbaar zijn, gaat u verder met injectie. Het injecteren van de cellen in de ader van de laterale of dorsale staart met behulp van een spuit van 1mL met een 25-meter naald16.

2. immunisatie (Endo-vrije OVA +/-adjuvans)

  1. Plaats de muizen getransplanteerde met OT-ik cellen (stap 1.7, Figuur 1) in een kamer van anesthesie en beheren van Isofluraan in zuurstof door een verdoving machine14.
  2. Wanneer de muis volledig in slaap onder verdoving is, neem het uit de kamer en het scheren van de vacht van de muis op het gebied over de gluteus superficialis (laterale onderrug) met behulp van een elektrische haar trimmen machine, om te kunnen uitvoeren van een schone injectie met een goede weergave van de module.
  3. 50 µL van het vaccin, s.c. op de geschoren gebied met behulp van een 25-meter-naald te injecteren.

3. isolatie van lymfocyten en vlekken Stroom Cytometry p.a.

  1. Isolatie van lymfocyten en splenocytes
    1. De gevaccineerde muizen euthanaseren inademing CO2 gevolgd door cervicale dislocatie.
    2. Pak de zuig en de verre lymfklieren en de milt en plaats ze in afzonderlijke petrischalen met 100 µm porie mesh cups weefsel slijpen en cel vrijlating. Stappen 1.1.2 via 1.1.3.
    3. Giet het supernatans dat na het centrifugeren en resuspendeer de cel pellets in hetzelfde volume van restant PBS (ca. 100 µL).
  2. Kleuring voor stroom cytometry analyse
    1. Bereiden een master mix met de kleuring antistoffen in de concentraties afgebeeld in tabel 1, dus opbrengst een 2 x geconcentreerd kleuring mix in een centrifugebuis van 15 mL. Genoeg volume voor master mix hebben van 100 µL per monster te bereiden. Meng de cellen en de master mix 1:1 en laat het bij 4° C gedurende 30 minuten inwerken.
      Opmerking: De uiteindelijke kleuring volume per monster moet 200 µL (100 µL van cel pellet + 100 µL van antilichaam master mix).
    2. Wassen de cellen tweemaal door middel van centrifugeren, zoals beschreven in 1.1.3, toevoegen van 10 mL PBS, tweemaal.
    3. Resuspendeer de gekleurde cellen in 0,5-1 mL PBS voor de verwerving en overdracht de schorsing aan stroom cytometer buizen. Altijd Houd de monsters op ijs en beschermd tegen licht.

4. Stroom Cytometry

  1. Altijd vooraf filteren de celsteekproeven 70-100 µm filters gebruiken.
  2. Enkele kleuring compensatie besturingselementen voorbereiden op de fluorophores gedetailleerd in tabel 1 (kralen of cellen).
    Opmerking: Compensatie moet worden uitgevoerd in cytometer of analyse software17,18,19 en toegepast op alle monsters.
  3. Volg de gating strategie afgebeeld in Figuur 2. Kort, gate populaties in voorwaartse scatter hoogte vs. voorwaartse scatter gebied (figuur 2A), en opnieuw kant scatter breed vs. kant scatter gebied (SSA, figuur 2B) om uit te sluiten van de paren.
  4. Poort de bevolking uit figuur 2B door BV 650 (auto-fluorescentie) vs. FITC (CFSE) om te discrimineren waar CFSE gekleurd cellen uit hoge auto-belichting fluorescerende cellen. Kralen of cellen gekleurd met antilichaam geconjugeerd met BV 650 in compensatie besturingselementen bevatten. Dit perceel (figuur 2C) van BV 650 vs. FITC wordt gebruikt om de poort van de OT-ik CFSE cellen gekleurd.
  5. De bevolking van Figuur 2 C voor Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs. APC (CD8) poort om te onderscheiden cellen afgeleid van donor vs. ontvangende muizen.
    Opmerking: Cellen afgeleid van OT-ik donor muizen zijn Thy1.1+ (CD90.1), terwijl WT (C57BL/6, geadresseerden) muizen-afgeleide cellen Thy1.2+ (CD90.2) (figuur 2D zijn). Sommige laboratoria hebben OT-ik muizen in een Thy1.2 achtergrond en WT (C57BL/6) in een Thy1.1. In dit geval moet u een antilichaam tegen Thy1.2 gebruiken voor OT-ik cel gating.
  6. Opnieuw gate CD8+ cellen uit Thy1.1+ bevolking door het op een poort bestaande uit BV 450 (CD4) vs. APC (CD8) (figuur 2E).
  7. Weergeven van de bevolking in figuur 2E met behulp van de weergave van een histogram van de CD8 omheinde+ cellen weergegeven: CFSE (FITC), 530/15 kanaal - blauwe laser-, gate de verspreide bevolking door intensiteiten van 102 tot het niveau waar de onverdeelde controle populaties zijn (intensiteiten ~ 105, afhankelijk van de doeltreffendheid van de kleuring van de CFSE en de instelling van de spanning op de stroom cytometer) (figuur 2F).
  8. Het maken van een extra poort (niet weergegeven in figuur 2) plotting FITC vs. L/D marker (450/20 kanaal, UV-laser) teneinde dode cellen parallel aan de evaluatie van de proliferatie.
  9. Verwerven ten minste 5000 gebeurtenissen voor de besturingselementen van de compensatie en 10.000 evenementen (gate E, Figuur 2) van de monsters bij een stroom cytometer. Uitvoeren van de cytometer bij lage of middelgrote flow (niet hoger dan debieten van 20.000 evenementen/s).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Om te testen de behandelingen met behulp van een andere combinatie van hulpstoffen (ADJ1 en ADJ2), hebben we het productievermogen CTL beoordeeld door het meten van de proliferatie van adoptively overgedragen OT-ik CD8+ T cellen door stroom cytometry (Figuur 2). Hiervoor, we eerder gekleurd geïsoleerde cellen uit de zuig lymfklieren en de milt (tabel 1). Door het meten van de proliferatie van CD8+ T cellen in de lymfklieren en de milt, konden we bevestigen een hogere CTL opwekkingscapaciteit van ADJ2 in de zuig lymfeknopen (Figuur 3) in vergelijking tot ADJ1, eicellen alleen of PBS-controle. Daarentegen hebben wij gemerkt dat ADJ2 watertje niet kundig voor een CTL respons genereren in een systemische compartiment (milt), terwijl ADJ1 was weergegeven: hoge niveaus van kernwapens door Milt CD8+ T cellen, niet alleen ten opzichte van de besturingselementen (PBS en eicellen) maar ook superieure te ADJ1. Door de ontrafeling van het optreden van ADJ2 met behulp van deze snelle in vivo proliferatie assay, kunnen we haar sterke optreden als een lokale maar niet een systemische CTL generator bevestigen. Verder ADJ1 fungeert zowel op de lokale site van injectie (zuig lymfklieren) zo goed als systemisch met een verhoogde OT-ik proliferatie in de milt. De verkregen resultaten laten te karakteriseren van de adjuvante activiteit en haar omvang, wordt geïllustreerd door de waargenomen effecten van ADJ2 (lokaal) en ADJ1 (systemische).

Figure 1
Figuur 1: de tijdlijn assay. De assay tijdlijn vertegenwoordigt de oorspronkelijke OT-ik T cel overbrengen op dag 0, de s.c. vaccinatie op dag 1, en de milt van de bemonstering en zuig lymfklieren 2 dagen later. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: stroomschema van het gating strategie gevolgd voor het meten van de proliferatie van CD8+ T cellen (OT-I, Thy1.1+) door stroom cytometry. Twee monsters worden in verschillende kleuren (rood en lichtblauw) voor een betere visualisatie vertegenwoordigd. A-B. Afzonderlijke cellen worden gediscrimineerd van paren achtereenvolgens in de eerste twee poorten door vooruit-scatter-hoogte vs. vooruit-scatter-gebied en kant-scatter-breedte vs. kant-scatter-gebied. C. gated in B cellen worden weergegeven door hun intensiteit van de fluorescentie van BV 650 kanaal (auto fluorescentie) uitgezet tegen hun intensiteit van de CFSE (waar diming geeft cellen divisies/proliferatie) in het kanaal van de YG 530/30. Deze poort maakt de selectie van echte CFSE positieve cellen door discrimineren die hoge auto fluorescentie hebben. D. CFSE positieve cellen werden gated met hun hoge fluorescentie intensiteit van Pe-Cy7 (Thy1.1, marker voor OT-ik cellen) vs. hun APC-intensiteit (CD8). E. BV 450 (CD4) uitgezet tegen APC (CD8) voor eerder omheinde Thy1.1 positieve cellen nauwkeurig Schakel CD8+ T cellen. F. eerder gated CD8+ cellen worden getekend in een histogram tegen de intensiteit van de CFSE aan de poort tot slot de verspreide bevolking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: adjuvans gedreven CTL generatie. De mogelijkheid om lokale of systemische CTL reacties uitlokken is afgebeeld voor 2 verschillende adjuvante behandelingen (ADJ1 en ADJ2) langs de antigeen- en PBS-besturingselementen. De verspreiding van de adoptively overgedragen OT-ik T cellen wordt onderzocht in de zuig lymfeknoop (inguïnale, voor de blijkt onderhuidse (SC) administratie) en in de milt, zoals aangegeven in de figuur rijen. De celproliferatie wordt gemeten in alle relevante behandelingen (kolommen) om het nauwkeurig vergelijken van de omvang van de immuunrespons in haar lokale (zuig lymfeklier) of systemische (milt) bereik van actie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Kleurstoffen - antilichamen Kloon Fluorophore/kanaal-filter Concentratie 2 X
Thy1.1 (CD90.1) HIS51 PE-Cy7-780/60 YG 1:750
CD8 53-6,7 APC - 670/14 R 1:280
CD4 RM4-5 BV 421-450/50 V 1:100
CFSE - FITC - 530/30 YG (volgens CFSE-kleuring protocol)
DCM (dode cel Marker) - -/ U.V. - 450/50 UV 1:500

Tabel 1: antilichaam technieken voor stroom cytometry. Fluorophore-geconjugeerde antilichaam klonen gebruikt en aanbevolen kleuring van concentraties (2 x).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Moderne vaccins zijn ideaal composedof gezuiverd antigeen en hulpstoffen, met de mogelijke toevoeging van een levering systeem zoals liposomen, virusachtige deeltjes, nanodeeltjes of live vectoren. Een belangrijk aspect bij het ontwerpen van een vaccin is om te kiezen van de juiste adjuvans volgens de klinische behoeften. Deel van het toepassingsgebied zou kunnen inhouden ten gunste van een humorale vs. cellulaire immuunrespons (of beide), de verkiezing van een lokale vs. een systemische immuunrespons (of beide) en het soort geheugen dat het vaccin moet genereren in de doelpopulatie. Een cruciaal aspect van adjuvante evaluatie is het snel bepalen de capaciteit voor het genereren van CTL. Wij hier een methode gebaseerd op reeds bekende technieken, om snel de functies van de CTL reactie in vivo in een muismodel door het meten van OT gepresenteerd-ik CD8 T cel proliferatie. Deze methode zorgt voor de voorspelling van de potentie van de immuunrespons ontlokte door hulpstoffen (verspreiding van OT-ik T cellen) in slechts 4 werkdagen. Deze methode verder vergemakkelijkt de vergelijking van de acties van hulpstoffen in termen van de immuunrespons (lokaal vs. systemische) en zijn doeltreffende optreden. Hier hebben we een voorbeeld toonde hoe immunisatie met verschillende adjuvante behandelingen (ADJ1 vs. ADJ2) van invloed is op de immuunrespons. Het optreden van ADJ2 was beperkt tot het lokale gebied van administratie, waar het activeert de immuunrespons in de zuig lymfeknopen, terwijl het optreden van ADJ1 met de dezelfde dosis meer wijdverspreid was, het genereren van een CTL reactie zowel op de lokale en systemische niveau maar met minder potentie dan ADJ2 in de zuig lymfeknopen.

Kritische stappen voor de succesvolle evaluatie van een adjuvans van CTL capaciteit zijn de keuze van jonge OT-ik dieren (als een bron van CD8 T-cellen) en het gebruik van eicellen endotoxine-gratis voor immunisatie. Sinds de OT-ik muizen zijn transgene dieren gegenereerd voor de productie van CD8 T-cellen die eicellen peptide SIINFEKL in een MHC herkent-ik context, zijn kunstmatige selectie van de muis TCR verhoogt de verschijningen van hyper proliferatieve CD8+ T cellen20 met de leeftijd. Een ontsteking van de oksellymfeklieren is dus een meer gemeenschappelijk kenmerk van leeftijd OT-ik muizen. Dit in aanmerking genomen, is het aanbevolen om gebruik van jonge OT-ik dieren indien mogelijk (6-9-week-oude dieren) en om te voorkomen dat het isoleren van cellen uit een uitgebreide organen (beide milt van lymfeklieren). Het gebruik van uitgebreide organen met delende CD8 T-cellen, zal dit gevolgen hebben voor de hele bepaling aangezien meest waarschijnlijke verschillen in verspreiding tussen besturingselementen en behandelingen zal niet worden verkregen. Een soortgelijke valkuil voor de discriminatie van adjuvante CTL productiecapaciteit kan worden gegenereerd met behulp van eicellen eiwit met sporen van endotoxinen, die een meer potente immuunrespons ten opzichte van endotoxinen-vrije eicellen21,22 (Zie kan uitlokken Materialen en reagentia), aangezien endotoxines sterke immuno-modulatoren per se 23. Daarom moet de proteïne van de eicellen gebruikt voor immunisatie endotoxine-gratis. Het gebruik van eicellen endotoxine-vrije 20 of 50 µg is afhankelijk van de route van de immunisatie wordt 50 µg een geschikte dosis voor subcutane testen van hulpstoffen. Bovendien is het gebruik van hoge concentraties van CFSE is gemeld in de literatuur te doden de gekleurde cellen24 en kan ook leiden tot het falen van de bepaling.

Sommige wijzigingen of verbeteringen in verschillende technieken gebruikt in het protocol werden ondernomen ter vermindering van de stress van de dieren, te verhogen van de reproduceerbaarheid van de experimenten. Bijvoorbeeld gerelateerde om te minimaliseren van het verwarmen van dieren door enkel verwarming van de rug en de staart van de muizen en niet het hele dier, of om te voorkomen dat de subcutane injectie stress door het anesthetizing van de dieren vóór vaccinatie. De narcose is niet verplicht door het welzijn van dieren verordeningen voor een subcutane injectie, maar in onze ervaring, het reproduceerbaarheid verbetert door het verlagen van de veranderingen die zijn aangebracht door de stressrespons.

Een grote beperking van deze methode is dat sinds CFSE het membraan van cellen vlekken, zijn hoge helderheid meestal de detectie van de signalen van het cytosol schaadt. Daarom, als de bevestiging van CTL capaciteit nodig is, de secretie van IFN-γ moet worden geëvalueerd door een specifieke secretie assay 25, en niet door intracellulaire cytokine kleuring.

Het gebruik van de meting van de proliferatie te schatten van het productievermogen CTL door hulpstoffen in slechts 4 dagen heeft het voordeel van kortere tijd nodig dan traditionele CTL26 testen en het is een goede toekomstige experimenteren in het geval waar verdere bevestiging door andere methoden is nodig.

Hoewel beperkt tot eicellen als een antigeen, en dus het gebruik van OT-ik T cellen, de methode gepresenteerd hier kunnen de studie van de eigenschappen van de activering geïnduceerd door verschillende hulpstoffen na het sorteren van de verspreide cellen. Een van de mogelijke toepassingen is de studie van de metabole handtekeningen geïnduceerd door verschillende hulpstoffen in de verspreide OT-ik T cellen en de relaties met de ontwikkeling van geheugen27. Extra secundaire vertoningen kunt het evalueren van de biologische eigenschappen van de gestimuleerd cellen, zoals de expressie van cytokines degranulatie markeringen door stroom cytometry of hun cytotoxische capaciteit door het uitvoeren van in vivo CTL proeven8, 26 , 28. Aangezien deze toepassing de beperking van het gebruik ervan in muizen heeft, kunnen extrapolaties op de mens plaatsvinden door benutten vertoningen op basis van gehumaniseerd muizen29,30,31.

Deze methode is zoals wij hier hebben ingediend robuust genoeg om te worden gebruikt als een eerste screening voor de selectie van cellulaire respons activators en ook flexibel genoeg om te worden bewerkt of gekoppeld aan een nadere analyse van de verspreide T-cellen. Kortom is deze snelle in vivo beoordeling van adjuvante CTL opwekkingscapaciteit een ideaal hulpmiddel voor vaccin laboratoria in de academische wereld en de industrie die geïnteresseerd zijn in een snelle karakterisering van het werkingsmechanisme van hun adjuvans kandidaat-moleculen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We zijn dank verschuldigd aan onze technische medewerkers: U. Bröder en H. Shkarlet, die ons hebben geholpen tijdens de experimentele procedures. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door subsidies van de EU (UniVax, het contract nr. 601738 en TRANSVAC2, contract nr. 730964) en een subsidie van Helmholtz Association (HAI-IDR). Het onderzoek heeft geen invloed op de financieringsbronnen ontwerpt, generatie van het manuscript of de beslissing tot indient voor publicatie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer BD Special Order Flow Cytometer
CFSE Molecular Probes C34554 Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit Biolegend 480007 Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Molecular Probes L23105 Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 eBioscience 25-0900-82 antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100712 antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 BD 740007 antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer Beckman Coulter 9914591DA Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) Hyglos(Germany) 321000 Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon Corning 352360 Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials Beckman Coulter 899366014 Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2) Harlan (Rossdorf, Germany) Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) Harlan (Rossdorf, Germany) Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes Fischer (Corning) 14-959-5 Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes Fischer (Corning) 05-527-90 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL) Fischer (Gibco) 20-012-027 Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp) Dirk Rossmann GmbH (Germany) 405096 Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane) Abbott Laboratories (USA) 5260.04-05. Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber Parkland Scientific V3000PK Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium Gibco (distributed by ThermoFischer) 11-875-093 Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 15-140-148 Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 10082147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml) Gibco (distributed by ThermoFischer) A1049201 Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes Nunc (distributed by ThermoFischer) 150340 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter CellTrics (Sysmex) 04-004-2317 CellTrics® 50 μm, sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
  2. Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
  3. Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
  4. Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
  5. Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
  6. Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
  7. Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
  8. Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
  9. Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
  10. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  11. Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
  12. Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
  13. Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
  14. Otto, K. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 555-569 (2004).
  15. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (2016).
  16. Shimizu, S. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 527-542 (2004).
  17. Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
  18. Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).
  19. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
  20. Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
  21. Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
  22. Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. L54-L63 (2012).
  23. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
  24. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. 79-85 (2009).
  25. Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
  26. Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
  27. O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
  28. Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
  29. Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
  30. Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
  31. Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
Snelle <em>In Vivo</em> beoordeling van adjuvante van cytotoxische T-lymfocyten de mogelijkheden van de generatie voor vaccinontwikkeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).More

Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter